鼠标滋养层干细胞从胚泡的推导

Summary

在这段视频中，我们展示了小鼠囊胚的隔离和滋养干细胞从胚泡的推导。我们还介绍了干细胞财产的维护，以及在文化的分化诱导条件。

Abstract

滋养层的规范，是最早的哺乳动物发育分化事件之一。从滋养层介导植入派生和滋养细胞谱系产生胎儿胎盘的一部分。因此，本宗族的发展是必不可少的胚胎存活率。最初是由田中滋养干细胞（TS）从小鼠囊胚细胞的推导

Protocol

在这个协议中，我们描述了小鼠囊胚的编制和TS细胞株的建立。一般的鼠标操作前囊胚的集合，包括设立自然交配和超排卵诱导，基本上是按照标准的协议，由纳吉等人说明。2003年（pp146 - 150）。

Ts细胞的推导和维护

1. 设置之间的利益老鼠繁殖的十字架。
2. 准备作为饲养层细胞的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。前两天收集囊胚，MEFs（2 × 10 ⁶细胞）均镀在100毫米的菜肴。第二天，这些细胞是治疗用10毫升的TS培养基中含有丝裂霉素C（20毫克/毫升）在37℃，5％的_CO 2为2个小时的孵化。其次是用PBS洗涤细胞两次。丝裂霉素C处理的细胞，然后接种于12孔板（1 × 10 ⁵细胞/孔）。
3. 在囊胚收集（3.5 DPC，被称为第一天）一天，MEF培养液取代TS液加1X FGF4/Heparin（0.5毫升/孔）。
4. 制备方法：收集子宫安乐死鼠标，找到子宫（图1A）。
5. 通过抓钳在宫颈（位于膀胱后面）删除子宫和子宫和子宫颈（图1B）交界处的跨越。拉子宫，修剪膜和脂肪组织中，削减低于交界处的子宫输卵管（图1C）。小体积的TS培养基（0.2毫升）在60毫米的钢板放置在子宫（图1D）。
6. 每1毫升的TS使用26号针头的1 ml注射器介质冲洗子宫角。针插入子宫基地，并刷新到一个新的60毫米板1毫升的TS中等缓慢。子宫应在冲洗充分膨胀和扩展。
7. 仔细收集并传输到一个干净的12孔盘包含的TS媒介使用控制口吸管的囊胚。洗净囊胚在12孔板通过TS中期串行传输三次。放置一个囊胚每口井（图2A）在12孔，丝裂霉素C处理的MEF的馈线和文化板块在37 ° _C，5％的CO 2。
8. 囊胚将孵化卵透明带和附加井在24至36小时。一个小的产物将随时观察3天。饲料用500μl新鲜的TS中加1X FGF4/Heparin文化。
9. 在4或5天，胚泡的产物，应该取决于其大小分类。 TS细胞分类的理想大小，如图3b所示。用0.5毫升PBS洗一次的文化。添加100毫升0.25％胰蛋白酶/ EDTA和孵育5分钟，在37 ° C，5％的CO _2。移液器上下同一个P100的pipetteman大力的产物，分解成小团块。停止加入1.5F4H TS - 70CM（30％TS中等，70％的MEF - CM加1.5 FGF4/Heparin）入井胰蛋白酶。更改中等8小时后分解，并继续喂养细胞，每2天。
10. 在6和10（高度可变）天之间，TS细胞克隆可观察到。他们有这样一个明确的殖民地边界（图2C）的形态，地势平坦，上皮表。继续喂的文化，每2天
11. 当Ts细胞达到50％汇合（通常是15和20天之间），用PBS洗一次，加100毫升0.25％胰蛋白酶/ EDTA。移液器在胰蛋白酶的向上和向下，以确保附近的单细胞悬液。停止加入含有丝裂霉素C处理的MEF的馈线（2.5 × ¹⁰ 5 cells/6-well或5 × ¹⁰ 5 cells/60mm板），以新的6孔或60mm板的TS - 70CM - 1.5F4H和转让胰蛋白酶。
12. 更改中等8小时通过后，继续喂文化每2天。
13. 经过一个或两个以上的通道上的MEF馈线之间的通道（3-5天），Ts细胞可培养他们。由于MEFs速度远远高于胰蛋白酶消化后的TS细胞培养板的重视，在贴壁率的这种差异可以利用单独从MEF馈线Ts细胞。通过培养细胞后，在37℃，5％的CO ₂为30分钟。大多数MEFs将附加到该板块的TS人口仍处于悬浮状态。将上清转移至一个新的板块。几个段落重复这一过程中获得一个纯粹的TS人口。
14. 保持TS - 70CM 1.5F4H Ts细胞，并通过他们每4天（1:10至1:20分割）或文化达到70％汇合时。通过高密度（高于1:5分割）或培养他们过于汇合时可能会导致其分化的细胞。
15. Ts细胞的身份可以确认，由一个细胞标记，CDX2（图3）免疫。

冻结Ts细胞

1. 准备2X冻存液（50％FBS，30％的TS中期和20％二甲基亚砜）。
2. 合作胰蛋白酶llect Ts细胞，其次是在450克离心6分钟。 2X冻存液等体积重悬在TS培养基。
3. 冻结的细胞慢慢使用异丙醇室-70 ° C和24-48小时后转移到液氮。
4. 2瓶通常保存在一个60毫米的钢板（70％合流）。

解冻的TS细胞

1. 快速解冻小瓶在37 ° C，收集他们在10毫升的TS媒体离心（450克，6分钟），在30％TS媒体，70CM - 1.5F4H悬浮。
2. 一小瓶细胞接种于60毫米板。

TS细胞分化成TGC

撤出MEF - CM，FGF4和肝素可诱导的Ts细胞分化为滋养层巨细胞（TGCs）。 TGC的表型（大核）可以被检测到四天后感应（Tanaka等人，1998年和 Chiu 等 。，2008年）。 p450scc免疫染色检测TGC这种分化的文化标记（图4A）的表达。流式细胞仪分析PI（碘化丙啶）染色细胞进一步分化的细胞中含有较高的DNA含量（图4B）。这些结果表明，TS细胞内复制，成为多倍体TGCs。

代表性的成果

图1。小鼠子宫剥离。 （一）子宫的位置，用箭头表示。 （二）跨越子宫和宫颈交界处，如图所示。 （三）切子宫略低于下的卵巢（OV）输卵管（OD）。 （四）形象的子宫。

图2。代表图片说明小鼠囊胚，囊胚生长和滋养的殖民地。 （A）在E3.5小鼠囊胚收集所示。 ICM，内细胞团;吨，壁画滋养层; PT，极滋养层。 （B）在MEF馈线滋养产物所示。 TS，滋养干细胞。 （C）滋养层干细胞集落边缘清楚显示了MEF的馈线。箭头指示的单元格边界。

图3。Ts细胞免疫分析鉴定。 TS（公元）和ES（控制，EH）细胞标记鉴定。细胞是免疫染色认识到Oct4的（A，E）或CDX2（B，F）的抗体，由合并后的图像中提出的DAPI（C，G）（D，H）counterstained。比例尺，50微米。

图4。Ts细胞在体外分化。 （一）未分化（Undiff）还是有区别的（DIFF）细胞培养是一个TGC标记的表达研究，p450scc（绿色），counterstained用DAPI（红色）。 （二）流量分化的细胞与PI染色，流式细胞仪分析，措施的DNA含量（货币供应量M1，两到四个副本; M2，超过四份）。 M2人口占多倍体的滋养细胞。

Discussion

在这个视频中，我们展示的过程来收集E3.5从子宫和实验程序的囊胚建立TS细胞株。我们还描述了条件，保持Ts细胞的干性和诱导分化的细胞，其分化。两个关键的步骤，以取得纯TS细胞株的产物分解的时间（步骤9）和加工的第一段（第11步）。据报道，原始内胚层来源的细胞可以在文化产生广泛的囊胚后在第11步（Kunath等人，2005年）在第9步或繁茂的TS殖民地（> 50％汇合），长大了。虽然原始内胚层衍生细胞可以通过一个圆形的细胞形态和降低细胞与细胞接触到TS细胞相比的独特形态，它是很难从文化中删除他们，因为他们在TS培养基生长良好，不似乎需要MEF的馈线或FGF4。

即使在MEF - CM和FGF4不断分化TGCs可能出现在TS文化。如果需要一个纯粹的TS人口，这些分化的细胞可能是差的粘附率的基础上分开。 MEFs，TGCs重视培养板的速度比Ts细胞，提供了一个程序可能获得一个纯粹的TS在第13步中所述的人口。另外，因为TGCs高度壁多抗胰蛋白酶，一个纯粹的TS人口也可能会得到快速trypisinization（3分钟），收集暂停的Ts细胞。

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).