胚盤胞からマウス栄養膜幹細胞の導出

Summary

このビデオでは、我々はマウス胚盤胞と胚盤胞から栄養膜幹細胞の派生の分離を示しています。我々はまた、幹細胞のプロパティのメンテナンスだけでなく、文化の分化誘導のための条件について説明します。

Abstract

栄養外胚葉の仕様は、哺乳類の発生の最も初期の分化のイベントの一つです。栄養外胚葉を仲介移植から派生し、絨毛の系統は、胎盤の胎児の一部を生成します。その結果、この系統の開発は、胚の生存に必須です。マウスの胚盤胞から栄養膜幹細胞（TS細胞）の導出は、最初に田中によって記述されていた

Protocol

このプロトコルでは、我々はマウス胚盤胞とTS細胞の樹立の準備について説明します。自然交配と超排卵の誘導のために設定を含む事前の胚盤胞のコレクションへの一般的なマウス操作では、、基本的にはナギらによって示される標準のプロトコルに従ってください。2003（pp146 - 150）。

TS細胞の派生とメンテナンス

1. 興味のマウスとの間のセットアップの繁殖クロス。
2. フィーダー細胞としてマウス胚性繊維芽細胞（MEF）を準備する。二日胚盤胞の集合前に、MEFのは（2 × 10 ⁶細胞）は、100 mmディッシュに播種されています。翌日は、これらの細胞は37℃で2時間のインキュベーションのためにマイトマイシンC（20 mg / mL）を含む° C、5％CO _2の TSの培地10mlで処理されています。これは、PBSで細胞を2回洗浄することによって続いている。マイトマイシンC処理した細胞を12ウェルプレート（1 × 10 ⁵細胞/ウェル）に播種されています。
3. 胚盤胞のコレクション（3.5 DPC、初日と呼ばれる）の日に、MEFの培地は、TS培地に加えて倍速FGF4/Heparin液（0.5ml /ウェル）に置き換えられます。
4. 子宮のコレクションのための準備：マウスを安楽死させると子宮（図1A）を探します。
5. 子宮頸部（膀胱の後ろにある）で、ピンセットでそれを把握し、子宮を取り出して、子宮と子宮頸部（図1B）の接合間にカット。子宮を引っ張って、膜と脂肪組織を切り落とすと卵管との接合（図1C）下子宮をカット。 60 mmのプレート内のTS培地の少量（0.2 ml）に子宮（図1D）を配置します。
6. 26ゲージの針で1mlのシリンジを使用してTS培地1mlでそれぞれの子宮の角をフラッシュします。子宮の底に針を挿入し、1 mlのTS培地で新しい60 mmのプレートにゆっくりと洗い流してください。子宮が膨張し、フラッシング中に完全に拡張する必要があります。
7. 口制御ピペットを使用してTSの培地を含むクリーンな12ウェルプレートに慎重胚盤胞を収集して転送する。 12ウェルプレートでTS媒体を介してシリアル転送で胚盤胞を3回洗浄する。 37マイトマイシンC処理MEFフィーダーや文化を含む° C、5％CO _2を 12ウェルプレートにウェル当たり片足胚盤胞（図2A）。
8. 胚盤胞は透明帯から孵化し、24〜36時間でウェルにアタッチされます。小さな突起は容易に3日目に観察される。 500μlの新鮮なTSの培地に加え、1 × FGF4/Heparinと文化を養う。
9. 4または5日目に、胚盤胞の伸長は、そのサイズに応じて分解するための準備ができているはずです。 TSの細胞解離のための理想的なサイズは、図3Bに示されています。 0.5mlのPBSで一回の文化を洗ってください。 37℃で5分間、100ミリリットル0.25％トリプシン/ EDTAとインキュベートする° C、5％CO _2を 。 P100のpipettemanと激しく上下にピペッティングして小さな塊に伸長を破る。井戸に（30％のTS培地、70％MEF - CMプラス1.5 FGF4/Heparin）TS - 70CM - 1.5F4Hを追加することによって、トリプシン処理を停止します。 8時間分解した後、培地を変更し、2日毎に細胞を供給し続けます。
10. 日間で6と10（高度に可変）TS細胞のコロニーを観察することができます。彼らは明確なコロニーの境界（図2C）との形態のような平らな、上皮シートを持っている。 2日毎に培養液を供給し続ける
11. TS細胞がコンフルエント50％（通常は日15〜20の間）に到達すると、PBSで1回洗浄し、100ml 0.25％トリプシン/ EDTAを加える。近い単一細胞懸濁液を確実にするためにトリプシン処理中に上下にピペッティング。 TS - 70CM - 1.5F4HとマイトマイシンC処理したMEFフィーダー（2.5 × 10 ⁵ cells/6-wellまたは5 × 10 ⁵ cells/60mmプレート）を含む新たな6穴または60ミリメートルプレートへの転送を追加することにより、トリプシン処理を停止します。
12. 8時間経過後に培地を変更し、2日毎に培養液を供給し続けます。
13. MEFフィーダー上に1つまたは2つ以上の通路（通路の間に3〜5日）した後、TSの細胞はそれらなしで培養することができる。 MEFのは、はるかに高速にトリプシン処理後のTS細胞より培養皿に付着するので、接着速度でそのような違いは、MEFフィーダーからTS細胞を分離するために利用することができます。培養細胞を通過した後、° C、5％CO ₂で30分間37℃、それらをインキュベートする。ほとんどのMEFはプレートに付着し、TSの人口は、懸濁液中に残ります。新しいプレートに上清を移す。純粋なTSの人口を取得するには、いくつかの文章について、この手順を繰り返します。
14. TS - 70CM - 1.5F4HにTS細胞を維持し、4日ごとに渡す（1:10〜1:20の分割）や、文化が70％コンフルエントに達する。高密度（1:5分割よりも高い）または培養することを過度に合流、その分化を引き起こす可能性のある細胞を渡す。
15. TS細胞の同一性は、細胞マーカー、Cdx2の（図3）の免疫染色によって確認することができます。

凍結TS細胞

1. 凍結培地（50％FBS、30％のTS培地および20％DMSO）を2倍用意してください。
2. 共同トリプシン処理によってllectのTS細胞は、6分の場合は450gで遠心分離した。 2倍速凍結培地の等量でTS培地に再懸濁します。
3. 徐々に-70℃でイソプロピルアルコールチャンバーを用いて細胞を凍結℃、24〜48時間後に液体窒素への転送。
4. 60 mmのプレート（コンフルエント70％）通常2バイアルに保存されています。

TS細胞を融解

1. すぐに37バイアルを解凍° Cは、（450グラム、6分）遠心して10ミリリットルTSのメディアでそれらを収集し、そして30％TSメディア、70CM - 1.5F4Hに再懸濁します。
2. 細胞の1バイアルを60 mmのプレートに播種されています。

TGCにTS細胞の分化

栄養膜巨細胞（TGCs）にTS細胞の分化は、MEF - CM、FGF4とヘパリンの撤退により誘導され得る。 TGC表現型は（大核）は4日間の誘導後に検出することができる（田中ら、1998とチウら 2008）。 p450sccの免疫染色は、差別化された文化の中でこのTGCマーカー（図4A）の発現を検出する。 PI（ヨウ化プロピジウム）染色された細胞のフローサイトメトリー分析は、さらに高いDNA含量（図4B）を含む分化した細胞の存在を示しています。これらの結果は、TS細胞が倍数体TGCsになるために核内倍加を受けることを示唆している。

代表的な結果

図1マウスの子宮の解剖。 （A）子宮の位置は矢印で示されます。に示すように（B）子宮および子宮頸部の接合間にカット。 （C）だけで卵巣（OV）の下に卵管（外径）以下の子宮をカット。子宮の（D）イメージ。

図2代表的な写真は、マウスの胚盤胞、胚盤胞の伸長や栄養膜のコロニーを示しています。 （A）E3.5で収集されたマウスの胚盤胞が表示されます。 ICM、内部細胞塊、MT、壁画の栄養外胚葉、PT、極性の栄養外胚葉。 （B）MEFフィーダー上に栄養膜伸長が表示されます。 TS、栄養膜幹細胞。 （C）栄養膜幹細胞のコロニーは、MEFフィーダー上に明確なエッジを示しています。矢印は、セル境界を示している。

図3解析を免疫染色によりTS細胞の同定。 TS（AD）とES（制御、EH）の細胞は、マーカーの同定の対象となります。細胞は、Oct4の（A、E）またはCdx2の（B、F）を認識する抗体で免疫染色し、マージされた画像で提示DAPI（C、G）（D、H）によって対比されています。スケールバーは50μm。

図4 in vitroでのTS細胞の分化。 （A）未分化（Undiff）または差別化（差分）細胞培養においては、TGCのマーカーの発現について調べたところ、p450scc（緑）、DAPI（赤）で対比。 （B）PIで染色された分化した細胞のフローサイトメトリー分析は、DNAの内容を（; M2、以上の4つのコピーM1、2〜4枚）を測定します。 M2の人口は、倍数体栄養膜細胞を表しています。

Discussion

このビデオでは、我々は、TS細胞株を確立するために子宮や実験手順からE3.5胚盤胞を収集するプロセスを示しています。我々はまた、TS細胞のstemnessを維持し、分化した細胞への分化を誘導する条件について説明します。純粋なTS細胞株を取得する2つの重要なステップは、伸長の分解のためのタイミング（手順9）と初通過（ステップ11）処理です。それは、大規模な胚盤胞は、手順9または手順11でTSのコロニー（> 50％コンフルエント）（Kunathら、2005）の繁茂に脱却した後、原始内胚葉由来の細胞が培養で生じることが報告されている。原始内胚葉由来の細胞は丸みを帯びた細胞の形状やTS細胞と比較して減少した細胞間接触を持つ彼らの独特の形態によって識別することができますが、彼らはTSの培地でよく育つとしないので、それは文化からそれらを除去することは困難です。 MEFフィーダーまたはFGF4を必要とするように思われる。

差別TGCsもMEF - CMとFGF4の存在下でTSの文化の中で絶えず発生する可能性があります。純粋なTSの人口を希望する場合は、これらの分化細胞は、差動付着率に基づいて分離されることがあります。 MEFのと同様に、TGCsは手順13で説明したように純粋なTSの人口を取得することができる手順を提供し、より高速なTS細胞より培養プレートに取り付けます。 TGCが非常に付着し、トリプシン処理に対してより耐性があるので別の方法として、、純粋なTSの人口は、中断TS細胞の集まりが続くクイックtrypisinization（3分）、によって得ることができる。

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).