Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Summary

Bu video, fare blastosist blastosist trofoblast kök hücrelerinin izolasyonu ve derivasyon göstermektedir. Ayrıca kök hücre özelliği yanı sıra kültür farklılaşma indüksiyonu için bakım koşulları açıklar.

Abstract

Trophectoderm belirlenmesi memeli gelişiminin erken farklılaşma olayları biridir. Trophectoderm aracılık implantasyon türetilmiştir ve plasentanın fetal trofoblast soy üretir. Sonuç olarak, bu soy gelişimi embriyonun hayatta kalmak için çok önemlidir. Fare blastosist trofoblast kök (TS) hücreleri türetilmesi ilk Tanaka tarafından tarif edilmiştir

Protocol

Bu protokol, fare blastosist hazırlanması ve TS hücre hatlarının kurulması açıklanmaktadır. Doğal çiftleşme için set ve süper ovulasyon indüksiyon dahil olmak üzere blastosist koleksiyon, önce Genel fare manipülasyonlar temelde Nagy ve ark tarafından gösterilen standart bir protokol izleyin. 2003 (pp146 150).

TS hücrelerinin türetilmesi ve bakım

1. Kur, faiz fareler arasında üreme çapraz.
2. Besleyici hücreler olarak fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) hazırlayın. Blastosist koleksiyon İki gün önce, MEFS (2 x 10 ⁶ hücre) 100 mm yemekler kaplanmıştır. Ertesi gün, bu hücrelerin, 37 ° C,% 5 CO 2 saat inkübasyon _için 2 mitomisin C (20 mg / ml) içeren 10 ml TS orta ile tedavi edilir . Bu hücreler PBS ile iki kez yıkanarak takip eder. Mitomisin C muamele edilen hücreler, daha sonra 12 kuyucuğu (1 ^x 10 5 hücre / iyi) numaralı seribaşı.
3. Blastosist toplama (3,5 DPC, bir gün olarak anılacaktır) günü, MEF kültür ortamı TS orta artı 1x FGF4/Heparin (0.5 ml / kuyu) tarafından değiştirilir.
4. Rahim toplanması için hazırlık: fare euthanize ve rahim (Şekil 1A) bulun.
5. Çıkarın, serviks (mesane arkasında bulunan) forseps ile tutarak rahim ve rahim ve serviks (Şekil 1B) birleşme kesen. Rahim çekin uzak membran ve yağ dokuları Döşeme ve yumurtalık (Şekil 1C) ile birleşme altında rahim kesmek. TS orta küçük bir hacmi (0,2 ml) 60 mm plaka uteri (Şekil 1D) yerleştirin.
6. 1 ml 26 gauge iğne ile 1 ml şırınga kullanarak TS orta ile her uterus boynuzu yıkayın. Iğne rahim tabanı içine yerleştirin ve yavaş yavaş yeni bir 60 mm plakası içine 1 ml TS orta ile yıkayın. Rahim şişirilmiş ve kızarma sırasında tamamen kapsayacak şekilde genişletilmesi gerekmektedir.
7. Toplayın ve bir ağız kontrollü pipet kullanarak TS orta içeren temiz bir 12 plaka dikkatlice blastosist transferi. 12 kuyucuğu TS aracılığıyla seri transfer blastosist üç kez yıkayın. Bir de ortalama 37 mitomisin C-MEF besleyiciler tedavi ve kültürü içeren bir 12-plaka blastosist (Şekil 2A) ° C,% 5 CO _2.
8. Blastosist zona pellusida yumurtadan çıkar ve 24 ila 36 saat içinde kuyulara eklenecektir. Küçük bir akıbet 3. gününde kolaylıkla görülecektir. 500 ul taze TS orta artı 1x FGF4/Heparin kültürler besleyin.
9. 4 veya 5 günde, blastokist akıbet boyutuna bağlı olarak ayrıştırılmasıyla için hazır olmalıdır. TH hücre ayrıştırılmasıyla için ideal boyut Şekil 3B gösterilmiştir. Kültürlerin 0.5 ml PBS ile bir kez yıkayın. 5 dakika 37 ° ° C,% 5 CO ₂ için 100 ml% 0.25 tripsin / EDTA ve inkübe ekleyin. P100 pipetteman ile kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleme küçük öbekler halinde Break sonucudur. TS-70cm-1.5F4H (% 30 TS orta,% 70 MEF-CM artı 1.5x FGF4/Heparin) kuyunun içine ekleyerek trypsinization durdurun. Ayrıştırılmasıyla 8 saat sonra orta değiştirin ve her 2 günde hücreleri beslemeye devam.
10. 6 ve 10 gün (son derece değişken) arasında TS hücre kolonileri görülebilir. Onlar açık bir koloni sınır (Şekil 2C) morfoloji gibi yassı epitel levha var. 2 günde kültürlerin beslemeye devam
11. TS hücreleri% 50 confluency (genellikle 15 ve 20 gün arasında) ulaştığınızda, PBS ile bir kez yıkayın ve 100 ml% 0.25 tripsin / EDTA ekleyin. Trypsinization sırasında yakın bir tek hücre süspansiyonu sağlamak için yukarı ve aşağı Pipet. Mitomisin C-MEF besleyiciler tedavi (2.5 x 10 ⁵ cells/6-well veya 5 x10 ⁵ cells/60mm plaka) içeren 6-iyi ya da 60mm plakalar yeni TS-70cm-1.5F4H ve transfer ekleyerek trypsinization durdurun.
12. Değişim ve orta 8 saat geçtikten sonra 2 gün her kültürleri beslemeye devam edin.
13. MEF besleyiciler bir veya iki pasajlar daha sonra (3-5 gün pasajlar arasında), TS hücreleri onlar olmadan kültür olabilir. MEFS trypsinization sonra TS hücrelerden daha çok daha hızlı kültür plaka takmak Çünkü, yapışık oranı böyle bir fark MEF besleyiciler TS hücreleri ayırmak için kullanılabilir. Kültür hücreleri geçtikten sonra 37 dakika süreyle 30 ° C,% 5 CO ₂ kuluçkaya yatmaktadır. En MEFS plaka takmak ve TS nüfus süspansiyon kalır. Yeni bir plaka süpernatantı aktarın. Saf bir TS nüfus elde etmek için çeşitli pasajlar bu işlemi tekrarlayın.
14. TS-70cm-1.5F4H TS hücreleri korumak ve her 4 gün geçmesine (1:10 - 1:20 bölünmüş) ya da kültürün% 70 confluency ulaşır. Yüksek yoğunluklu (01:05 bölünme daha yüksek) aşırı konfluent farklılaşma neden olabilir ya da kültür hücreleri geliyorsunuz.
15. TS hücrelerinin kimliğini bir hücre belirteci, Cdx2 (Şekil 3) immün teyit edilebilir.

Donma TS hücreleri

1. Dondurma orta olarak (% 50 FBS,% 30 TS orta ve% 20 DMSO) 2x hazırlayın.
2. Cotrypsinization tarafından llect TS hücreleri, 6 dakika süreyle santrifüj 450g. 2x dondurma orta eşit hacmi ile TS orta onları tekrar
3. , Yavaş yavaş -70, izopropil alkol odası kullanarak hücrelerin Freeze ° C ve 24-48 saat sonra sıvı azot transfer.
4. (Confluent% 70) 60 mm plaka genellikle 2 şişeleri tutulur.

TS hücreleri Çözülme

1. Flakon çözünme hızla 37 ° C, (450g, 6 dakika) santrifüj tarafından 10 ml TS medya onları toplamak ve% 30 TS medya, 70cm 1.5F4H tekrar süspansiyon haline getirin.
2. Hücrelerin Bir flakon, 60 mm plaka numaralı seribaşı.

TGC içine TS hücre farklılaşması

Trofoblast dev hücreler (TGCs) içine TS hücrelerin farklılaşması, MEF-CM, FGF4 ve heparin çekilmesi ile indüklenen olabilir. TGC fenotip (büyük çekirdekleri), dört gün indüksiyon sonra tespit edilebilir (Tanaka ve ark, 1998 ve Chiu ve ark 2008) . TGC farklılaştırılmış kültürü bu işaretleyici (Şekil 4A) p450scc, immün ifade algılar. PI Flow sitometrik analizi (propidium iyodür) boyanan hücreler daha yüksek DNA içeriği (Şekil 4B) içeren farklılaşmış hücrelerin varlığı gösterir. Bu sonuçlar, TS hücreleri polyploid TGCs haline endoreduplication geçmelerini öneriyoruz.

Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 fare uteri Diseksiyon. (A) uteri yeri oklarla gösterilir. (B) gösterildiği gibi, rahim ve serviks kavşak boyunca kesin. (C), over (OV) altında yumurtalık (OD) altında rahim kesin. Uteri (D) Görüntü.

Şekil 2 Temsilcisi resimleri fare blastosist, blastosist akıbet ve trofoblast koloni göstermektedir. (A) E3.5 toplanan bir fare blastosist gösterilmiştir. ICM, iç hücre kütlesi MT, duvar trophectoderm; PT, kutup trophectoderm. (B) MEF besleyiciler trofoblast akıbet gösterilmiştir. TS, trofoblast kök hücre. (C) trofoblast kök hücre kolonisi MEF besleyiciler açık bir kenar gösterir. Oklar hücre sınırı göstermektedir.

Şekil 3 analiz immün TS hücrelerinin belirlenmesi. TS (AD) ve ES (kontrol, EH) hücreleri işaretleyici kimlik tabi. Hücreler Oct4 (A, E) ya da Cdx2 (B, F) tanımak için antikorlar ile boyanmış ve birleştirilmiş görüntüler sunulan DAPI (C, G) (D, H) tarafından zıt. Ölçeği bar, 50 mm.

Şekil 4 TS hücrelerinin in vitro Farklılaşma. (A) kültür ayrım yapılmamış (Undiff) veya farklılaştırılmış (Diff) hücreleri, TGC bir marker ifade için incelenmiştir p450scc (yeşil), DAPI (kırmızı) ile zıt. (B) PI ile boyandı farklılaşmış hücrelerin, flow sitometrik analizi, DNA içeriği (M2, dörtten fazla kopya M1, 03:58 kopya) ölçer. M2 nüfusu polyploid trofoblast hücreleri temsil eder.

Discussion

Bu videoda, biz süreci TS hücre hatları kurmak için uteri ve deneysel prosedürleri E3.5 blastosist toplamak göstermektedir. Ayrıca stemness TS hücreleri korumak ve farklılaşmış hücrelerine farklılaşma ikna etmek için durumu açıklar. Saf TS hücre hatları elde etmek için iki kritik adımlar akıbet ayrıştırılmasıyla için zamanlama (adım 9) ve ilk geçiş işleme (adım 11). Bu geniş blastosist adım 11 (Kunath ve ark, 2005) TS kolonilerin adım 9 ya da aşırı çoğalma (>% 50 confluency) büyümek sonra ilkel endoderm kökenli hücrelerin kültür olarak ortaya çıkabilir bildirilmiştir. Ilkel endoderm kökenli hücrelerin ayırt edici morfolojisi TS hücrelere göre yuvarlak bir hücre şekli ve azaltılmış hücre-hücre teması ile tespit edilebilir rağmen TS ortamda iyi büyür ve yok, çünkü kültür bunları kaldırmak zordur MEF besleyiciler veya FGF4 gerektirecek gibi görünüyor.

Farklılaştırılmış TGCs TS kültür sürekli MEF-CM ve FGF4 varlığında bile ortaya çıkabilir. Saf bir TS nüfus isteniyorsa, bu farklılaşmış hücrelerin diferansiyel yapışık oranları bazında ayrılmış olabilir. Benzer MEFS için, TGCs 13. adımda açıklandığı gibi saf bir TS nüfus elde etmek için bir prosedür, TS hücreleri daha hızlı kültür plakaları eklemek. Alternatif TGCs çok yapışık ve trypsinization karşı daha dayanıklı olduğu için, saf bir TS nüfus askıya TS hücreleri toplama hızlı trypisinization (3 dk), tarafından elde edilebilir.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).