Summary
في هذا الفيديو ، ونظهر عزلة blastocysts الماوس واشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية blastocysts. وصفنا أيضا الظروف الملائمة لصيانة الممتلكات الخلايا الجذعية ، وكذلك الحث التمايز في الثقافة.
Abstract
مواصفات الأديم الظاهر الغاذي هي واحدة من أقرب الأحداث تمايز التنمية الثدييات. نسب الأرومة الغاذية المستمدة من الأديم الظاهر الغاذي يتوسط الزرع ويولد الجنين جزء من المشيمة. نتيجة لذلك ، تطور هذه النسب ضرورية لبقاء الجنين. وكان أول وصف اشتقاق خلايا الأرومة الغاذية (TS) تنبع من blastocysts الماوس بواسطة تاناكا
Protocol
في هذا البروتوكول ، ونحن تصف إعداد blastocysts الماوس وإنشاء خطوط الخلايا TS. التلاعب الماوس قبل عام لجمع blastocysts ، بما في ذلك إعداد لالتزاوج الطبيعي وتحريض الاباضة عظمى ، اتبع أساسا بروتوكول قياسي يتضح من ناجي وآخرون 2003 (pp146 - 150).
الاشتقاق وصيانة خلايا TS
- الإعداد عبر تكاثر الفئران بين المصالح.
- تحضير الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) والخلايا المغذية. قبل يومين من جمع blastocysts ، MEFs (2 × 10 6 خلايا) في 100 ومطلي الأطباق ملم. اليوم التالي ، ويتم التعامل مع هذه الخلايا مع 10 مل من المتوسط TS تحتوي mitomycin C (20 ملغ / مل) للحصول على حضانة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. ويتبع ذلك عن طريق غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. هي المصنفة C ثم mitomycin الخلايا المعالجة في 12 - جيدا لوحات (1 × 10 5 خلية / جيد).
- يوم جمع الكيسة (3.5 DPC ، ويشار إلى يوم واحد) ، يتم استبدال MEF مستنبت بواسطة المتوسطة TS زائد 1X FGF4/Heparin (0.5 مل / جيد).
- التحضير لجمع الرحم : الموت ببطء الماوس وحدد موقع الرحم (الشكل 1A).
- إزالة الرحم بواسطة ملقط مع الامساك بها في عنق الرحم (تقع خلف المثانة) وخفض عبر تقاطع الرحم وعنق الرحم (1B الشكل). سحب الرحم ، وتقليم الغشاء والأنسجة الدهنية بعيدا وقطع الرحم دون تقاطع مع قناة البيض (الشكل 1C). وضع الرحم (1D الشكل) في حجم صغير (0.2 مل) من المتوسط TS في لوحة 60 ملم.
- مطاردة كل قرن الرحم مع 1 مل من المتوسط TS باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة قياس 26. ادخال الإبرة في قاعدة الرحم وتدفق ببطء في لوحة جديدة عيار 60 ملم مع 1 مل TS المتوسطة. وينبغي أن يكون مبالغا الرحم ومددت بالكامل خلال التنظيف.
- جمع ونقل blastocysts بعناية في 12 لوحة تحتوي على تنظيف جيد TS المتوسطة باستخدام ماصة الفم التي تسيطر عليها. غسل blastocysts ثلاث مرات عن طريق التحويل من خلال المسلسل المتوسطة في 12 - TS جيدا لوحات. الكيسة مكان واحد لكل بئر (الشكل 2A) في صفيحة ال 12 كذلك يحتوي على mitomycin C - تعامل مغذيات MEF والثقافة في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2.
- سوف blastocysts يفقس من زونا الشفافة ونعلق على الآبار في 24 إلى 36 ساعة. سيكون ثمرة صغيرة وحظ بسهولة في اليوم 3. تغذية الثقافات مع 500 ميكرولتر المتوسطة TS الطازجة بالإضافة إلى FGF4/Heparin 1X.
- في يوم 4 أو 5 ، ينبغي أن ثمرة الكيسة يكون جاهزا للتصنيف تبعا لحجمها. ويتضح حجم مثالي للخلية تصنيفها TS 3B في الشكل. يغسل مرة واحدة مع الثقافات PBS مل 0.5. إضافة 100 مل 0.25 ٪ التربسين / EDTA واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. كسر ثمرة الى كتل صغيرة pipetting صعودا وهبوطا بقوة مع pipetteman P100. وقف trypsinization بإضافة TS - 70CM - 1.5F4H (TS المتوسطة 30 ٪ ، 70 ٪ زائد MEF - CM FGF4/Heparin 1.5x) في البئر. تغيير المتوسط 8 ساعات بعد تصنيفها والاستمرار في تغذية الخلايا كل يوم 2.
- يمكن بين 6 و 10 يوما (متغير جدا) يمكن الملاحظة مستعمرات الخلايا TS. لديهم شقة ، ورقة الظهارية مثل التشكل مع حدود واضحة مستعمرة (الشكل 2C). تواصل الثقافات تغذية كل يوم 2
- عندما تصل الخلايا TS confluency 50 ٪ (عادة ما بين 15 يوما و 20) ، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 100 مل 0.25 ٪ التربسين / EDTA. ماصة صعودا وهبوطا خلال trypsinization لضمان قرب وحيدة الخلية تعليق. وقف trypsinization بإضافة TS - 70CM - 1.5F4H ونقلها إلى لوحات جديدة 6 - 60mm جيدا أو التي تحتوي على mitomycin C - تعامل مغذيات MEF (2.5 × 10 5 أو 5 cells/6-well X10 وحة cells/60mm 5).
- تغيير المتوسطة بعد مرور 8 ساعات ويستمر لإطعام كل الثقافات 2 يوما.
- بعد واحد أو اثنين من أكثر الممرات (3-5 يوما بين الممرات) على مغذيات MEF ، قد تكون الخلايا المستزرعة TS بدونها. لأن MEFs نعلق على لوحة الثقافة أسرع بكثير من الخلايا TS trypsinization بعد ، يمكن أن تستخدم مثل هذه الفرق في معدل ملتصق لفصل الخلايا TS من مغذيات MEF. بعد مرور الخلايا المستزرعة ، احتضان لهم في 37 ° C CO ، 5 2 ٪ لمدة 30 دقيقة. ومعظم MEFs نعلق على لوحة والسكان TS يبقى في التعليق. طاف لنقل لوحة جديدة. كرر هذه العملية عدة مقاطع للحصول على السكان TS النقي.
- الحفاظ على خلايا في TS - TS - 70CM 1.5F4H وتمرير لهم كل يوم 4 (1:10 حتي 1:20 انقسام) أو عندما يصل إلى ثقافة confluency 70 ٪. تمر الخلايا مع كثافة عالية (أعلى من الانقسام 1:5) أو زرع لهم عندما متموجة بشكل مفرط قد يؤدي التمايز بهم.
- ويمكن التأكد من هوية الخلايا التي TS immunostaining من علامة الخلية ، Cdx2 (الشكل 3).
تجميد الخلايا TS
- إعداد 2X تجميد المتوسطة (50 ٪ FBS ، 30 ٪ والمتوسطة TS DMSO 20 ٪).
- شاركالخلايا التي TS llect trypsinization ، تليها الطرد المركزي في 450g لمدة 6 دقائق. Resuspend منهم في المتوسط على قدم المساواة مع حجم TS المتوسطة تجميد 2X.
- تجميد الخلايا باستخدام ببطء وغرفة ايزوبروبيل في -70 درجة مئوية ، ونقل إلى النيتروجين السائل بعد 24-48 ساعة.
- وعادة ما يتم الاحتفاظ صفيحة 60 ملم (70 ٪ متموجة) في 2 قنينة.
ذوبان الخلايا TS
- ذوبان الجليد بسرعة القارورة في 37 درجة مئوية ، وجمعها في 10 مل الإعلام TS بواسطة الطرد المركزي (450g ، 6 دقائق) ، وبنسبة 30 ٪ في resuspend TS وسائل الإعلام ، 70CM - 1.5F4H.
- غير المصنفة قنينة واحدة من الخلايا في لوحة 60 ملم.
TS تمايز الخلايا في TGC
يمكن أن يتسبب تمايز الخلايا إلى خلايا TS العملاقة الأرومة الغاذية (TGCs) من قبل انسحاب MEF - CM ، FGF4 والهيبارين. ويمكن الكشف عن النمط الظاهري TGC (نوى كبير) بعد اربعة ايام من الحث (تاناكا وآخرون ، 1998 وتشيو وآخرون 2008). Immunostaining p450scc من الكشف عن التعبير عن هذه العلامة TGC في ثقافة مختلفة (الشكل 4A). تحليل تدفق cytometric من PI (propidium يوديد) خلايا ملون يظهر كذلك وجود خلايا متمايزة تحتوي على أعلى محتوى الحمض النووي (الشكل 4B). هذه النتائج تشير الى ان خلايا TS تنسخ داخلي يخضع لتصبح TGCs المتعددة الصبغيات.
ممثل النتائج
الشكل 1. تشريح الرحم الماوس. (A) هو مبين في الصورة من الرحم بواسطة الأسهم. (ب) قص عبر تقاطع الرحم وعنق الرحم كما هو مبين. (C) قطع الرحم أسفل قناة البيض (OD) تحت المبيض (OV). (D) صورة للرحم.
صور الممثل الشكل 2. توضيح الكيسة الماوس ، وثمرة الكيسة مستعمرة الأرومة الغاذية. (A) ويرد الكيسة الماوس جمعها في E3.5. ICM ، كتلة الخلية الداخلية ؛ طن متري ، الأديم الظاهر الغاذي جدارية ؛ PT ، الأديم الظاهر الغاذي القطبية. (ب) ويرد على مغذيات ثمرة الأرومة الغاذية MEF. TS ، الأرومة الغاذية الخلايا الجذعية. (ج) والخلايا الجذعية مستعمرة الأرومة الغاذية يظهر واضحا على حافة مغذيات MEF. تشير الأسهم في حدود الخلية.
الشكل 3. تحديد الخلايا التي TS immunostaining التحليل. TS (AD) وفاق (السيطرة ، EH) الخلايا تخضع لتحديد علامة. وimmunostained الخلايا مع أجسام مضادة للاعتراف Oct4 (A ، E) أو Cdx2 (B ، F) ، وcounterstained بواسطة دابي (C ، G) عرضت في الصور المدمجة (D ، H). مقياس بار ، و 50 ميكرومتر.
الشكل 4. تمايز الخلايا في المختبر TS. counterstained p450scc (الأخضر) ، (A) ودرست غير متمايزة (Undiff) أو متمايزة (فرق) والخلايا في الثقافة للتعبير عن علامة TGC ، مع دابي (الحمراء). (ب) تحليل تدفق cytometric من الخلايا المتمايزة ، ملطخة PI والتدابير محتويات الحمض النووي (M1 ، 2-4 النسخ ؛ M2 ، أكثر من أربع نسخ). السكان M2 يمثل خلايا الأرومة الغاذية المتعددة الصبغيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح عملية جمع E3.5 blastocysts من إجراءات الرحم والتجريبية لإنشاء خطوط الخلايا TS. كما وصفنا شرط للحفاظ على الخلايا stemness TS وللحث على التمايز إلى خلايا متمايزة. اثنين من الخطوات الحاسمة للحصول على خطوط خلايا نقي TS هي ثمرة توقيت التفكيك (الخطوة 9) ، وتجهيز مرور الأول (الخطوة 11). وقد أفيد بأن البدائية الأديم الباطن الخلايا المشتقة يمكن أن تنشأ في ثقافة واسعة بعد الكيسة تتفوق في الخطوة 9 أو فرط نمو المستعمرات TS (> 50 ٪ confluency) في الخطوة 11 (Kunath وآخرون ، 2005). على الرغم من أن يمكن التعرف على الأديم الباطن البدائي المستمدة من الخلايا عن طريق التشكل المتميزة مع شكل خلية تقريب وانخفاض خلية الاتصال خلية بالمقارنة مع الخلايا TS ، فمن الصعب إزالتها من ثقافة لأنها تنمو بشكل جيد على المدى المتوسط وليس TS ويبدو أن تتطلب مغذيات أو MEF FGF4.
قد تنشأ باستمرار TGCs متباينة في الثقافة TS حتى في وجود MEF - CM وFGF4. إذا كان المطلوب من السكان TS نقية ، قد يكون فصل هذه الخلايا المتمايزة على أساس معدلات ملتصقة التفاضلية. مشابهة لMEFs ، TGCs نعلق على لوحات ثقافة أسرع من الخلايا TS ، وتوفير الاجراءات الممكنة للحصول على السكان TS نقية كما هو موضح في الخطوة 13. بدلا من ذلك ، لأن TGCs هي ملتصقة جدا وأكثر مقاومة للtrypsinization ، بلغ عدد السكان TS نقية ويمكن أيضا أن يحصل عليها trypisinization السريع (3 دقائق) ، تليها مجموعة من الخلايا TS مع وقف التنفيذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المؤلفان بالشكر جانيت Rossant للبروتوكول الأصلي. وأيد هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للصحة منح CA106308 إلى WH.
Materials
| Reagents | |||
| TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin. |
|||
| Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate. |
|||
| Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent. |
|||
| PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4. |
|||
| FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml). |
|||
| Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml). |
References
- Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &, Hsu, W. SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages. PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).
- Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts. Development. 132, 1649-1661 (2005).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
