Summary
Il protocollo seguente delinea il processo di dissezione del pancreas per l'imaging fetta virtuale, e la successiva quantificazione di tutte le GFP-tagged beta-cellule del pancreas intero.
Abstract
Tracing cambiamenti di popolazioni di cellule specifiche in materia di salute e malattia è un obiettivo importante della ricerca biomedica. Il processo di monitoraggio pancreatiche beta-proliferazione delle cellule e la crescita delle isole è particolarmente impegnativo. Abbiamo sviluppato un metodo per catturare la distribuzione delle beta-cellule del pancreas intatto di topi transgenici con fluorescenza tag beta-cellule con una macro scritta per ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). In seguito a dissezione del pancreas e di compensazione dei tessuti, il pancreas intero è catturata come una fetta virtuale, dopo di che la GFP-tagged beta-cellule sono esaminati. L'analisi include la quantificazione del totale delle cellule beta zona, il numero di isole pancreatiche e distribuzione delle dimensioni con riferimento a parametri specifici e le posizioni per ogni isola e per piccoli gruppi di beta-cellule. L'intera distribuzione delle isole possono essere tracciati in tre dimensioni, e le informazioni dalla distribuzione delle dimensioni e della forma di ogni isolotto consente un confronto quantitativo e qualitativo dei cambiamenti nella complessiva delle cellule beta zona a colpo d'occhio.
Protocol
Parte 1: Preparazione dei campioni
- Posizionare il mouse al microscopio dissezione, rimuovere l'intero pancreas con il duodeno e la milza ancora attaccato, e posizionare gli organi su un vetrino pre-pesati. Rimuovere il duodeno, tagliando il suo tessuto connettivo lungo il lato dove è legato al pancreas. Tagliare e rimuovere il grasso in eccesso milza e il pancreas fino a quando il pancreas è completamente isolato nella diapositiva. (Grasso del pancreas è riconoscibile per il colore bianco, come differenziate dal colore leggermente più scuro e conciatore di tessuto pancreatico.)
- Posizionare un coprioggetto (copertura in vetro di grandi dimensioni 50x75mm; standard di copertura in vetro 25x75mm) sul pancreas in modo che sia interamente coperto. Usare un peso (ad esempio un libro pesante) per appiattire il pancreas tra la diapositiva e la sua copertina. A seconda del peso, appiattendo il pancreas dura circa cinque minuti.
- Togliere il peso. Se il pancreas è ben appiattito contro la diapositiva, è posto nel 4% paraformaldeide (PFA) a 4 ° C durante la notte. Al mattino, rimuovere il coprioggetto e ben esporre il pancreas intero PFA durante la giornata (6-8 ore). Se il pancreas non è ben fisso, permettono di rimanere nel PFA più a lungo, forse un giorno all'altro. Trasferire i vetrini al contenitore con l'1% Triton X-100 in tampone fosfato (PBS) durante la notte. Il giorno dopo, trasferimento le diapositive al contenitore di saccarosio saturi per 1-2 giorni. Poi trasferire le diapositive in un contenitore del 100% glicerolo fino a quando il tessuto viene cancellata, che permette la risoluzione ottimale di segnali fluorescenti; compensazione tessuto assume giorni circa 1-3. (I segnali fluorescenti possono persistere per settimane e anche mesi, ma l'imaging deve essere eseguita subito dopo il tessuto viene cancellata per la risoluzione ottimale.)
- Conservare il pancreas in una zona buia e fredda al fine di preservare l'organo ed i suoi segnali fluorescenti.
Parte 2: immagini e quantificare le cellule beta nel pancreas zona intatta
- Uso di pinze o guanti, prendere lo scorrimento fuori dal contenitore con il 100% glicerolo. Preparare il vetrino per l'imaging con l'annientamento fuori glicerolo in eccesso ed esclusivamente la pulizia del retro del vetro di copertura con etanolo.
- Aprire il software StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT) e selezionare la lente 2x obiettivo per i topi di imaging pancreas età superiore ai 3 settimane su grandi lastre di vetro, o le lenti dell'obiettivo 10x per i topi di imaging pancreas più giovane di 3 settimane pressato tra due lamelle 25 millimetri. Visualizzare l'immagine impostando a vivere immagine (Immagine → Foto Live). Selezionare un tempo di esposizione che mostra chiaramente la GFP-tagged beta-cellule. (Sottoesposizione dell'immagine esclude piccoli isolotti e beta-cellule, mentre sovraesporre l'immagine crea ulteriori falsi segnali.)
- Clicca un punto qualsiasi dello schermo per stabilire un punto di riferimento e procedere per disegnare un contorno di tutto il pancreas intero. Avviare il processo virtuale Slice (Immagine → Acquisire fetta virtuale). Determinare e selezionare le migliori cioè sul piano focale, l'aereo con il maggior numero di isole visibili e concentrati e beta-cellule della Z scorrendo la manopola di messa a fuoco. Una volta scelto, StereoInvestigator acquisisce automaticamente l'immagine visualizzata sullo schermo. Con la fase motorizzata, la funzione Slice virtuale cattura sequenziale ciascun pannello ottico come immagine distinta all'interno del contorno disegnato (fig. 1A) e quindi unisce tutti come un'unica immagine fusa (Fig. 1B). Di imaging fetta virtuale utilizza una configurazione epifluorescente filtri cioè widefield che permette alla fotocamera di catturare tutti i segnali presenti ad una certa profondità, compresi quelli non perfettamente a fuoco, in modo che la fetta finale virtuale è un sistema integrato di immagine bidimensionale che non è al massimo proiezione dalla ricostruzione tridimensionale del pancreas intero. Media virtuale scansione in tempo Slice è di 30 minuti per ogni campione, ma può richiedere fino a un'ora per un pancreas di grandi dimensioni.
- Dopo aver salvato l'immagine, inizia la sua analisi aprendo l'immagine con ImageJ. Quando finisce di caricare l'immagine e appare sullo schermo, aprire ed eseguire il Virtual macro analisi Slice ( supplementare materiale 1 ).
- Seguire passo per passo le istruzioni fornite dal macro. Eliminare gli artefatti indesiderati creato dalla diffusione della luce con la "bacchetta magica" e "Select Area" strumenti. Controllare e sottrarre sfondo inutili dall'immagine. Determinare il raggio del più grande isolotto con lo strumento "Linea" in modo che la caratteristica conseguente Rolling Ball può rimuovere efficacemente la luce autofluorescenza e dispersi. Test e selezionare il più appropriato "Bassa Soglia" per catturare i segnali fluorescenti di isolotti e cluster di beta-cellule (<3x10 4 micron 2). Test e selezionare il più appropriato "Soglia alta" per catturare i segnali fluorescenti di isolotti. Eseguire la quantificazione del Slice virtuali, che misureràe produrre un elenco di zona isolotto, il perimetro, circolarità, e il diametro di Feret.
Figura 1A virtuale immagine Fetta di analisi l'intera distribuzione delle beta-cellule in un pancreas adulto intatto
Immagini dei singoli pannelli ottico di un pancreas topo maschio a 10-settimana presa con un obiettivo 2x. Le immagini comprendono l'intera distribuzione di isolotti, anche piccoli gruppi di beta-cellule (<10 cellule).
Figura 1B virtuale immagine Fetta di analisi l'intera distribuzione delle beta-cellule in un pancreas adulto intatto
Una fetta unificato virtuale con il pancreas dorsale a destra e il pancreas ventrale a sinistra. Barra di scala è 5 mm.
Rappresentante Risultati
Preparazione di un pancreas avanzato per l'imaging fetta virtuale consentirà di quantificare efficace di tutte GFP-tagged beta-cellule del pancreas in un intero come immagine fetta virtuale con isolotti chiare e distinte. Successo di imaging fetta virtuale del pancreas intero in situ fornisce i mezzi per esaminare e quantificare le beta-cellule, non solo zona isolotto individuale e totale, ma anche distribuzione delle dimensioni delle isole, l'analisi regionale, e modelli di crescita pure. Mentre ImageJ mantiene la capacità di rilevare tutti i beta-cellule contemporaneamente l'analisi delle immagini Slice virtuali, può anche controllare quali beta-cellule per quantificare limitando l'analisi alle dimensioni isolotto certo (per area o diametro), o per posizione. Una analisi standard esclude per esempio gli artefatti, detriti più piccoli di un singolo beta-cellule (<170 micron 2) e registra l'area, il perimetro (la distanza che circonda una zona), la circolarità (un grado di rotondità, dove 1.0 rappresenta un cerchio perfetto), e del diametro Feret (la distanza più lunga in uno spazio) per ogni isolotto rilevato. Analisi fetta virtuale è in grado di migliorare le immagini fetta virtuale utilizzando segmentazione Watershed, che distingue e separa isolotti sovrapposizione in isolotti individuali in base al loro forme. L'analisi produce inoltre una serie di immagini dettagliate; questo include le maschere delle immagini sotto le due intensità bassa e alta (Fig. 1C), uno schema di tutte le isolette presunte, che sono singolarmente numerati ed elencati in una tabella di informazioni corrispondenti (Fig. . 1D), e l'immagine originale fetta virtuale (Fig. 1B). Si noti che polarizzazione potenziale tecnico per la scelta dei valori di soglia possono inclinare la quantificazione delle isole includendo luce circostante gratuita strutture di grandi dimensioni, o riducendo il numero totale di isole, i segnali deboli soprattutto da piccole particelle.
Figura 1C virtuale immagine Fetta di analisi l'intera distribuzione delle beta-cellule in un pancreas adulto intatto
Una maschera delle particelle fluorescenti nella fetta virtuale. Codici colori: [1] blu: fluorescenza a bassa intensità; [2] verde: fluorescenza intensità intermedia; e [3] rosso: a fluorescenza ad alta intensità.
Figura 1D virtuale Fetta di analisi delle immagini l'intera distribuzione delle beta-cellule in un pancreas adulto intatto
Quantificazione degli isolotti singoli / gruppi di beta-cellule. Si noti che ogni isolotto (tra cui piccoli gruppi di cellule beta) è numerata, con le sue informazioni in un grafico corrispondente. Quattro parametri sono stati presi per ogni struttura: (1) zona; (2) perimetro, (3) circolarità: un grado di rotondità, dove il numero 1.0 rappresenta un cerchio perfetto, e (4) Feret di diametro: la distanza più lunga all'interno di un'area. Si noti che # 706 visualizza la risoluzione di analisi con una superficie di poche cellule beta. Segmentazione spartiacque rileva gruppi di isolotti adiacenti, come quella mostrata, e si distingue opportunamente come isolotti distinti (isolotti 1554, 1555, e 1556).
Figura 1E virtuale immagine Fetta di analisi l'intera distribuzione delle beta-cellule in un pancreas adulto intatto
3-dimensionale trama dell'analisi fetta virtuale, con assi di area, perimetro, e il diametro di Feret. Ogni punto rappresenta un isolotto.
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Discussion
L'analisi delle immagini fetta virtuale di isole e cellule beta nel pancreas cluster intatto offre una grande vista l'intera distribuzione delle isolette. Sviluppi e cambiamenti nella distribuzione delle isole totale nel corso del tempo può quindi essere studiati e confrontati. Un esempio è dimostrato nella nostra analisi della formazione di isole pancreatiche (1). Un analisi completa delle neonatale pancreas topi in vari momenti (P1-P21) ha dimostrato che le isole sono formate da fissione. Mentre il beta-proliferazione delle cellule si adatta con una funzione di densità di probabilità lognormale nei topi da P1-P10, la distribuzione isolotto dal P12 in poi devia a sinistra lontano dal modello lognormale, suggerendo un processo di fissione. Un'analisi simile è stata effettuata sullo sviluppo insulinoma progressiva nei topi, che dotato di una funzione lognormale con i parametri di posizione di picco e asse x scala e una distribuzione di legge di potenza (2): 
P (x) = ax y. I dati sono effettivamente presentati in tridimensionale appezzamenti della zona, perimetro e il diametro Feret (Fig. 1E). Per il nostro studio, i topi transgenici, in cui pancreatiche beta-cellule sono state geneticamente taggati con proteina fluorescente verde (GFP, 3, 4) sotto il controllo di insulina del mouse ho promotore (MIP), sono stati utilizzati. MIP-GFP può anche essere incrociati con altri topi transgenici specifici in studi futuri.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Lo studio è supportato da US Public Health Service Concessione DK-081527, 072473 e DK-DK-20595 per l'Università di Chicago Diabetes Centro di Ricerca e Formazione (Animal Models core), e un dono da parte della Fondazione Famiglia Kovler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
