Análisis de la expresión génica en el barrenador esmeralda del fresno ( Agrilus planipennis) Utilizando Real-PCR cuantitativa en tiempo

Summary

Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) es una herramienta eficaz para el diagnóstico de los niveles de mRNA en tejidos de insectos y diferentes etapas de desarrollo. En este informe se muestra el uso de QRT-PCR para determinar los niveles de ARNm en diferentes tejidos y estadios de desarrollo larvario de las especies de insectos invasores, el barrenador esmeralda del fresno.

Abstract

Barrenador esmeralda del fresno (EAB,

Protocol

El protocolo completo con las diferentes etapas se ilustra en el diagrama de flujo en la Figura 1. Medidas individuales que constituyen la disección, extracción de ARN, la síntesis de cDNA primer lugar y QRT-PCR se detallan a continuación.

I. La disección de larvas

1. Antes del inicio de este procedimiento, el lugar barrenador esmeralda del fresno, o BEF, las larvas de un pañuelo de papel húmedo hasta que se llevan a cabo disecciones. Mantenga fresco fosfato preparado 1X solución salina tamponada, o PBS, en el hielo para mantener frío el buffer a través de la disección.
2. Para empezar, fijar las larvas de EAB en la placa de la disección con alfileres la disección fina. A continuación, agregue frío PBS 1X a la placa de disección.
3. En primer lugar, decapitar a las larvas con un buen par de tijeras de disección. Posteriormente eliminar el último segmento abdominal de las larvas.
4. Con un par de pinzas de relojero, levantar la cutícula de la canal, las larvas. Luego, hacer una incisión a lo largo de la longitud de la carcasa con un par de tijeras. Tenga cuidado de no romper la tripa como la incisión se hace.
5. Cuidadosamente aislar el tejido del intestino medio de otros tejidos como los órganos de grasa y tejido conectivo. Luego, enjuague el tejido fresco en tampón PBS 1X para asegurarse de que no hay contaminación de fatbody. Transferir el intestino aislado a 500 l de pre-enfriado reactivo Trizol en un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
6. A continuación, aislar el tejido de grasa corporal el uso de fórceps y transferirlo a un tubo Eppendorf de 1,5 ml que contiene 500 l de reactivo Trizol refrigerados.
7. Por último, aislar el tejido cutícula de la carcasa de larvas en un desguace de los tejidos adheridos, teniendo cuidado de no dañar la integridad del tejido. Enjuague el tejido cutícula aisladas en fresco tampón PBS y transferirlo a un tubo Eppendorf de 1,5 ml con 500 l de reactivo Trizol refrigerados.
8. Los tejidos aislados de grasa corporal, la cutícula y el intestino medio pueden ser almacenadas a -80 ° C hasta la extracción de RNA.
9. En preparación para la extracción de ARN, más o menos las muestras de EAB diferentes de acuerdo a las etapas de desarrollo. Estas etapas incluyen primero, segundo, tercero, y cuarto, estadios, prepupas y adultos.

II. La extracción de RNA (como el protocolo del fabricante por s para el uso del reactivo Trizol)

Homogeneización

1. Para comenzar la extracción del ARN, utiliza por primera vez morteros de plástico a fin de homogeneizar los tejidos del Trizol con tubos Eppendorf de 1,5 ml. Después de la homogeneización, un volumen total de cada ml de muestra a 1 con el reactivo Trizol.
2. Para las etapas de desarrollo, homogeneizar animal entero en nitrógeno líquido con un mortero. A continuación, agregar una alícuota del homogeneizado (50 mg) a 1 ml de Trizol.

De separación de fases:

3. Incubar los tubos de muestra con 1 ml de Trizol durante 15 minutos a temperatura ambiente.
4. Después de la incubación, añadir 200μL de cloroformo a cada tubo. Inmediatamente después de la adición de cloroformo, agitar los tubos vigorosamente durante 15 segundos. A continuación, se incuban los tubos a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
5. A continuación, centrifugar las muestras a 12.000 xg durante 15 minutos a 2 ° C. Después de la centrifugación, el ARN estará en la fase acuosa. El volumen de la fase acuosa debe ser de 600 l, o el 60% del volumen total de Trizol.

ARN precipitación

6. Retire con cuidado sólo la fase acuosa. Presencia de sustancias por debajo de la fase acuosa se produzca una contaminación de la ARN extraído. Entonces, la transferencia de la fase acuosa a un tubo debidamente etiquetado eppendorf de 1,5 ml.
7. Para precipitar el ARN de la fase acuosa, la mezcla 0,5 ml de alcohol isopropílico para cada tubo. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, los tubos de centrifugación a 12.000 xg durante 10 minutos a 2 ° C.

Lave ARN

8. Tras la centrifugación, descartar el sobrenadante de los tubos. ARN está presente en la pastilla de gel formado en la parte inferior del tubo. Lavar el sedimento con etanol 75%, añadiendo al menos 1 ml de etanol al 75% por cada 1 ml de Trizol. Mezclar mediante agitación. A continuación, centrifugar los tubos a 7500Xg durante 5 minutos a 2 ° C.

ARN de elución

9. Descartar el sobrenadante de los tubos. Centrifugar los tubos de nuevo en la centrífuga pequeña mesa durante 1 minuto. Elimine cualquier exceso de sobrenadante del tubo con la pipeta con cuidado. Dejar el tubo abierto y que el aire de pellets secos durante 5-10 minutos. Tenga cuidado de no secar el pellet ya que esto disminuirá significativamente su solubilidad.
10. Después de secado al aire, resuspender el precipitado en dietilpirocarbonato o DEPC, el agua tratada. La cantidad de agua que se utiliza para volver a suspender el pellet dependerá del tamaño de la pastilla. Utilice 50 l de agua DEPC tratada por un smtodos l pellet o 100 para una pastilla grande. Deje que la pastilla se disuelve por completo en el agua tratada DEPC moviendo la punta de la pipeta hacia arriba y abajo varias veces.
11. Una vez que la pastilla se haya disuelto, coloque la muestra a 55 ° C durante 10 minutos.
12. A continuación, medir la concentración de cada muestra de ARN utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (2 l de la muestra de ARN).
13. Almacenar las muestras de ARN a -80 ° C hasta su uso posterior.

III. Primer capítulo de cDNA de síntesis (como el protocolo del fabricante por s utilizando superíndices botiquín de primeros capítulo de síntesis de Invitrogen.)

1. Para cada muestra de ARN añadir lo siguiente en un tubo de PCR:

   ARN	x l
   10 mM dNTP mix M	1μl
   Oligo (dT) (0,5 mg / l)	1 l
   DEPC agua tratada	(8-x) l
   Volumen total:	10 l
   Nota: x es el volumen de ARN utilizado para la síntesis de cDNA. Dependiendo de la concentración de la ARN, 2.3 g de ARN se utiliza para cada reacción y el volumen total de cada reacción debe ser de 10 l.

2. Coloque la mezcla de reacción anterior en un termociclador a 65 ° C durante 4 minutos.
3. Retire los tubos de la theromocyler y colocarlos en hielo inmediatamente a por lo menos 2 minutos.
4. Preparar el primer capítulo de la mezcla maestra, añadiendo lo siguiente:

   10X Buffer RT	2μl
   25 mM de MgCl 2	4 l
   0,1 M TDT	2 l
   RNasa a cabo	1 l

5. Añadir 9 l de mezcla maestra a cada tubo con la muestra de ARN, mezclar por pipeteado y centrifugar brevemente la mezcla.
6. Coloque los tubos de nuevo en el termociclador e incubar durante 2 minutos a 42 ° C.
7. Pausa en el termociclador y añadir 1 l de superíndice II enzima transcriptasa inversa (Invitrogen) a cada tubo. Este paso se debe hacer rápidamente.
8. Incubar las muestras a 42 ° C durante 1,5 horas.
9. Terminar la reacción a 70 ° C durante 15 minutos.
10. Retire los tubos del termociclador y colocarlos en hielo.
11. Añadir 1 l de RNasa H a cada tubo y coloque de nuevo en el termociclador a 37 ° C durante 20 minutos.
12. Después de tomar las muestras del termociclador, se añaden 20 l de agua libre de nucleasa en cada tubo. El volumen de cada muestra se duplica en esta etapa.
13. Comprobar la concentración de cada muestra mediante el uso de 2 l de la muestra. Tomar alícuota de cada muestra, para que la concentración de 20ng/μl para su uso en QRT-PCR. La cantidad de agua que conforman las muestras a una concentración de 20ng/μl dependerá de la concentración inicial del cDNA sintetizado.

IV. QRT-PCR:

Primer diseño y determinación del gen de referencia

1. Cartillas de diseño con una temperatura de fusión (Tm) de 60 ° C y un tamaño de producto de 100 pb ~.
2. AP-PERI1 se utiliza como el gen de interés para este experimento. Un gen de referencia o de control interno es necesaria para su posterior análisis y la normalización de los datos. Proteína ribosomal (AP-RP1) se utiliza como gen de referencia para este experimento.
3. Prepare 5um acciones de trabajo de los cebadores que se utilizarán, incluyendo el gen de referencia.

Preparación de las normas

4. Con el fin de calcular la eficiencia de los cebadores utilizados normas debe hacerse.
5. Haga una mezcla de cDNA a partir de las diferentes muestras que se probarán.
6. Hacer diluciones seriadas 5 veces para cada punto deseado en el gráfico. Cuatro diluciones debe ser suficiente, pero cinco son muy recomendables.
7. El volumen puede variar dependiendo de la cantidad de puntos y el número de repeticiones técnica se están utilizando. No debería ser suficiente para hacer una norma para cada gen se está probando que incluye el gen de referencia.

Placa de plantilla

8. Diseño de una plantilla que indica el nombre de la muestra para cada pozo de la placa de QRT-PCR. Recuerde que debe incluir normas para cada gen y por lo menos dos técnicos repeticiones por muestra.

Configurar los parámetros de ciclismo

9. Apague la máquina QRT-PCR y entre en los parámetros de la bicicleta. Los parámetros de los ciclos para este experimento es el siguiente:
   Paso 1:
   • 1 ciclo: 95 ° C 3 minutos
   Paso 2:
   • 40 ciclos: 95 ° C 15 segundos seguido de 60 ° C 30 seg
     (Opcional: para la determinación de la curva de fusión de las siguientes etapas)
   Paso 3:
   • 1 ciclo: 95 ° C 1 min
   Paso 4:
   • 1cycle: 55 ° C 1 min
   Paso 5:
   • 81 ciclos: 55 ° C 30 seg

Plato preparado para CFX96 (BioRad) de la máquina

11. Prepare la mezcla maestra para cada gen (que incluye el gen de referencia) en el tubo por separado. Para cada bien, la mezcla maestra se compone de

    Nucleasa agua libre	2μl
    2,5 X SYBR verde	4 l
    Cebador directo	1 l
    Cebador inverso	1 l
    Volumen total	L 8

12. Durante la preparación de la mezcla maestra incluyen 1-2 reacciones adicionales para dar cuenta de los errores de pipeteo.
13. De acuerdo con la plantilla previamente diseñada, añadir 2 l (20 ng / mL) de cDNA a cada pocillo. A continuación, agregue 8 l de la mezcla maestra para cada pozo, lo que resulta en un volumen total de 10 l por reacción.
14. Pipeta de arriba a abajo (2-3x) para asegurarse de que la muestra esté bien mezclado. Compruebe que el líquido no se mantiene en la punta. Para evitar la contaminación cruzada, use una punta nueva para cada muestra.
15. Una vez que toda la placa está configurada, cubrir la placa con cinta óptica. Evite tocar la cinta como la presencia de grasa puede afectar la lectura. A continuación, se centrifuga la placa a 500 rpm durante 1 minuto para asegurar que todos los productos de los pozos se encuentran en la parte inferior de la placa.
16. Después de la centrifugación, compruebe que no hay hielo o agua en la parte inferior de la placa. Por último, coloque la placa en la máquina de QRT-PCR y ejecutar el programa de PCR.

V. Representación esquemática del experimento

Figura 1: Diagrama de flujo que representa el orden secuencial de los pasos para el estudio de la expresión génica.

Figura 2: A) las larvas de EAB disección del intestino medio que muestra en el centro. B) aislados del intestino medio de larvas de EAB

Figura 3: A) Los valores medios de expresión relativa (revoluciones) de un gen peritrophin (AP-PERI1) en diferentes tejidos incluyendo la cutícula larval (Cu), intestino medio (MG) ​​y cuerpos grasos (FB). Un EAB específicas proteína ribosomal (en adelante llamado, AP-RP1) se utilizó como control interno para la normalización de los datos obtenidos para el gen de interés, AP-PERI1. B) Cambio relativo pliegue de la AP-PERI1 en los tejidos de las larvas. El tejido de la cutícula mostró la menor expresión y por lo tanto, se tomó como el calibrador (1X) de la muestra (Pfaffl, 2001).

Figura 4: A) Los valores medios de expresión relativa (revoluciones) de un gen peritrophin (AP-PERI1) en diferentes etapas de desarrollo de esta plaga incluyendo estadios larvales (1 º, 2 º, 3 º y 4 º), prepupas (PP) y adultos (A). Una proteína específica EAB ribosomal (AP-RP1) se utilizó como control interno para la normalización de los datos obtenidos para el gen de interés, AP-PERI1. B) Cambio relativo pliegue de la AP-PERI1 en diferentes etapas de desarrollo. La muestra de PP mostró el menor nivel de los niveles de ARNm y por lo tanto se tomó como el calibrador (1X de la muestra).

VI. Conclusión

Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) es una herramienta eficaz para el diagnóstico de los niveles de mRNA en tejidos de insectos y diferentes etapas de desarrollo. Además, QRT-PCR ha sido principalmente la herramienta clave para validar los datos generados a partir de análisis de alto rendimiento expresión génica como los microarrays y la nueva generación de ARN Seq-.

Discussion

Los ciclos de umbral (Ct) se obtiene el valor de cada muestra en la placa de QRT-PCR. Para la toma de la curva estándar, el valor de Ct obtenidos para cada dilución se traza contra el registro de su concentración. Los valores de Ct de las muestras experimentales se trazaron en esta curva de dilución estándar de la serie. Cantidades de destino se calcula a partir de separar las curvas de calibración generadas para cada tejido es decir, la experimentación y expresión del desarrollo. Los valores relativos de expresión (revoluciones) se determinaron luego de dividir las cantidades de la secuencia diana de interés (en este caso AP-PERI1) con la cantidad obtenida para el control interno (AP-RP1). Para los cálculos de importancia, los registros de las revoluciones para cada gen fueron analizados por ANOVA (análisis de varianza) utilizando el procedimiento PROC MIXED de SAS (SAS Institute Inc. SAS / STAT usuario s Guide, Version 9.1). Importancia en el nivel de expresión se determinó a p <0,05. Los cambios relativos veces en el caso de los tejidos se calcula tomando la muestra de la cutícula como el calibrador (1X muestra, Pfaffl, 2001). Por lo tanto, los niveles de expresión en los órganos de intestino y la grasa en relación con la cutícula. En el caso de la expresión del desarrollo, la muestra prepupal se tomó como el calibrador. En ambos estudios, dos réplicas biológicas y tres repeticiones técnica se utilizaron.

Nuestra experiencia revela de forma significativa (p <0,05) los niveles más altos de la AP-PERI1 transcripción en el tejido del intestino medio (Fig. 3) en comparación con otros tejidos ensayados. Durante el desarrollo de las etapas de alimentación (es decir, los estadios larvales y adultos) fueron significativamente (p <0,05) mayor que la muestra prepupas (Fig. 4). Los niveles de ARNm por lo menos se calcularon para las cutículas y prepupas (Figuras 3 y 4). Teniendo en cuenta que peritrophins son parte integrante del intestino medio del insecto nuestros resultados corroboran los resultados anteriores en otras especies de insectos (Mittapalli et al. 2007). Los patrones observados durante las etapas de desarrollo confirman aún más la función de la AP-PER1 en la digestión y los procesos relacionados. El ampliamente utilizado Bacillus thuringiensis (Bt), toxinas en los cultivos de hecho objetivo e interrumpir la PM en los insectos (Pauchet et al., 2009). Por lo tanto, los resultados obtenidos en este estudio no sólo podría revelar los posibles objetivos de control de esta plaga, sino también proporcionar los conocimientos fundamentales en cuanto a cómo la invasión de especies de insectos se adaptan a sus nuevos ambientes.