Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

Summary

In deze video, tonen we de isolatie van de muis blastocysten en de afleiding van trofoblast stamcellen uit blastocysten. We beschrijven ook de voorwaarden voor het onderhoud van de stamcel terrein en in de inductie van differentiatie in cultuur.

Abstract

Specificatie van de trophectoderm is een van de eerste differentiatie gebeurtenissen van zoogdieren ontwikkeling. De trofoblast lijn afkomstig van de trophectoderm bemiddelt implantatie en genereert de foetale deel van de placenta. Als gevolg hiervan, de ontwikkeling van deze lijn is van essentieel belang voor de overleving van embryo's. Afleiding van trofoblast stam (TS) cellen van muizen blastocysten werd voor het eerst beschreven door Tanaka

Protocol

In dit protocol beschrijven we de voorbereiding van de muis blastocysten en de vestiging van TS cellijnen. Algemeen muis manipulaties voorafgaand aan het verzamelen van blastocysten, waaronder de instelling voor natuurlijke bevruchting en de inductie van de super ovulatie, in principe volgen de standaard protocol geïllustreerd door Nagy et al.. 2003 (pp146-150).

Afleiding en het onderhoud van de TS-cellen

1. Setup fokken kruising tussen muizen van belang.
2. Bereid je muis embryonale fibroblasten (MEF) als feeder cellen. Twee dagen vóór de verzameling van blastocysten, MEFs (2 x 10 ⁶ cellen) worden uitgeplaat in 100 mm gerechten. De volgende dag worden deze cellen behandeld met 10 ml van TS medium dat mitomycine C (20 mg / ml) voor een 2 uur incubatie bij 37 ° C, 5% CO _2. Dit wordt gevolgd door wassen cellen tweemaal met PBS. De mitomycine C behandelde cellen worden vervolgens gezaaid in 12-well platen (1 x 10 ⁵ cellen / well).
3. Op de dag van de blastocyst collectie (3,5 dpc, aangeduid als een dag), is MEF kweekmedium vervangen door TS medium plus 1x FGF4/Heparin (0,5 ml / putje).
4. De voorbereiding voor de inzameling van de baarmoeder: euthanaseren de muis en zoek de baarmoeder (figuur 1a).
5. Verwijder de baarmoeder door het vast te pakken met een pincet in de baarmoederhals (achter de blaas) en dwars door de kruising van de baarmoeder en baarmoederhals (Figuur 1B). Trek de baarmoeder, weg te trimmen het membraan-en vetweefsel en snijd de baarmoeder onder de kruising met de eileider (Figuur 1C). Plaats de baarmoeders (figuur 1D) in een klein volume (0,2 ml) van TS medium in een 60 mm plaat.
6. Spoel elke baarmoeder hoorn met 1 ml van TS medium met behulp van een 1-ml spuit met een 26-gauge naald. Steek de naald in de basis van de baarmoeder en spoel langzaam in een nieuwe 60 mm plaat met 1 ml TS medium. De baarmoeder moet worden opgeblazen en volledig uitgebreid tijdens het spoelen.
7. Verzamelen en zorgvuldig overdragen van de blastocysten in een schone 12 wells plaat met TS medium met behulp van een mond-gecontroleerde pipet. Was blastocysten drie keer door de seriële overdracht via TS medium in 12-well platen. Plaats een blastocyst per well (figuur 2A) in een 12-wells plaat met de mitomycine C-behandelde MEF feeders en cultuur bij 37 ° C, 5% CO _2.
8. De blastocysten zullen luik van zona pellucida en hechten aan de putten in 24 tot 36 uur. Een kleine uitgroei zal gemakkelijk worden waargenomen op dag 3. Voer de culturen met 500 ul vers medium TS plus 1x FGF4/Heparin.
9. Op dag 4 of 5, moet de blastocyst uitgroei klaar voor disaggregatie afhankelijk van de grootte. De ideale grootte voor TS cel differentiatie wordt geïllustreerd in figuur 3B. Ze wast de culturen met 0,5 ml PBS. Voeg 100 ml 0,25% trypsine / EDTA en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO _2. Breek de uitgroei in kleine groepjes door en neer te pipetteren krachtig met een P100 pipetteman. Stop de behandeling met trypsine door het toevoegen van TS-70CM-1.5F4H (30% TS medium, 70% MEF-CM plus 1,5 x FGF4/Heparin) in de put. Verandering medium 8 uur na de uitsplitsing en blijven cellen te voeden om de 2 dagen.
10. Tussen dag 6 en 10 (zeer variabel) TS cel kolonies kunnen worden waargenomen. Ze hebben platte, epitheliale sheet zoals morfologie met een duidelijke begrenzing kolonie (figuur 2C). Ga verder naar de culturen voeden om de 2 dagen
11. Bij de TS-cellen 50% confluentie (meestal tussen dag 15 en 20) te bereiken, een keer wassen met PBS en voeg 100 ml 0,25% trypsine / EDTA. Pipet op en neer tijdens de behandeling met trypsine een bijna single-cell suspensie blijft. Stop de behandeling met trypsine door het toevoegen van TS-70CM-1.5F4H en transfer naar nieuwe 6-well of 60mm platen die de mitomycine C-behandelde MEF feeders (2,5 x 10 ⁵ cells/6-well of 5 x 10 ⁵ cells/60mm plaat).
12. Verandering medium 8 uur na de passage en blijven de culturen voeden om de 2 dagen.
13. Na een of twee meer passages (3-5 dagen tussen passages) op de MEF feeders, kan TS cellen worden gekweekt zonder hen. Omdat MEF hechten aan de cultuur plaat veel sneller dan TS-cellen na behandeling met trypsine, kan dergelijk verschil in de aanhanger tarief worden gebruikt om TS cellen te scheiden van de MEF feeders. Na het passeren van de gekweekte cellen, incubeer ze bij 37 ° C, 5% CO ₂ gedurende 30 minuten. De meeste MEF zal hechten aan de plaat en de TS bevolking blijft in suspensie. Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe plaat. Herhaal dit proces voor een aantal passages van een pure TS bevolking te verkrijgen.
14. Behouden TS cellen in TS-70CM-1.5F4H en geef ze elke 4 dagen (1u10-01u20 split) of wanneer de cultuur in 70% confluentie. Het passeren van de cellen met hoge dichtheid (hoger dan 1:05 split) of kweken ze als overdreven samenvloeiing kunnen hun differentiatie veroorzaken.
15. De identiteit van de TS-cellen kan worden bevestigd door immunokleuring van een cel marker, CDX2 (figuur 3).

Invriezen TS-cellen

1. Bereid 2x bevriezing medium (50% FBS, 30% TS middelgrote en 20% DMSO).
2. Coafhalen TS-cellen door trypsinebehandeling, gevolgd door centrifugatie bij 450 g gedurende 6 minuten. Resuspendeer ze in TS medium met gelijk volume van 2x bevriezing medium.
3. Bevriezing van de cellen langzaam met behulp van een isopropylalcohol kamer bij -70 ° C en over te dragen aan vloeibare stikstof na 24-48 uur.
4. Een 60 mm plaat (70% confluent) wordt gewoonlijk in twee flesjes.

Ontdooien TS-cellen

1. Snel dooi de flacon in 37 ° C, te verzamelen in 10 ml TS media door middel van centrifugeren (450, 6 min), en resuspendeer in 30% TS media, 70CM-1.5F4H.
2. Een flacon van cellen is geënt in een 60 mm plaat.

TS-cel differentiatie in TGC

Differentiatie van TS cellen in trofoblast reusachtige cellen (TGCs) kan worden geïnduceerd door de terugtrekking van de MEF-CM, FGF4 en heparine. De TGC fenotype (grote kernen) kan worden gedetecteerd vier dagen na de inductie (Tanaka et al.., 1998 en Chiu et al.. 2008). Immunokleuring van p450scc detecteren de uitdrukking van dit TGC marker in de gedifferentieerde cultuur (Figuur 4A). Flowcytometrische analyse van de PI (propidiumjodide) gekleurde cellen toont verder de aanwezigheid van gedifferentieerde cellen met hogere DNA-inhoud (Figuur 4B). Deze resultaten suggereren dat TS cellen endoreduplicatie ondergaan te worden polyploïde TGCs.

Representatieve resultaten

Figuur 1. Dissectie van de muis uteri. (A) Locatie van de uteri wordt aangegeven door pijlen. (B) dwars door de kruising van de baarmoeder en baarmoederhals, zoals afgebeeld. (C) Snij de baarmoeder net onder de eileider (OD) onder de eierstok (OV). (D) Afbeelding van de baarmoeders.

Figuur 2. Representatieve foto's illustreren de muis blastocyst, blastocyst uitgroei en trofoblast kolonie. (A) Een muis blastocyst verzameld op E3.5 wordt weergegeven. ICM, binnenste celmassa, MT, muurschildering trophectoderm, PT, polaire trophectoderm. (B) Een trofoblast uitgroei op MEF feeders wordt weergegeven. TS, trofoblast stamcel. (C) A trofoblast stamcel kolonie toont een duidelijke voorsprong op MEF feeders. Pijlen geven de cel grens.

Figuur 3. Identificatie van de TS cellen door immunokleuring analyse. TS (AD) en ES (controle, EH) cellen zijn afhankelijk van de marker identificatie. Cellen worden immunostained met antilichamen tegen Oct4 (A, E) of CDX2 (B, F) te herkennen en tegengekleurd door DAPI (C, G) gepresenteerd in samengevoegd beelden (D, H). Schaalbalk, 50 urn.

Figuur 4. Differentiatie van TS cellen in vitro. (A) Ongedifferentieerde (Undiff) of gedifferentieerde (Diff) cellen in de cultuur werden onderzocht voor de expressie van een TGC marker, p450scc (groen), tegengekleurd met DAPI (rood). (B) Flowcytometrische analyse van de gedifferentieerde cellen, gekleurd met PI, meet de DNA-inhoud (M1, twee tot vier exemplaren, M2, meer dan vier exemplaren). De M2 bevolking vertegenwoordigt de polyploïde trofoblast cellen.

Discussion

In deze video, tonen we het proces om E3.5 blastocysten van baarmoeders en experimentele procedures verzamelen om TS cellijnen vast te stellen. We beschrijven ook de voorwaarde om de stemness van TS cellen te handhaven en hun differentiatie te induceren in de gedifferentieerde cellen. Twee cruciale stappen om pure TS cellijnen te verkrijgen zijn de timing voor de uitgroei disaggregatie (stap 9) en de verwerking van de eerste passage (stap 11). Het is gemeld dat de primitieve endoderm-afgeleide cellen kunnen voordoen in de cultuur van na een uitgebreide blastocyst in stap 9 of overmatige groei van TS kolonies (> 50% confluentie) groeien in stap 11 (Kunath et al., 2005).. Hoewel de primitieve endoderm-afgeleide cellen kunnen worden geïdentificeerd door hun onderscheidende morfologie met een ronde cel vorm en verminderde cel-cel contact in vergelijking met de TS-cellen, is het moeilijk om ze te verwijderen uit de cultuur, omdat ze groeien goed in de TS medium en niet lijken te MEF feeders of FGF4 vereisen.

De gedifferentieerde TGCs kunnen steeds ontstaan ​​in de TS cultuur, zelfs in de aanwezigheid van MEF-CM en FGF4. Als een pure TS bevolking gewenst is, kunnen deze gedifferentieerde cellen worden gescheiden op basis van de differentiële aanhanger tarieven. Net als bij MEF, TGCs hechten aan cultuur platen sneller dan de TS-cellen, die een procedure mogelijk is om een ​​zuivere TS bevolking zoals beschreven in stap 13 te verwerven. Als alternatief, want TGCs zijn zeer aanhanger en beter bestand tegen behandeling met trypsine, een pure TS bevolking kan ook verkregen worden door snelle trypisinization (3 min), gevolgd door verzameling van de geschorste TS cellen.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).