Summary
다음 프로토콜은 가상 슬라이스 이미지에 대한 췌장 해부 과정을 설명하고, 전체 췌장에있는 모든 GFP - 태그 베타 세포의 후속 부량.
Abstract
건강과 질병의 특정 세포 인구의 변화를 추적하는 것은 생명 의학 연구의 중요한 목표입니다. 모니터링 췌장 베타 세포 증식과 아일릿 성장의 과정은 특히 도전이다. 우리는 ImageJ (rsb.info.nih.gov / 엘제이 /)에 대해 작성된 매크로와 형광 - 태그 베타 세포와 유전자 변형 생쥐의 췌장 손상에서 베타 세포의 분포를 캡처하는 방법을 개발했습니다. 췌장 해부 및 조직 삭제에 따라, 전체 췌장은 어떤 후 GFP - 태그 베타 세포 검사 있으며, 가상의 슬라이스로 캡처합니다. 분석 총 베타 세포 지역 아일릿 번호 및 각 아일릿과 베타 세포의 작은 클러스터에 대한 특정 매개 변수와 위치에 대한 참조와 크기 분포의 부량을 포함합니다. 아일 레츠의 전체 분포는 3 차원에 역모를, 각 아일릿의 크기와 모양에 대한 배포의 정보를 한 눈에 전체 베타 세포 분야에서 변화의 양적 및 질적 비교를 허용하실 수 있습니다.
Protocol
1 부 : 표본의 준비
- 해부 현미경 아래에 마우스를 놓고 여전히 첨부된 십이지장과 비장과 함께 전체 췌장을 제거하고 미리 무게 유리 슬라이드에 장기 장소. 그것은 췌장에 바인딩된 어디 측면을 따라 자사의 결합 조직을 절단하여 십이지장을 제거합니다. 췌장이 완전히 슬라이드에 고립된 때까지 췌장에있는 비장과 여분의 지방을 잘라 제거합니다. (췌장 지방은 췌장 조직의 약간 어두운 컬러와 태너에서 차별은 흰색 색상에 의해 구분됩니다.)
- 그것이 완전히 적용되도록 췌장을 통해, coverslip을 (표준 커버 유리 25x75mm 50x75mm 대형 커버 유리) 놓습니다. 슬라이드와 커버 사이의 췌장을 버리고 무게 (무거운 책을 예)를 사용합니다. 췌장을 평평화, 무게에 따라하면 약 5 분이 걸립니다.
- 무게를 벗어. 췌장은 슬라이드에 대해 잘 평평 경우 4 ° C 하룻밤에 4 % paraformaldehyde (PFA)에 놓으십시오. 아침에 coverslips을 제거하고 잘 날 (6~8시간) 동안 PFA로 전체 췌장을 폭로. 췌장이 잘 고정되지 않을 경우, 그것이 더 이상 PFA에 남아 아마도 하룻밤 수 있습니다. 1퍼센트로 컨테이너에 슬라이드를 전송 튼과 인산염의 X - 100 (PBS) 야간 호수 버퍼. 그 다음날, 1-2 일 동안 포화 자당의 컨테이너에 슬라이드를 전송합니다. 그렇다면 형광 신호의 최적 해상도를위한 수있는 조직이 해결이 될 때까지 100 % 글리세롤의 용기에 슬라이드를 전송, 조직 삭제는 약 1-3일 소요됩니다. (형광 신호도 주, 몇 달 동안 계속 수도 있지만 조직이 최적의 해상도 허가 후 이미징은 곧 수행되어야합니다.)
- 오르간과 형광 신호를 보존하기 위해 어둡고 시원한 지역에서 췌장을 저장합니다.
2 부 : 이미징 및 손상 췌장에있는 베타 세포 영역을 quantifying
- 포셉 또는 장갑 낀 손을 사용하여 100 % 글리세롤로 컨테이너의 슬라이드를 꺼내. 초과 글리세롤을 닦아 주네와 독점적으로 에탄올과 커버 유리의 뒷면을 청소하여 이미징에 대한 슬라이드를 준비합니다.
- StereoInvestigator 소프트웨어 (MicroBrightField, 윌리 스턴, VT)을 열고 이미징 생쥐에 대한 2X 객관적 렌즈를 선택 대형 유리 슬라이드 3 주 이상 이전 pancreata, 또는 이미지 마우스에 대한 10X 목표 렌즈 두 25mm coverslips 사이에 누를 삼주 미만 pancreata. 그것이 (이미지 → 라이브 이미지) 이미지를 살고 설정하여 이미지를 시각화. 명확하게 GFP - 태그 베타 세포를 보여주는 노출 시간을 선택합니다. (이미지를 overexposing하면 추가 잘못된 신호를 생성하는 동안 이미지를 Underexposing하면 작은 아일 레츠 및 베타 세포에서 제외됩니다.)
- 기준점을 설정하고 전체 췌장 주위에 윤곽을 그리는 진행 화면에 아무 곳이나 클릭합니다. 가상 슬라이스 작업 (이미지 → 가상 슬라이스를 취득)를 시작합니다. 최고의 초점 평면 즉, 초점 노브를 스크롤하여 Z 축에 표시하고 집중 아일 레츠와 베타 세포의 가장 높은 숫자가있는 비행기를 확인하고 선택합니다. 일단 선택, StereoInvestigator는 자동으로 화면에 표시되는 이미지를 캡처합니다. 전동 무대로 가상 슬라이스 기능은 순차적으로 그려진 등고선 (그림 1A) 내에서 뚜렷한 이미지로 각 광 패널을 캡처하고 다음 하나 통합 이미지 (그림의 1B)로 그들을 결합합니다. 가상 슬라이스 영상은 epifluorescent 구성을 사용하는 최종 가상 슬라이스가 최대되지 않은 통합 2 차원 이미지 수 있도록 카메라가 아니라 완벽하게 초점을 포함하여 특정 깊이에서 현재 모든 신호를, 캡처 수 있습니다 즉, 위드 필터 전체 췌장의 3 차원 재건의 투영. 평균 가상 슬라이스 스캔 시간은 샘플 30 분이지만, 대형 췌장에 대한 시간까지 걸릴 수 있습니다.
- 이미지를 저장 후, ImageJ와 이미지를 개방하여 분석을 시작합니다. 이미지가 로딩을 완료하고 화면에 나타나면, 열고 가상 슬라이스 분석 매크로 (실행 보충 자료 1 ).
- 매크로에서 제공하는 단계별 지침을 따르십시오. "매직 원드"과 "선택 영역"도구를 사용하여 빛의 산란에 의해 만들어진 원치 않는 아티팩트를 제거합니다. 이미지에서 불필요한 배경을 확인하고 뺍니다. 장인 롤링 볼 기능이 효과적으로 autofluorescence 및 흩어져 빛을 제거할 수 있도록 "라인"도구를 사용하여 가장 큰 아일릿의 반경을 결정합니다. 베타 세포의 작은 아일 레츠와 클러스터의 형광 신호를 캡처하는 가장 적절한 "낮은 임계값을"테스트를 선택합니다 (<3x10 4 μm의 2). 아일 레츠의 형광 신호를 캡처하는 가장 적절한 "고 한계"를 테스트하고 선택합니다. 측정되는 가상 슬라이스의 부량을 실행그리고 아일릿 면적, 둘레, 순환성, 그리고 Feret의 직경의 목록을 생산하고 있습니다.
손상 성인 췌장의 베타 세포의 전체 분포의 그림 1A 가상 슬라이스 이미지 분석
10 주에서 남성 마우스 췌장의 개별 광학 패널의 이미지 2X 목적에 따라 촬영. 이미지 아일 레츠의 전체 분포, 베타 세포 (<10 셀)의도 작은 클러스터를 포함합니다.
손상 성인 췌장의 베타 세포의 전체 분포의 그림 1B 가상 슬라이스 이미지 분석
오른쪽에있는 등 지느러미 췌장과 왼쪽에있는 복부 췌장과 통일된 가상 조각. 스케일 바 5mm이다.
대표 결과
가상 슬라이스 이미지에 대한 췌장의 능숙 준비의 모든 효과에 대한 부량 수 GFP - 태그를 명확하고 뚜렷한 아일 레츠와 가상 슬라이스 이미지로 전체 췌장의 베타 세포를. 현장에있는 전체 췌장의 성공적인 가상 슬라이스 영상뿐만 아니라 개인과 전체 아일릿 지역뿐만 아니라 아일릿 크기 분포, 지역 분석, 성장 패턴뿐만 아니라 검사와 베타 세포를 계량하는 방법을 제공합니다. ImageJ는 가상 슬라이스 이미지의 분석에서 동시에 모든 베타 세포를 감지하는 능력을 유지하는 동안, 또한 특정 아일릿 크기 (면적 또는 직경에 의해)로 분석을 제한, 또는 위치에 의해 계량하는 베타 세포를 제어할 수 있습니다. 표준 분석 유물 예를 들어, 하나의 베타 세포 (<170 μm의 2) 및 기록 영역, 경계 (주변 거리), 순환성 (1.0 완벽한 원형을 나타냅니다 진원도의 정도)보다 작은 파편을 제외 각 아일릿에 대한 Feret의 직경 (지역 가장 긴 거리) 발견했습니다. 가상 슬라이스 분석들은 모양에 따라 개별 아일 레츠에 중복 아일 레츠를 구분하고 구분 워터셰트 세그먼트를 채용하여 가상 슬라이스 이미지를 향상시킬 수 있습니다. 분석 더욱 자세한 이미지의 일련의 생산, 이것은 각각 개별적으로 번호와 해당 정보 테이블에 나열된 (그림 아르 낮은 높은 강도 (그림 1C) 모두에서 이미지의 마스크, 모든 추정 아일 레츠의 개요를 포함 . 1D), 그리고 원래 가상 슬라이스 이미지 (그림의 1B). 스큐 큰 구조를 둘러싼 무료의 빛을 포함하여 아일 레츠의 부량하거나, 아일 레츠, 작은 입자 특히 희미한 신호의 총 수를 줄임으로써 임계 값을 선택하면 그 잠재적인 기술 편견을합니다.
손상 성인 췌장의 베타 세포의 전체 분포의 그림 1C 가상 슬라이스 이미지 분석
가상 슬라이스의 형광 입자의 마스크. 색상 코드 : [1] 파란색 : 낮은 강도의 형광, [2] 녹색 : 중간 강도의 형광 및 [3] 빨간 : 높은 강도의 형광.
손상 성인 췌장의 베타 세포의 전체 분포의 1D 가상 슬라이스 이미지 분석을 그림
개인 아일 레츠 / 베타 - 세포 클러스터의 부량. 각 아일릿이 (베타 - 세포의 작은 클러스터를 포함) 해당 차트에 대한 자세한 정보는, 번호입니다. (3) 순환성 (2) 경계 (1) 면적 : 네 개의 매개 변수는 각 구조에 찍은 숫자 1.0는 완벽한 원형을 나타냅니다 진원도의 정도, 그리고 (4) Feret의 직경 : 지역 가장 긴 거리. # 706은 몇 베타 세포의 면적 분석 해상도를 표시합니다. 워터셰트 세분화는 그림과 같이 인접 아일 레츠 그룹을 감지하고 적절하게 독특한 아일 레츠 (아일 레츠 1554, 1555 및 1556)로 그들을 구별.
손상 성인 췌장의 베타 세포의 전체 분포의 그림 1E 가상 슬라이스 이미지 분석
면적, 둘레, 그리고 Feret의 직경 축과 가상 슬라이스 분석 3 차원 플롯. 각 점은 아일릿을 나타냅니다.
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Discussion
손상 췌장에서 아일 레츠와 베타 세포 클러스터의 가상 슬라이스 이미지의 분석 아일 레츠의 전체 분포의 대규모보기를 제공합니다. 개발 및 시간이 지남에 따라 전체 아일릿 분포의 변화에 따라서 공부하고 비교할 수 있습니다. 이러한 예제는 췌장 아일릿 형성 (1) 우리의 분석에 증명됩니다. 여러 시간 지점 (P1 - P21)에서 신생아 쥐 pancreata의 포괄적인 분석 아일 레츠는 분열에 의해 형성되는 것을 보여주었다. 베타 세포 증식은 P1 - P10에서 마우스의 lognormal 확률 밀도 함수와 부합하지만, P12 이후부터 아일릿 배포는 분열의 과정을 제안, 왼편쪽에 떨어진 lognormal에서 사라지는. 유사한 분석은 진보적 피크 위치와 X 축 스케일의 매개 변수 lognormal 기능을 장착 마우스의 insulinoma 개발, 그리고 전원 법 배포 (2)에서 수행되었습니다 
P (X) = 도끼 Y. 데이터를 효과적으로이 지역 주변과 Feret의 직경 (그림 1E)의 세 차원 플롯에 제공됩니다. 췌장 베타 세포가 유전자 녹색 형광 단백질 (GFP, 3, 4)로 태그가되었던 우리의 연구, 유전자 변형 마우스에 대한 마우스 인슐린 나는 발기인 (MIP)의 통제가 사용되었습니다. MIP - GFP는 또한 미래의 연구에 다른 특정 유전자 변형 생쥐와 교차 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
연구는에서 지원하는 미국 보건 서비스 그랜트 DK - 081527, DK - 072473 시카고 당뇨병 연구 및 교육 센터 (동물 모델 코어) 대학 및 Kovler 가족 재단에서 선물 DK - 20595.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
