Summary
Sanal kesit görüntüleme için aşağıdaki protokol pankreas diseksiyonu sürecini özetliyor ve sonraki tüm pankreas tüm GFP etiketli beta-hücrelerinin kantifikasyon.
Abstract
Sağlık ve hastalık belirli hücre popülasyonlarının değişiklikler İzleme biyomedikal araştırmanın önemli bir hedeftir. Izleme pankreatik beta hücre proliferasyonu ve adacık büyüme süreci, özellikle zor. Biz ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /) için yazılmış bir makro floresan etiketli beta-hücrelerinin transgenik farelerin sağlam pankreas beta-hücrelerinin dağıtım yakalamak için bir yöntem geliştirdiler. Tüm pankreas, pankreas diseksiyonu ve doku temizleme ardından sonra GFP etiketli beta-hücrelerinin incelenir, sanal bir dilim olarak yakalanır. Analiz miktarının toplam beta-hücre alanı, adacık sayısı ve boyutu dağılımı için her adacık beta-hücrelerinin küçük kümeleri için belirli parametreler ve yerleri referans içerir. Adacık tüm dağıtım üç boyutlu olarak çizilen, boyutu ve şekli her adacık dağıtım bilgileri bir bakışta genel beta-hücre alanındaki değişikliklerin niceliksel ve niteliksel karşılaştırma sağlar.
Protocol
Bölüm 1: Örneklerin Hazırlanması
- Diseksiyon mikroskobu altında bir fare koyun, hala bağlı duodenum ve dalak ile birlikte tüm pankreas kaldırmak ve önceden tartılmış bir cam slayt organları. Onikiparmak bağırsağı, pankreas bağlı olduğu kenarındaki bağ doku keserek çıkarın. Dalak ve pankreas aşırı yağ pankreas slayt tamamen izole kadar kesin ve çıkarın. (Pankreas yağ, pankreas dokusu ve biraz daha koyu ve bronzlaştırıcı bir renk ayırt beyaz renk ile ayırt edilebilir.)
- Tamamen kapalı şekilde pankreas üzerine bir lamel (standart kapak cam 25x75mm 50x75mm geniş cam kapak) yerleştirin. Slayt ve kapağı arasındaki pankreas düzleştirmek için bir kilo (ağır bir kitap gibi) kullanın. Pankreas düzleşme, ağırlığına bağlı olarak yaklaşık beş dakika sürer.
- Ağırlık çıkarınız. Pankreas slayt karşı iyi düzleştirilmiş ise% 4 paraformaldehid (PFA), 4 ° C gecede yerleştirin. Sabah lamelleri kaldırmak ve PFA için tüm pankreas gün (6-8 saat) sırasında maruz. Pankreas iyi sabit değilse, daha uzun süre kalır PFA muhtemelen gecede izin. % 1 ile konteyner Transfer slaytlar Triton fosfat x-100 (PBS) gece tamponlu salin. Ertesi gün, 1-2 gün için doymuş sakkaroz konteyner slaytlar transfer. Sonra floresan sinyallerin en uygun çözünürlüğü sağlar doku temizlenir kadar% 100 gliserol bir konteyner, slaytlar, doku temizleme yaklaşık 1-3 gün sürer. (Floresan sinyalleri hatta haftalar ve aylar sürebilir, ancak doku optimum çözünürlük görüntüleme temizlendikten sonra en kısa sürede yapılmalıdır.)
- Karanlık ve serin bir alanda pankreas organ ve floresan sinyalleri korumak için saklayın.
Bölüm 2: Görüntüleme ve sağlam pankreas beta hücre alanı niceleme
- Forseps veya eldivenli ellerini kullanarak,% 100 gliserol ile konteyner slayt çıkarmak. Aşırı gliserol silme ve sadece etanol ile arka kapak cam temizleme görüntüleme için slayt hazırlayın.
- StereoInvestigator yazılımı (MicroBrightField, Williston, VT) açın ve görüntüleme fareler için 2x objektif lens seçmek, 3 haftadan daha büyük cam slaytlar büyük pancreata veya görüntüleme fareler için 10x objektif lens iki 25mm lamelleri arasında sıkışan 3 hafta daha genç pancreata. (Image → Canlı Görüntü) görüntü yaşamak için ayarlayarak görüntü gözünüzde canlandırın. GFP etiketli beta-hücrelerinin açıkça gösteren bir pozlama süresi seçin. (Görüntü overexposing ek yanlış sinyaller oluşturur görüntü Underexposing, küçük adacıklar ve beta-hücrelerinin hariç.)
- Bir referans noktası oluşturmak ve tüm pankreasın etrafında bir kontur çizmek için devam etmek için ekrandaki herhangi bir yere tıklayın. Sanal Slice işlemi (Image → Sanal Dilim Edinme) başlatın. Belirlemek ve en iyi odak düzlemi, yani odak düğmesini kaydırarak Z ekseni üzerinde görünür ve odaklı adacıklar ve beta-hücrelerinin en fazla sayıda uçağın seçin. Seçildikten sonra, StereoInvestigator otomatik olarak ekranda görüntülenir görüntü yakalar. Motorlu bir sahne ile, Sanal Slice özelliği sırayla çizilmiş kontür (Şekil 1A) içerisinde ayrı bir görüntü olarak her optik panel yakalar ve sonra birleştirilmiş bir görüntü (Şekil 1B) olarak hepsini birleştirir. Sanal Dilim görüntüleme epifluorescent yapılandırmasını kullanır son Sanal Dilim maksimum entegre bir iki boyutlu bir görüntü o kadar kamera mükemmel bir odak değil, olanlar da dahil olmak üzere, belli bir derinlikte bulunan tüm sinyaller, yakalamanızı sağlar, yani widefield filtreleri tüm pankreas üç boyutlu rekonstrüksiyon projeksiyon. Ortalama Sanal Dilim tarama süresi örnek başına 30 dakika, ancak büyük bir pankreas için bir saat kadar sürebilir.
- Görüntüyü kaydettikten sonra, ImageJ ile görüntü açarak analizi başlar. Görüntünün yüklenmesi tamamlandıktan sonra ekranda göründüğünde, açık ve Sanal Dilim analiz makro (çalıştırmak Ek malzeme 1 ).
- Makro tarafından verilen adım adım talimatları uygulayın. "Sihirli Değnek" ve "Select Alanı" araçları ile ışık yayılımı tarafından oluşturulan istenmeyen eserler ortadan kaldırın. Görüntü gereksiz arka plan kontrol edin ve çıkarın. Izleyen Rolling Balo özelliği etkin otofloresans ve dağınık ışık kaldırmak ve böylece "Line" aracı ile en büyük adacık yarıçapı belirleyin. Küçük adacık beta-hücrelerinin ve kümelerin floresan sinyallerini yakalamak için en uygun "Düşük Eşik" Test ve seçmek (<3x10 4 mikron 2). Test ve adacıklar floresan sinyallerini yakalamak için en uygun "Yüksek Eşik" seçeneğini seçin. Sanal Dilim ölçecek miktarının, Çalıştırve adacık alan, çevre, dairesellik ve Feret çapı bir liste oluşturur.
Şekil 1A sağlam bir yetişkin pankreas beta-hücrelerinin tüm dağıtım Sanal Dilim görüntü analizi
10 haftalık bir erkek fare pankreas bireysel optik paneller Görüntüler 2x amacı altına alınmış. Görüntüleri tüm dağıtım, adacık beta-hücrelerinin (<10 hücre), hatta küçük kümeleri içerir.
Şekil 1B sağlam bir yetişkin pankreas beta-hücrelerinin tüm dağıtım Sanal Dilim görüntü analizi
Sağ dorsal pankreas ve sol ventral pankreas ile birleşik bir sanal dilim. Ölçek çubuğu 5 mm.
Temsilcisi Sonuçlar
Sanal Dilim görüntüleme için bir pankreas Yeterli hazırlık etkili bir ölçümü için izin GFP-açık ve seçik adacıklar Sanal Slice görüntü olarak bir bütün pankreas beta-hücrelerinin etiketli. In situ tüm pankreas Başarılı Sanal Dilim görüntüleme, sadece bireysel ve toplam adacık alan, ama aynı zamanda adacık boyut dağılımı, bölgesel analizi ve büyüme modelleri de beta-hücrelerinin, incelemek ve ölçmek için araçlar sağlar . ImageJ Sanal Dilim görüntüleri analiz tüm beta-hücrelerinin aynı anda tespit etme kapasitesine korur iken, aynı zamanda, belirli bir adacık boyutları (alan veya çapı) analiz kısıtlayan veya konuma göre ölçmek için beta hücreleri kontrol edebilirsiniz. Standart bir analiz eserler örneğin, tek bir beta-hücre (<170 mikron 2) ve kayıtları alan, çevre (bir alanı çevreleyen mesafe), dairesellik (1.0 mükemmel bir daire temsil yuvarlaklık bir derece) daha küçük moloz, dışlar ve her adacık Feret çapı (bir alanda en uzun mesafe) tespit edildi. Sanal Dilim Havza segmentasyon, istihdam şekillerine göre bireysel adacıklar halinde üst üste adacıklar ayıran ve ayıran sanal bir dilim görüntüleri artırmak analiz yeteneğine sahiptir. Bu analiz, daha ayrıntılı görüntüler bir dizi üretir; bu alçak ve yüksek yoğunluklu (Şekil 1C) hem de her biri ayrı ayrı numaralandırılır ve ilgili bilgiler bir tablo listelenir (Şekil altında görüntü maskeleri, tüm varsayılan adacıklar bir taslak içerir 1D) ve orijinal Sanal Dilim görüntü (Şekil 1B). Bu potansiyel teknik önyargı çarpık karşılıksız ışık da dahil olmak üzere büyük yapıları çevreleyen adacıkları miktarının, adacıklar, küçük parçacıklar, özellikle zayıf sinyaller toplam sayısını azaltarak eşik değerleri seçerken dikkat edin.
Sağlam bir yetişkin pankreas beta-hücrelerinin tüm dağıtım Şekil 1C Sanal Dilim görüntü analizi
Sanal dilim floresan parçacıkların bir maske. Renk kodları: [1] mavi: düşük yoğunluklu floresan; [2] yeşil: orta yoğunluğu floresan; ve [3] kırmızı: yüksek yoğunluklu floresan.
Resim sağlam bir yetişkin pankreas, beta-hücrelerinin tüm dağıtım 1D Virtual Dilim resim analizi
Bireysel adacıklar / beta-hücrelerinin kümeleri Niceleme. Her bir adacık (beta hücreleri küçük kümeler dahil olmak üzere) karşılık gelen bir grafik ayrıntılı bilgi sayılı olduğunu unutmayın. (3) daireselliği, (2) çevre (1) alanı: her yapı için dört parametre alındı yuvarlaklığını bir ölçüde sayısı 1.0 mükemmel bir daire temsil eder ve (4) Feret çapı: bir alan içinde en uzun mesafe. # 706 sadece bir kaç beta-hücrelerinin bir alana sahip analizleri çözünürlüklü ekranlara olduğunu unutmayın. Havza segmentasyon, bitişik adacık grupları gibi gösterildiği gibi algılar ve uygun ayrı adacıklar (adacıklar, 1554, 1555, ve 1556) gibi onları ayırır.
Şekil 1E sağlam bir yetişkin pankreas beta-hücrelerinin tüm dağıtım Sanal Dilim görüntü analizi
Alanı, çevre ve Feret çapı eksenleri ile 3 boyutlu sanal dilim analiz arsa. Her nokta bir adacık temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sağlam pankreas adacık beta-hücre kümeleri Sanal Dilim görüntüleri analiz adacıklar tüm dağıtım geniş çaplı bir görünüm sağlar. Gelişmeler ve zamanla toplam adacık dağıtım değişiklikleri inceledi ve mukayese edilebilir. Böyle bir örnek, pankreas adacık oluşumu (1) bizim analizde gösterilmiştir. Çeşitli zaman noktalarında (P1-P21) yenidoğan farelerin pancreata kapsamlı bir analiz adacıklar fisyon oluşturduğu olduğunu göstermiştir. Beta-hücre çoğalması, P1-P10 farelerde lognormal olasılık yoğunluk fonksiyonu uygun, P12 itibaren adacık dağıtım fisyon bir süreç düşündüren sola uzak lognormal desen sapma. Ilerici lognormal pik konumu ve x-ekseni ölçek parametreleri ile bir fonksiyonu olarak monte farelerde İnsulinoma geliştirme, ve bir güç hukuk dağılımı (2) Buna benzer bir analiz yapıldı: 
P (x) = ax y. Veri alanı, çevre ve Feret çapı (Şekil 1E) üç boyutlu araziler etkin bir şekilde sunulmaktadır. Pankreatik beta-hücrelerinin genetik yeşil flüoresan protein (GFP, 3, 4) ile etiketlenmiş edildiği çalışmada, transgenik fareler, fare insülin I organizatörü (MIP) kontrolü altında, kullanılan. MIP-GFP gelecekteki çalışmalarda diğer özel transgenik farelerin de geçilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Çalışma tarafından desteklenen ABD Kamu Sağlığı Servisi Hibe DK-081.527, DK-072.473, Chicago Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi (Hayvan modeller Core) Üniversitesi ve Kovler Aile Vakfı hediye DK-20.595.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
