Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

Summary

이 비디오에서는, 우리는 마우스 blastocysts의 고립과 blastocysts에서 trophoblast의 줄기 세포의 유도를 보여줍니다. 우리는 또한 줄기 세포 속성의 유지 보수뿐만 아니라 문화에 분화의 유도에 대한 조건을 설명합니다.

Abstract

trophectoderm의 사양은 포유류의 발전의 초기 분화 행사 중 하나입니다. trophectoderm의 mediates 주입에서 파생된 및 trophoblast의 일족이 태반의 태아 부분을 생성합니다. 결과적으로,이 혈통의 개발은 배아 생존을 위해 필수적입니다. 마우스 blastocysts에서 trophoblast 줄기 (TS) 세포의 유도 먼저 다나카에 의해 설명되었다

Protocol

이 프로토콜에서는, 우리는 마우스 blastocysts의 준비와 TS 세포 라인의 설립에 대해 설명합니다. 이전 자연 교배에 설정하고 슈퍼 배란의 유도를 포함 blastocysts의 수집, 일반적인 마우스 조작은 기본적으로 나지 외 의해 설명된 표준 프로토콜을 따르십시오. 2003 (pp146 - 150).

TS 세포의 유도 및 유지 보수

1. 관심 마우스 사이에 설치 사육 크로스.
2. 피더 세포로 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 준비합니다. 이틀 blastocysts의 수집 전에 MEFs는 (2 × 10 ⁶ 세포) 100mm 요리 도금입니다. 그 다음날, 이들 세포는 37 2 1 시간 배양을위한 ° C, 5 % CO ₂ mitomycin C (20 MG / ML)이있는 TS 매체의 10 ML로 취급됩니다. 이것은 PBS로 두 번 세포를 세척옵니다. mitomycin C 처리 전지는 다음 12 잘 접시 (1 X 10 ⁵ 셀 / 음)에 씨앗을 품고 있습니다.
3. blastocyst 수집 (3.5 DPC, 첫날이라 함)의 날, MEF 문화 매체는 TS 중간 플러스 1X FGF4/Heparin (0.5 ML / 음)으로 대체됩니다.
4. 자궁 수집 준비 : 마우스를 안락사와 자궁 (그림 1A)을 찾습니다.
5. 자궁 경부 (방광 뒤에 위치)에서 집게로 쥐고하여 자궁을 제거하고 자궁 및 자궁 경부 (그림 1B)의 교차점을 가로질러. 자궁을 당겨, 멀리 멤브레인 지방 조직을 장식하고 수란관 (그림 1C)와 접합 아래 자궁 잘라. 60mm 판에서 TS 매체의 작은 볼륨 (0.2 ML)의 uteri (그림 1D)를 놓으십시오.
6. 26 게이지 바늘로 1 - ML 주사기를 사용하여 TS 매체 1 ML 각 자궁 경적을 플러시. 자궁의 기본에 바늘을 삽입하고 1 ML의 TS 매체와 새로운 60mm 판으로 천천히 플러시. 자궁이 비정상적으로 증가하고 내리는 동안 완벽하게 확장해야합니다.
7. 수집하고 입 제어 피펫을 사용하여 TS 매체를 포함하는 깨끗한 접시에 12 잘 신중하게 blastocysts을 전송. 12 잘 접시에 TS 매체를 통해 직렬 전송으로 blastocysts 세 번 씻으십시오. 37 mitomycin C - 대우 MEF 모이통과 문화를 포함하는 12 잘 플레이트에 잘마다 놓으 blastocyst (그림 2A) ° C, 5 % CO _2.
8. blastocysts은 조나 pellucida에서 부화하고 24~36시간에있는 우물에 연결합니다. 작은 가지는 쉽게 일 3 관찰됩니다. 500 μl 신선한 TS 매체 플러스 1X FGF4/Heparin과 문화를 피드.
9. 4 ~ 5 일에, blastocyst의 가지는 크기에 따라 disaggregation 준비되어야합니다. TS 세포 disaggregation에 대한 이상적인 크기는 그림 3B의 그림입니다. 0.5 ML PBS로 한 문화를 씻으십시오. 37 오분 ° C, 5 % CO ₂ 100 ML 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화를 추가합니다. P100의 pipetteman과 함께 적극적으로하고 아래로 pipetting하여 작은 대단히 짧은 시간에 가지 봐라. 잘으로 TS - 70CM - 1.5F4H (30 % TS 매체 70 % MEF - CM 플러스 1.5x FGF4/Heparin)을 추가하여 trypsinization를 중지합니다. disaggregation 후 중간 8 시간 변경하고 모든 이일 세포를 먹이로 진행합니다.
10. 일 6 10 (매우 변수) 사이 TS 세포 식민지가 볼 수 있습니다. 그들은 명확한 콜로니 경계 (그림 2C)와 형태와 같은 평면, 상피 시트 수 있습니다. 매 2 일 문화 먹이를 계속
11. TS 세포가 50 % confluency (대개 일 15 20 사이)에 도달하면, PBS로 한번 씻어 100 ML 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다. 가까운 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 trypsinization 동안 아래 피펫. mitomycin C - 대우 MEF 모이통 (2.5 X 10 ⁵ cells/6-well 또는 5 X10 ⁵ cells/60mm 플레이트) 포함하는 6 자 또는 60mm 판에서 새로 만들기를 TS - 70CM - 1.5F4H 및 전송을 추가하여 trypsinization를 중지합니다.
12. 통로 중간 이후 8 시간 변경 2 일 모든 문화 먹이를 계속합니다.
13. MEF 모이통에 하나 또는 두 개 더 구절 (구절 사이 3-5일) 후, TS 세포는 그들없이 교양 수 있습니다. MEFs 훨씬 빠른 trypsinization 후 TS 세포보다 문화 판에 연결되기 때문에, 자기편 요금 이러한 차이는 MEF 모이통에서 TS 세포를 분리하기 위해 이용하실 수 있습니다. 교양 세포를 통과 후, ° C, 5 % CO ₂ 30 분 37 그들을 품어. 대부분의 MEFs는 판에 연결되며 TS 인구는 현탁액에 남아 있습니다. 새 접시에 뜨는를 전송합니다. 순수한 TS 인구를 얻기 위해 몇 구절이 과정을 반복합니다.
14. TS - 70CM - 1.5F4H에서 TS 세포를 유지하고 모든 사일을 패스 (1시 10분에서 1시 20분까지 분할) 또는 때 문화의 70 % confluency에 도달합니다. 고밀도 (1시 5분 분할 이상) 또는 culturing을 지나치게 합류들이 차별의 원인이 될 수있는 세포가 나온다.
15. TS 세포의 신분은 세포 마커, Cdx2 (그림 3) immunostaining으로 확인하실 수 있습니다.

냉동 TS 세포

1. 냉동 중간 (50 % FBS, 30 % TS 매체 20 % DMSO)를 2 배 준비합니다.
2. 공동trypsinization로 llect의 TS 세포는, 6 분 450g에서 원심 분리하여 따라갔다. 2X 동결 매체의 동일한 볼륨 TS 매체에서 그들을 Resuspend.
3. 천천히 -70에서 이소 프로필 알코올 챔버를 사용하여 세포를 고정 ° C와 24-48시간 후 액체 질소로 전송할 수 있습니다.
4. 60mm 판 (합류 70 %) 보통 2 유리병에 보관됩니다.

TS 세포를 해동

1. 신속하게 37 병을 해동 ° C는 (450g, 6 분) 원심 분리 10 ML TS 미디어에서 그들을 수집, 30 % TS 미디어, 70CM - 1.5F4H에 resuspend.
2. 세포 중 하나 유리병은 60mm 판에 씨앗을 품고있다.

TGC에 TS 세포 분화

trophoblast 거대 세포 (TGCs)에 TS 세포의 분화는 MEF - CM, FGF4 및 헤파린의 철수에 의해 유도된 수 있습니다. TGC 표현형은 (대형 핵) 4 일 유도 후에 감지된 수 있습니다 (다나카 외., 1998 애기 외. 2008). p450scc의 Immunostaining 것은 차별화된 문화에 TGC 마커 (그림 4A)의 표현을 감지합니다. PI의 흐름 cytometric 분석 (propidium 요오드화물의) 스테인드 세포가 더 높은 DNA 내용 (그림 4B)이있는 차별화된 세포의 존재를 보여줍니다. 이러한 결과는 TS 세포가 polyploid TGCs 될 endoreduplication를 받아야하는 것이 좋습니다.

대표 결과

그림 1. 마우스 uteri의 해부. (A) uteri의 위치는 화살표로 표시됩니다. 그림과 같이 (B) 자궁 및 자궁 경부의 교차점을 가로질러. (C) 그냥 난소 (OV) 아래 수란관 (OD) 아래 자궁을 잘라요. uteri의 (D) 이미지.

그림 2. 대표 사진 마우스 blastocyst, blastocyst의 파생물 및 trophoblast들의 서식지를 보여줍니다. (A) E3.5에서 수집된 마우스 blastocyst가 표시됩니다. ICM, 내부 세포 덩어리, MT, 뮤럴 trophectoderm, PT, 북극 trophectoderm. (B) MEF 모이통에 trophoblast의 파생물이 표시됩니다. TS, trophoblast의 줄기 세포. (C) trophoblast의 줄기 세포 콜로니는 MEF 모이통에 명확한 가장자리를 보여줍니다. 화살표는 셀 경계를 나타냅니다.

그림 3. 분석을 immunostaining하여 TS 세포의 식별. TS (AD)과 ES (제어, EH) 세포 마커의 식별이 적용됩니다. 전지는 Oct4 (A, E) 또는 Cdx2 (B, F)을 인식하는 항체와 immunostained하고, 통합 이미지를 제공 DAPI (C, G) (D, H)에 의해 counterstained 있습니다. 스케일 바, 50 μm의.

그림 4. 체외에서 TS 세포의 분화. (A) 문화에 Undifferentiated (Undiff) 또는 차별 (비교) 세포가 TGC 마커의 표현에 대해 검사했다, p450scc (녹색), DAPI (빨간색)와 counterstained. (B) PI 물들일 차별화된 세포의 흐름 cytometric 분석은 DNA의 내용을 (; M2, 개 이상 사본 M1, 2-4 부) 측정합니다. M2 인구 polyploid trophoblast 세포를 나타냅니다.

Discussion

이 비디오에서는, 우리는 프로세스가 TS 세포 라인을 확립 uteri와 실험 절차에서 E3.5 blastocysts를 수집 보여줍니다. 또한 TS 세포의 stemness를 유지하고 차별화된 세포에 자신의 차별을 유발하는 조건을 설명합니다. 순수 TS 세포 라인을 얻기 위해 두 가지 중요한 단계는 가지의 disaggregation에 대한 타이밍 (9 단계)이며, 첫 번째 통로 (11 단계)를 처리. 그것은 광범위한 blastocyst 단계 11 (Kunath 외., 2005)에 TS 식민지의 9 단계 또는 전면에 자라난 (> 50 % confluency)에서 자라다 후 원시 endoderm - 파생 세포 문화에 발생할 수있는 것으로보고되었습니다. 원시 endoderm - 파생 세포가 TS 세포에 비해 둥근 세포 모양과 감소 세포 - 세포 접촉 자신의 독특한 형태로 확인할 수 있지만 그들은 TS 매체에서 잘 성장하고하지 않기 때문에, 그것은 문화에서 그들을 제거하기가 어렵습니다 MEF 모이통 또는 FGF4을 필요로하는 것 같습니다.

차별 TGCs도 MEF - CM과 FGF4의 존재에 TS의 문화에 지속적으로 발생할 수 있습니다. 순수한 TS 인구가 원하는 경우, 이러한 차별화된 세포는 차동 자기편 가격에 기초하여 분리 수 있습니다. MEFs 마찬가지로, TGCs은 단계 13에 설명된 순수 TS 인구를 얻기위한 가능한 절차를 제공하고, 빠른 TS 세포보다 문화 접시에 첨부합니다. TGCs 높은 자기편과 trypsinization 더 강한 때문에 또는, 순수한 TS 인구도 정지 TS 세포를 수집하여 다음 빠른 trypisinization (3 분)에 의해 얻을 수 있습니다.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).