Derivación de células madre de ratón a partir de blastocistos Trofoblasto

Summary

En este vídeo, se demuestra el aislamiento de los blastocistos de ratón y la derivación de células madre del trofoblasto de los blastocistos. También describe las condiciones para el mantenimiento de la propiedad de células madre, así como la inducción de diferenciación en la cultura.

Abstract

Especificación de la trophectoderm es uno de los eventos tempranos de diferenciación de desarrollo de los mamíferos. El linaje trofoblasto derivado de la implantación trophectoderm media y genera la parte fetal de la placenta. Como resultado, el desarrollo de este linaje es esencial para la supervivencia de los embriones. Derivación de trofoblasto del tallo (TS) las células de los blastocistos de ratón fue descrito por primera vez por Tanaka

Protocol

En este protocolo, se describe la preparación de los blastocistos de ratón y el establecimiento de líneas de células TS. Manipulaciones generales del ratón antes de la recolección de los blastocistos, incluyendo la puesta a punto para el apareamiento natural y la inducción de la superovulación, básicamente, seguir el protocolo estándar ilustrado por Nagy et al. 2003 (pp146-150).

Derivación y el mantenimiento de las células TS

1. Configuración de cruzamiento entre ratones de interés.
2. Prepare fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) como células alimentadoras. Dos días antes de la recolección de los blastocistos, MEFs (2 x 10 ⁶ células) se sembraron en placas de 100 mm. Al día siguiente, estas células son tratadas con 10 ml de medio de TS que contiene la mitomicina C (20 mg / ml) para un 2 horas de incubación a 37 ° C, 5% de CO _2. Esto es seguido por lavado de las células dos veces con PBS. Las células tratadas con mitomicina C luego se sembraron en placas de 12 pocillos (1 x 10 ⁵ células / pocillo).
3. En el día de la recogida de blastocistos (3,5 dpc, conocido como el primer día), media MEF cultura se sustituye por el TS medio plus 1x FGF4/Heparin (0,5 ml / pocillo).
4. Preparación para la recogida del útero: la eutanasia con el ratón y localizar el útero (fig. 1A).
5. Extirpar el útero, sujetándola con una pinza en el cuello del útero (que se encuentra detrás de la vejiga) y corte en la unión del útero y el cuello (fig. 1B). Tire el útero, el asiento de la membrana y los tejidos grasos de distancia y corta el útero por debajo de la confluencia con el oviducto (fig. 1C). Lugar del cuello (Figura 1 D) en un pequeño volumen (0,2 ml) de medio de TS en una placa de 60 mm.
6. Vaciar cada cuerno uterino con 1 ml de medio TS utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 26. Insertar la aguja en la base del útero y enjuague lentamente en una placa de 60 mm con un nuevo medio de TS ml. El útero debe ser inflado y totalmente extendida durante el lavado.
7. Recoger y traspasar los blastocitos cuidadosamente en un recipiente limpio 12 y placa que contiene medio TS con una pipeta de boca controlada. Lavado de blastocistos en tres ocasiones por la transferencia en serie a través de medio TS en placas de 12 pocillos. Coloque un blastocisto por pozo (Figura 2) en una placa de 12 pocillos que contiene la mitomicina C tratados con alimentadores MEF y la cultura a 37 ° C, 5% de CO _2.
8. El blastocisto se salen de la zona pelúcida y se unen a los pozos de 24 a 36 horas. Una consecuencia pequeños se les puede observar en el día 3. Alimentar los cultivos con medio 500 l TS fresca más FGF4/Heparin 1x.
9. El día 4 ó 5, la consecuencia de blastocisto debe estar listo para la desagregación en función de su tamaño. El tamaño ideal para el desglose de células TS se ilustra en la Figura 3B. Lave las culturas, una vez con 0,5 ml de PBS. Añadir 100 ml de 0,25% de tripsina / EDTA y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C, 5% de CO _2. Romper el fruto en pequeños grupos pipeteando arriba y hacia abajo con fuerza con un pipetteman P100. Detener la tripsina mediante la adición de TS-70cm-1.5F4H (media del 30% TS, el 70% MEF-CM más FGF4/Heparin 1,5 x) en el pozo. Cambio de medio 8 horas después de desagregación y seguir alimentando a las células de cada 2 días.
10. Entre los días 6 y 10 (muy variable) TS colonias de células pueden ser observadas. Tienen hoja plana, como la morfología del epitelio con un límite claro colonia (Figura 2C). Seguir alimentando la cultura cada 2 días
11. Cuando las células TS alcanzar el 50% de confluencia (por lo general entre los días 15 y 20), lavar una vez con PBS y añadir 100 ml 0,25% de tripsina / EDTA. Pipeta hacia arriba y abajo durante la tripsina para asegurar una cerca de una sola célula de la suspensión. Detener la tripsina mediante la adición de TS-70cm-1.5F4H y traslado a las nuevas placas de 6 pocillos o de 60 mm que contiene la mitomicina C tratados con alimentadores MEF (2,5 x 10 ⁵ cells/6-well o 5 x 10 ⁵ cells/60mm placa).
12. Cambio de medio de 8 horas tras el paso y seguir alimentando a los cultivos cada 2 días.
13. Después de uno o dos pasajes (3-5 días entre pasajes) en los alimentadores del MEF, las células TS se puede cultivar sin ellos. Porque MEFs se adhieren a la placa de cultivo mucho más rápido que las células TS después de tripsina, tal diferencia en la tasa de adherencia pueden ser utilizados para separar las células TS de los alimentadores de MEF. Después de pasar a las células cultivadas, que se incuba a 37 ° C CO, _{2 al} 5% durante 30 min. La mayoría de MEFs se adhieren a la placa y la población de TS permanece en suspensión. Transferir el sobrenadante a un nuevo plato. Repita este proceso para varios pasajes para obtener una población pura TS.
14. Mantener las células en TS TS-70cm-1.5F4H y pasarlos cada 4 días (01:10-1:20 split) o ​​cuando el cultivo alcanza el 70% de confluencia. Que pasa con las células de alta densidad (mayor que dividir 1:5) o su cultivo cuando está muy confluentes puede causar su diferenciación.
15. La identidad de las células TS puede ser confirmado por tinción de un marcador de células, Cdx2 (Figura 3).

Congelar células TS

1. Prepare 2x medio de congelación (50% de SFB, 30 medianas TS% y 20% DMSO).
2. Cocélulas llect TS por tripsinización, seguido por centrifugación a 450 g durante 6 minutos. Resuspender en medio de TS con igual volumen de medio de congelación 2x.
3. Congelar las células lentamente usando una cámara de alcohol isopropílico a -70 ° C y la transferencia de nitrógeno líquido después de 24-48 horas.
4. Una placa de 60 mm (70% confluente) generalmente se mantiene en 2 viales.

Descongelar las células TS

1. Rápido deshielo del vial en 37 ° C, que se acumulan en 10 ml de medios TS mediante centrifugación (450 g, 6 min), y volver a suspender en el 30% TS medios de comunicación, 70cm-1.5F4H.
2. Un vial de células se sembraron en una placa de 60 mm.

TS diferenciación celular en TGC

Diferenciación de las células TS en células gigantes trofoblasto (PGT) puede ser inducida por la retirada de las MEF-CM, FGF4 y heparina. El fenotipo de TGC (grandes núcleos) se pueden detectar cuatro días después de la inducción (Tanaka et al., 1998 y Chiu et al. 2008). Inmunotinción de P450scc detectar la expresión de este marcador TGC en la cultura diferenciadas (Figura 4). Análisis de citometría de flujo de PI (yoduro de propidio) las células teñidas muestra, además, la presencia de células diferenciadas que contienen un mayor contenido de ADN (Figura 4). Estos resultados sugieren que las células se someten TS endorreduplicación para convertirse en PGT poliploides.

Resultados representante

Figura 1. Disección del cuello del ratón. (A) Ubicación del cuello es indicado por las flechas. (B) Corte a través de la unión del útero y el cuello como se muestra. (C) Corte del útero justo por debajo del oviducto (OD) por debajo del ovario (OV). (D) de la imagen del cuello.

Imágenes la figura 2. Representante ilustrar blastocisto de ratón, consecuencia de blastocisto y de la colonia trofoblasto. (A) Un blastocisto de ratón recogidos en E3.5 se muestra. ICM, la masa celular interna, MT, trophectoderm mural, PT, trophectoderm polar. (B) Una consecuencia del trofoblasto en los alimentadores MEF se muestra. TS, de células madre del trofoblasto. (C) Una madre trofoblasto colonia de células muestra una clara ventaja en los alimentadores MEF. Las flechas indican el límite de la celda.

Figura 3. Identificación de las células TS por inmunotinción análisis. TS (AD) y ES (control, EH), las células están sujetos a la identificación de marcadores. Las células son immunostained con anticuerpos para reconocer Oct4 (A, E) o Cdx2 (B, F), y counterstained por DAPI (C, G) se presentan en las imágenes fusionadas (D, H). Barra de escala, de 50 micras.

Figura 4. Diferenciación de las células TS in vitro. (A) no diferenciadas (Undiff) o diferenciados (dif) las células en cultivo fueron examinados para la expresión de un marcador de TGC, P450scc (verde), contrastados con DAPI (rojo). (B) el análisis de citometría de flujo de las células diferenciadas, teñidas con PI, las medidas del contenido de ADN (M1, de dos a cuatro copias; M2, más de cuatro copias). La población M2 representa las células trofoblásticas poliploides.

Discussion

En este vídeo, que muestran el proceso para recoger E3.5 blastocistos de los procedimientos de útero y experimentales para establecer las líneas de células TS. También describe la condición de mantener la troncalidad de las células TS y para inducir su diferenciación en células diferenciadas. Dos pasos críticos para obtener líneas puras de células TS son el momento para la desagregación consecuencia (paso 9) y el procesamiento del primer paso (paso 11). Se ha informado de que la primitiva endodermo derivado de las células pueden surgir en el cultivo después de blastocisto extensa superar en el paso 9 o la proliferación de colonias de TS (> 50% de confluencia) en el paso 11 (Kunath et al., 2005). Aunque primitivo del endodermo derivado de las células pueden ser identificadas por su morfología característica con una forma de células redondeadas y una disminución del contacto célula-célula en comparación con las células del TS, es difícil sacarlos de la cultura, ya que crecen bien en el medio de TS y no parecen requerir MEF alimentadores o FGF4.

El PGT diferenciados que surgen constantemente en la cultura de TS, incluso en presencia de MEF-CM y FGF4. Si una población TS puro se desea, estas células diferenciadas pueden ser separados sobre la base de las tasas de adherencia diferencial. Al igual que en MEFs, PGT se adhieren a las placas de cultivo más rápido que las células TS, proporcionando un posible procedimiento para adquirir una población TS pura como se describe en el paso 13. Por otra parte, porque son muy adherentes PGT y más resistente a la tripsina, una población TS puro también puede ser obtenida por trypisinization rápido (3 min), seguido por la recolección de las células TS suspendido.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).