Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

Summary

In questo video, dimostriamo l'isolamento di blastocisti mouse e la derivazione di cellule staminali trofoblasto da blastocisti. Abbiamo anche descrivere le condizioni per il mantenimento della proprietà delle cellule staminali e l'induzione della differenziazione nella cultura.

Abstract

Specificazione del trophectoderm è uno degli eventi più antichi differenziazione di sviluppo dei mammiferi. Il lignaggio trofoblasto deriva dalla impianto trophectoderm media e genera la parte fetale della placenta. Di conseguenza, lo sviluppo di questo lignaggio è essenziale per la sopravvivenza dell'embrione. Derivazione di staminali trofoblasto (TS), le cellule da blastocisti mouse è stato descritto per primo da Tanaka

Protocol

In questo protocollo, si descrive la preparazione di blastocisti mouse e la creazione di linee cellulari TS. Manipolazioni del mouse generale prima della raccolta di blastocisti, tra cui il set-up per la monta naturale e l'induzione dell'ovulazione super, in fondo, il protocollo standard illustrato da Nagy et al. 2003 (pp146-150).

Derivazione e il mantenimento delle cellule TS

1. Setup croce riproduzione tra i topi di interesse.
2. Preparare fibroblasti embrionali di topo (MEF) come cellule nutrici. Due giorni prima della raccolta delle blastocisti, MEF (2 x 10 ⁶ cellule) sono placcati in 100 piatti mm. Il giorno dopo, queste cellule vengono trattate con 10 ml di terreno TS contenente mitomicina C (20 mg / ml) per un 2 ore di incubazione a 37 ° C, 5% di CO _2. Questo è seguito da lavaggio delle cellule due volte con PBS. Le cellule C mitomicina trattate vengono poi seminate a 12-pozzetti (1 x 10 ⁵ cellule / pozzetto).
3. Il giorno della raccolta blastocisti (3,5 DPC, indicato come primo giorno), terreno di coltura è sostituito dal MEF TS medio più 1x FGF4/Heparin (0,5 ml / pozzetto).
4. Preparazione per la raccolta dell 'utero: eutanasia con il mouse e individuare l'utero (Figura 1A).
5. Togliere l'utero afferrandolo con una pinza al collo dell'utero (che si trova dietro la vescica) e tagliare attraverso la giunzione dell'utero e della cervice uterina (Figura 1B). Tirare l'utero, tagliare la membrana e nei tessuti grassi e tagliare via l'utero sotto l'incrocio con la ovidotto (Figura 1C). Luogo cervice (Figura 1D) in un piccolo volume (0,2 ml) di media TS in un piatto di 60 mm.
6. Invia ogni corno dell'utero con 1 ml di terreno TS utilizzando una siringa da 1 ml con una 26-gauge. Inserire l'ago nella base di utero e sciacquare lentamente in un nuovo 60 mm con 1 media TS ml. L'utero deve essere gonfiato ed esteso completamente durante il lavaggio.
7. Raccogliere e trasferire la blastocisti con cura in un ambiente pulito 12 pozzetti contenenti medio TS con una bocca controllato pipetta. Lavare blastocisti tre volte trasferimento seriale attraverso media TS a 12-pozzetti. Mettere una blastocisti per bene (Figura 2A) in un 12-pozzetti contenenti la mitomicina C trattati con alimentatori MEF e della cultura a 37 ° C, 5% di CO _2.
8. La blastocisti si schiuderanno dalla zona pellucida e allegare ai pozzetti in 24 a 36 ore. Una piccola escrescenza sarà prontamente osservato il giorno 3. Alimentare le culture con 500 microlitri TS medio fresco più 1x FGF4/Heparin.
9. Il giorno 4 o 5, la conseguenza blastocisti dovrebbe essere pronto per la disaggregazione a seconda della sua grandezza. La dimensione ideale per la disaggregazione delle cellule TS è illustrato in Figura 3B. Lavare le culture una volta con 0,5 ml di PBS. Aggiungere 100 ml 0,25% tripsina / EDTA e incubare per 5 minuti a 37 ° C, 5% di CO _2. Rompere il escrescenza in piccoli grumi pipettando su e giù vigorosamente con un pipetteman P100. Fermare il tripsinizzazione aggiungendo TS-70cm-1.5F4H (medio TS 30%, 70% MEF-CM più FGF4/Heparin 1.5x) nel pozzo. Cambia media 8 ore dopo la disaggregazione e continuare ad alimentare le cellule ogni 2 giorni.
10. Tra i giorni 6 e 10 (molto variabile) colonie di cellule TS può essere osservato. Hanno una lastra piana e come morfologia epiteliale con un confine chiaro colonia (Figura 2C). Continuano ad alimentare le culture ogni 2 giorni
11. Quando le cellule TS raggiungere il 50% confluenza (di solito tra i giorni 15 e 20), lavare una volta con PBS e aggiungere 100 ml 0,25% tripsina / EDTA. Pipetta su e giù durante tripsinizzazione per garantire un vicino cella singola sospensione. Fermare il tripsinizzazione aggiungendo TS-70cm-1.5F4H e trasferimento in nuovi piatti da 6 o 60 millimetri e contiene il mitomicina C trattati con alimentatori MEF (2,5 x 10 ⁵ cells/6-well o 5 x10 ⁵ cells/60mm piastra).
12. Cambia media 8 ore dopo il passaggio e continuare ad alimentare le culture ogni 2 giorni.
13. Dopo uno o due in più passaggi (3-5 giorni tra i passaggi) sul alimentatori MEF, le cellule possono essere coltivate TS senza di loro. Perché MEF allegare alla piastra di coltura molto più veloce rispetto alle cellule TS dopo tripsinizzazione, tale differenza nel tasso aderente può essere utilizzata per separare le cellule TS dal alimentatori MEF. Dopo aver superato le cellule in coltura, li incubare a 37 ° C, 5% di CO ₂ per 30 min. La maggior parte MEF attribuirà alla piastra e la popolazione TS rimane in sospensione. Trasferire il supernatante in una nuova piastra. Ripetere questo processo per vari passaggi per ottenere una popolazione pura TS.
14. Mantenere le cellule TS a TS-70cm-1.5F4H e passarli ogni 4 giorni (1:10-1:20 split) o ​​quando la cultura raggiunge il 70% confluenza. Passando le cellule con alta densità (superiore a dividere 1:5) o coltura quando eccessivamente confluenti può causare la loro differenziazione.
15. L'identità delle cellule TS può essere confermata mediante immunocolorazione di un marker delle cellule, Cdx2 (Figura 3).

Celle di congelamento TS

1. Preparare 2x medio congelamento (50% FBS, 30 di media TS% e 20% DMSO).
2. Cocellule TS llect da tripsinizzazione, seguita da centrifugazione a 450g per 6 min. Risospendere in media TS con volume equivalente di mezzo di congelamento 2x.
3. Congelare le cellule lentamente utilizzando una camera di alcool isopropilico a -70 ° C ed il trasferimento di azoto liquido, dopo 24-48 ore.
4. Un piatto 60 mm (70% confluenti) è di solito tenuti in 2 flaconi.

Scongelamento cellule TS

1. Scongelare rapidamente il flacone a 37 ° C, raccoglierli in 10 ml mezzi TS mediante centrifugazione (450g, 6 min), e risospendere in 30% TS media, 70cm-1.5F4H.
2. Un flaconcino di cellule seminate in una piastra 60 mm.

TS differenziazione cellulare in TGC

Differenziazione delle cellule TS in cellule giganti trofoblasto (TGCs) può essere indotta dal ritiro del MEF-CM, FGF4 ed eparina. Il fenotipo TGC (nuclei di grandi dimensioni) possono essere individuati quattro giorni dopo l'induzione (Tanaka et al., 1998 e Chiu et al. 2008). Immunocolorazione p450scc di rilevare l'espressione di questo marcatore TGC nella cultura differenziata (Figura 4A). Citometria a flusso di PI (ioduro di propidio) cellule colorate dimostra ulteriormente la presenza di cellule differenziate con contenuto di DNA superiore (Figura 4B). Questi risultati suggeriscono che le cellule subiscono TS endoreduplicazione a diventare TGCs poliploidi.

Rappresentante Risultati

Figura 1. Dissezione di uteri mouse. (A) Luogo della cervice è indicata dalle frecce. (B) Tagliare attraverso la giunzione dell'utero e della cervice uterina, come mostrato. (C) Tagliare l'utero appena sotto la ovidotto (OD) sotto l'ovaio (OV). (D) Immagine della cervice.

Immagini figura rappresentativa 2. Illustrare blastocisti del mouse, escrescenza blastocisti e colonia trofoblasto. (A) Un topo blastocisti raccolti E3.5 viene mostrato. ICM, la massa cellulare interna, MT, trophectoderm murale, PT, trophectoderm polare. (B) Un escrescenza trofoblasto su linee MEF è mostrato. TS, di cellule staminali trofoblasto. (C) Una colonia trofoblasto cellule staminali mostra un chiaro vantaggio su linee MEF. Le frecce indicano il confine della cella.

Figura 3. Identificazione di cellule TS immunocolorazione analisi. TS (AD) ed ES (controllo, EH) le cellule sono sottoposte a identificazione marcatore. Le cellule sono immunoistochimica con anticorpi per riconoscere Oct4 (A, E) o Cdx2 (B, F), e di contrasto con DAPI (C, G) ha presentato nelle immagini fuse (D, H). Scala bar, 50 micron.

Figura 4. Differenziazione delle cellule TS in vitro. (A) Indifferenziato (Undiff) o differenziato (Diff), le cellule in coltura sono stati esaminati per l'espressione di un marker TGC, p450scc (verde), di contrasto con DAPI (rosso). (B) L'analisi citofluorimetrica delle cellule differenziate, colorate con PI, misura il contenuto del DNA (M1, da due a quattro copie, M2, più di quattro copie). La popolazione M2 rappresenta il trofoblasto cellule poliploidi.

Discussion

In questo video, dimostriamo il processo per la raccolta E3.5 blastocisti dalle procedure di uteri e sperimentali per stabilire linee di cellule TS. Abbiamo anche descrivere la condizione per mantenere la staminalità delle cellule TS e per indurre la loro differenziazione in cellule differenziate. A due passi fondamentali per ottenere linee cellulari puro TS sono i tempi per la disaggregazione escrescenza (punto 9) e la lavorazione del primo passaggio (passo 11). E 'stato riportato che endoderma primitivo cellule derivate possono sorgere nella cultura dopo blastocisti troppo grande per esteso al punto 9 o eccessiva crescita di colonie TS (> 50% confluenza) al punto 11 (Kunath et al., 2005). Anche se endoderma primitivo cellule derivate possono essere identificati dal loro particolare morfologia delle cellule con una forma arrotondata e ridotto cellula-cellula contatto rispetto alle cellule TS, è difficile rimuoverli dalla cultura perché crescono bene in mezzo TS e non sembrano richiedere alimentatori MEF o FGF4.

Il TGCs differenziati possono sorgere costantemente nella cultura TS anche in presenza del MEF-CM e FGF4. Se una popolazione TS puro è desiderato, queste cellule differenziate possono essere separati sulla base dei tassi differenziali aderente. Simile al MEF, TGCs allegare alla piastre di coltura più velocemente rispetto alle cellule TS, fornendo una procedura possibile acquisire una popolazione pura TS come descritto al punto 13. In alternativa, perché TGCs sono altamente aderente e più resistente alle tripsinizzazione, una popolazione TS puro può anche essere ottenuta trypisinization veloce (3 minuti), seguita dalla raccolta delle cellule TS sospeso.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).