Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Summary

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de blastocistos mouse ea derivação de células-tronco de blastocistos trofoblasto. Descrevemos também condições para a manutenção da propriedade de célula-tronco, bem como a indução de diferenciação em cultura.

Abstract

Especificação do trofectoderma é um dos eventos mais antigos diferenciação de desenvolvimento dos mamíferos. A linhagem trofoblasto derivados a partir da implantação medeia trofectoderma e gera a parte fetal da placenta. Como resultado, o desenvolvimento desta linhagem é essencial para a sobrevivência do embrião. Derivação de trofoblasto haste (TS) células de blastocistos mouse foi primeiramente descrita por Tanaka

Protocol

Neste protocolo, descrevemos a preparação de blastocistos do mouse e do estabelecimento de linhas de células TS. Manipulações do mouse geral antes da coleta de blastocistos, incluindo a criação de acasalamento natural e na indução da ovulação super, basicamente, seguir o protocolo padrão ilustrado por Nagy et al. 2003 (pp146-150).

Derivação e manutenção das células TS

1. Cruz configuração cruzamento entre ratos de interesse.
2. Prepare fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) como células alimentadoras. Dois dias antes da coleta de blastocistos, MEFs (2 x 10 ⁶ células) são banhados em 100 pratos mm. No dia seguinte, essas células são tratadas com 10 ml de meio de TS contendo mitomicina C (20 mg / ml) para um 2 horas de incubação a 37 ° C CO, 5% _2. Isso é seguido por lavagem de células duas vezes com PBS. As células tratadas mitomicina C são então semeadas em placas de 12 poços (1 x 10 ⁵ células / poço).
3. No dia da coleta de blastocisto (3,5 dpc, referido como um dia), MEF meio de cultura é substituído por TS médio mais FGF4/Heparin 1x (0,5 ml / poço).
4. Preparação para a coleta do útero: euthanize o mouse e localizar o útero (Figura 1A).
5. Remover o útero, segurando-o com uma pinça no colo do útero (localizado atrás da bexiga) e atravessam a junção do útero e colo do útero (Figura 1B). Puxar o útero, a guarnição da membrana e tecidos de gordura fora e cortar o útero abaixo da junção com o oviduto (Figura 1C). Coloque o útero (Figura 1D) em um pequeno volume (0,2 ml) de meio de TS em uma placa de 60 mm.
6. Lave cada corno uterino com 1 ml de meio de TS utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 26 gauge. Inserir a agulha na base do útero e lavar lentamente em uma placa milímetros novo 60 com uma média TS ml. O útero deve ser inflado e totalmente estendido durante a lavagem.
7. Coletar e transferir os blastocistos cuidadosamente em um prato limpo e bem 12 contendo meio de TS utilizando uma pipeta boca controlada. Lavar blastocistos três vezes por transferência serial através de médio TS em 12-lamelas. Blastocisto um lugar por poço (Figura 2A) em uma placa de 12 poços contendo os mitomicina C tratados com alimentadores MEF e cultura a 37 ° C, 5% de CO _2.
8. Os blastocistos chocará da zona pelúcida e anexar aos poços em 24 a 36 horas. A conseqüência de pequeno porte será prontamente observado no dia 3. Alimentar as culturas com 500 mL de médio TS fresco, mais 1x FGF4/Heparin.
9. No dia 4 ou 5, o resultado natural de blastocisto deve estar pronto para desagregação dependendo do seu tamanho. O tamanho ideal para TS desagregação das células é ilustrada na Figura 3B. Lavar as culturas, uma vez com 0,5 ml de PBS. Adicione 100 ml 0,25% de tripsina / EDTA e incubar por 5 minutos a 37 ° C CO, 5% _2. Quebrar o desdobramento em pedaços pequenos, pipetando cima e para baixo vigorosamente com uma pipetteman P100. Parar o tripsinização adicionando TS-70CM-1.5F4H (TS médio de 30%, 70% MEF CM-plus FGF4/Heparin 1.5x) no poço. Mudança média 8 horas após a desagregação e continuar a alimentar as células a cada 2 dias.
10. Entre os dias 6 e 10 (muito variável) colônias de células TS podem ser observados. Eles têm folha plana epiteliais, como a morfologia com uma fronteira clara colônia (Figura 2C). Continuar a alimentar as culturas a cada 2 dias
11. Quando as células TS a confluência de 50% (geralmente entre os dias 15 e 20), lave uma vez com PBS e adicione 100 ml 0,25% de tripsina / EDTA. Pipeta para cima e para baixo durante tripsinização para garantir uma suspensão de uma única célula próximo. Parar o tripsinização adicionando TS-70CM-1.5F4H e transferência para novas placas de 6-bem ou 60 milímetros contendo o mitomicina C tratados com alimentadores MEF (2,5 x 10 ⁵ cells/6-well ou 5 x10 ⁵ cells/60mm placa).
12. Mudança média 8 horas após a passagem e continuar a alimentar as culturas a cada 2 dias.
13. Depois de mais uma ou duas passagens (3-5 dias entre as passagens) nos alimentadores MEF, as células podem ser cultivadas TS sem eles. Porque MEFs atribuem à placa de cultura muito mais rápido do que as células TS após tripsinização, essa diferença na taxa de aderentes podem ser utilizados para separar células TS do alimentadores MEF. Depois de passar as células cultivadas, incube-los a 37 ° CO C, 5% ₂ para 30 min. Mais MEFs irá anexar a placa e da população TS permanece em suspensão. Transfira o sobrenadante para um novo prato. Repita este processo para várias passagens para obter uma população TS pura.
14. Manter as células em TS TS-70CM-1.5F4H e passá-las a cada 4 dias (01:10 - 01:20 split) ou quando a cultura atinge 70% confluência. Passando as células com alta densidade (maior do que dividir 1:5) ou cultivo los quando excessivamente confluentes podem causar a sua diferenciação.
15. A identidade das células TS pode ser confirmado por imunocoloração de um marcador celular, Cdx2 (Figura 3).

Congelamento de células TS

1. Prepare 2x meio de congelamento (50% FBS, 30 de médio TS% e DMSO 20%).
2. Cocélulas TS llect por tripsinização, seguido por centrifugação a 450g por 6 min. Ressuspender-los em meio TS com igual volume de meio de congelamento 2x.
3. Congelar as células lentamente utilizando uma câmara de álcool isopropílico a -70 ° C e transferir para o nitrogênio líquido após 24-48 horas.
4. Uma placa de 60 mm (70% confluentes) é normalmente mantida em 2 frascos.

Descongelamento células TS

1. Descongelar rapidamente o frasco em 37 ° C, recolher em 10 ml de mídia TS por centrifugação (450g, 6 min) e ressuspender em 30% TS media, 70cm-1.5F4H.
2. Um frasco de células é semeado em uma placa de 60 mm.

TS diferenciação celular em TGC

Diferenciação das células TS nas células trofoblásticas gigantes (CTGs) pode ser induzida pela retirada do MEF-CM, FGF4 e heparina. O fenótipo TGC (núcleos grandes) podem ser detectados quatro dias após a indução (Tanaka et al., 1998 e Chiu et al. 2008). Imunomarcação de p450scc detectar a expressão deste marcador TGC na cultura diferenciada (Figura 4A). Citometria de fluxo PI (iodeto de propídio) células coradas mostra ainda a presença de células diferenciadas que contêm alto teor de DNA (Figura 4B). Estes resultados sugerem que as células sofrem endorreduplicação TS para se tornar CTGs poliplóides.

Resultados representante

Figura 1. Dissecção da úteros mouse. (A) Localização do útero é indicado por setas. (B) Corte através da junção do útero e colo do útero, como mostrado. (C) Corte do útero, logo abaixo do oviduto (OD) debaixo do ovário (OV). (D) Imagem do útero.

Fotos Representante figura 2. Ilustrar blastocisto mouse, conseqüência de blastocisto e colônia trofoblasto. (A) A blastocisto de rato coletados em E3.5 é mostrado. ICM, a massa celular interna; MT, trofectoderma mural; PT, trofectoderma polar. (B) A conseqüência trofoblasto em alimentadores MEF é mostrado. TS, células-tronco trofoblasto. (C) A trofoblasto colônia de células-tronco mostra uma clara vantagem em alimentadores MEF. Setas indicam o limite da célula.

Figura 3. Identificação de células TS por imunocoloração análise. TS (AD) e ES (controle, EH), as células estão sujeitos à identificação do marcador. Células estão com os anticorpos para reconhecer Oct4 (A, E) ou Cdx2 (B, F), e pela contra-DAPI (C, G) apresentado em imagens fundidas (D, H). Barra de escala, 50 mm.

Figura 4. Diferenciação de células in vitro TS. (A) Indiferenciado (undiff) ou diferenciados (Diff) células em cultura foram examinados para a expressão de um marcador TGC, p450scc (verde), contrastado com DAPI (vermelho). (B) análise por citometria de fluxo as células diferenciadas, marcadas com PI, mede o conteúdo de DNA (M1, 03:58 cópias; M2, mais de quatro cópias). A população M2 representa as células do trofoblasto poliplóides.

Discussion

Neste vídeo, demonstramos o processo de coletar E3.5 blastocistos de procedimentos uterino e experimental para estabelecer linhagens de células TS. Descrevemos também a condição para manter a stemness de células TS e induzir sua diferenciação em células diferenciadas. Dois passos fundamentais para obter linhagens de células pura TS são o tempo para desagregação conseqüência (passo 9) e processamento de primeira passagem (passo 11). Tem sido relatado que a primitiva endoderme células derivadas podem surgir na cultura, após extensa blastocisto outgrow no passo 9 ou crescimento excessivo de colônias TS (> 50% confluência) na etapa 11 (Kunath et al., 2005). Embora primitivo endoderma células derivadas podem ser identificados pela sua morfologia característica, com uma forma de células arredondadas e de contato célula-célula reduzida em comparação com as células TS, é difícil removê-las da cultura porque eles crescem bem no meio de TS e não parecem exigir alimentadores MEF ou FGF4.

Os CTGs diferenciados podem surgir constantemente na cultura TS, mesmo na presença de MEF-CM e FGF4. Se uma população TS puro é desejado, essas células diferenciadas, podem ser separados com base no diferencial das taxas de aderentes. Semelhante ao MEFs, CTGs anexar a placas de cultura mais rápido que as células TS, fornecendo um procedimento possível adquirir uma população TS pura como descrito na etapa 13. Alternativamente, porque CTGs são altamente aderente e mais resistentes a tripsinização, uma população TS pura também podem ser obtidas pelo trypisinization rápida (3 min), seguido da coleta de células TS suspenso.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).