Summary
Kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR) mRNA düzeyleri farklı böcek doku ve gelişim evreleri teşhis etmek için etkili bir araçtır. Bu yazıda farklı larva dokularında tespit mRNA düzeyleri ve istilacı böcek türlerinin, zümrüt kül delici gelişim evreleri QRT-PCR kullanımı göstermektedir.
Abstract
Emerald kül delici (EAB,
Protocol
Farklı adımlar ile tam protokolü akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Diseksiyonu oluşturan bireysel adımlar, RNA ekstraksiyon, İlk Strand cDNA sentezi ve QRT-PCR aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
I. Larvaların Diseksiyon
- Bu prosedürün başlaması, yer Emerald kül delici veya EAB, nemli kağıt mendil larvaları önce diseksiyonu kadar. Taze hazırlanan 1X fosfat diseksiyonu boyunca tampon soğuk tutmak için buz üzerinde, ya da PBS, tamponlu salin tutun.
- Başlamak için, ince diseksiyon iğneli diseksiyon plaka üzerinde EAB larvaları düzeltin. Daha sonra, diseksiyon plaka soğuk 1X PBS ekleyin.
- İlk olarak, iyi bir çift ile diseksiyon makas larvaları başını kesmek. Daha sonra larva son karın segment çıkarın.
- Forseps bir saatçi çifti kullanarak, larva karkas manikür kaldırın. Sonra bir makas kullanarak karkas uzunluğu boyunca bir kesi yapmak. Kesi yapılır rüptürü bağırsak dikkat çekin.
- Midgut dokusu, yağ organları ve bağ dokusu gibi diğer dokulardan dikkatle izole eder. Daha sonra, taze 1X PBS fatbody kirlenme var olduğundan emin olmak için doku durulayın. 1.5 ml Eppendorf tüp önceden soğutulmuş Trizol reaktifin 500 mcL izole midgut aktarın.
- Sonra, forseps kullanarak yağ vücut doku izole etmek ve soğutulmuş Trizol reaktif 500 mcL içeren 1.5 ml Eppendorf tüp içine aktarın.
- Son olarak, doku bütünlüğü zarar vermemeye özen kalarak, herhangi bir doku hurdaya larva karkas kütikula doku izole eder. Taze PBS izole manikür doku durulayın ve soğutulmuş Trizol reaktif 500 mcL ile 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarın.
- Vücut, manikür ve midgut izole yağ dokuları -80 ° C kadar RNA ekstraksiyon saklanabilir.
- RNA ekstraksiyonu için hazırlanmasında, çeşitli EAB örnekleri gelişim aşamalarına göre sıralayabilirsiniz. Bu aşamalar, 1.-2., 3., ve 4. instars prepupae ve yetişkinler içerir.
II. RNA Ekstraksiyon (başına üretici s Trizol Reaktif kullanarak protokol olarak)
Homojenizasyon
- RNA Ekstraksiyon başlamak için, ilk Trizol içeren 1.5 ml Eppendorf tüpleri dokular homojenize plastik havan kullanabilirsiniz. Homojenizasyon sonra, her örnek 1'e mL Trizol reaktifi ile toplam hacmi getirir.
- Gelişimsel aşamaları için, bir havanda sıvı nitrojen içinde tüm hayvan homojenize. Sonra Homojenat bir kısım Trizol 1 mL (50 mg) ekleyin.
Faz ayırma:
- Oda sıcaklığında 15 dakika için 1 ml Trizol numune tüpleri ile inkübe edin.
- Inkübasyondan sonra, her tüpe kloroform 200μL ekleyin. Kloroform ekleyerek hemen sonra, tüpler yaklaşık 15 saniye boyunca kuvvetlice sallayın. Daha sonra, tüpler oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin.
- Ardından, 2 ° C'de 15 dakika boyunca 12.000 XG örnekleri santrifüj Santrifüj sonra, RNA sulu faz olacaktır. Sulu fazın hacmi 600 ul, ya da toplam Trizol hacmi% 60 olmalıdır.
RNA yağış
- Sadece sulu faz dikkatlice çıkarın. Sulu faz altındaki maddelerin varlığı çıkarılan RNA kontaminasyonu neden olacaktır. Sonra uygun bir şekilde etiketlenmiş 1.5 ml Eppendorf tüp içine sulu faz transfer.
- RNA, sulu faz hızlandırabilir her tüpe 0,5 ml izopropil alkol karışımı için. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Inkübasyondan sonra, 2 ° C'de 10 dakika 12.000 xg'de tüpler santrifüj
RNA yıkayın
- Santrifüj sonrasında tüplerin süpernatant atın. RNA tüpün alt kısmında oluşan jel gibi pelet mevcut. Trizol 1 ml başına% 75 etanol en az 1 ml ekleyerek, pelet% 75 etanol ile yıkayın. Vorteks ile karıştırın. Ardından, 2 ° C'de 5 dakika 7500Xg tüpler santrifüj
RNA elüsyon
- Tüplerinden süpernatant atın. 1 dakika için küçük bir tablo santrifüj tüpleri tekrar santrifüjleyin. Dikkatli pipetleme tüpten herhangi bir aşırı süpernatantı. Tüpün açık bırakın ve pelet hava 5-10 dakika kurumasını bekleyin. Çözünürlüğünü önemli ölçüde azalacaktır üzerinde pelet kuruması için dikkatli olun.
- Pelet hava Kuruduktan sonra tekrar süspansiyon diethylpyrocarbonate ya da DEPC, arıtılmış su. Pelet tekrar süspansiyon için kullanılan su miktarı, pelet boyutuna bağlı olacaktır. 50 mcL sm için DEPC arıtılmış su kullanınbüyük bir pelet için tüm pelet veya 100 mcL. Pelet tamamen birkaç kez pipet ucu aşağı yukarı hareket ve DEPC arıtılmış su içinde çözülür.
- Pelet çözünmüş sonra, 55 ° C'de 10 dakika için örnek bir yer.
- Sonra Nanodrop spektrofotometre (RNA örnek 2 mcL) kullanarak her bir RNA örnek konsantrasyonu ölçer.
- , -80 RNA örnekleri Mağaza ° C daha sonra kullanmak kadar.
III. İlk Strand cDNA sentezi (Invitrogen Üst Simge ilk iplikçik Sentez kiti kullanılarak başına üretici s protokolü gibi.)
- Her RNA örnek için PCR tüpü aşağıdaki ekleyin:
RNA x ul 10mM dNTP mix M 1μl Oligo (dt) (0.5 mg / ml) 1 ul DEPC su tedavi (8-x) ul Toplam Hacim: 10 ul Not: x cDNA sentezi için kullanılan RNA hacmi. RNA RNA konsantrasyonuna bağlı olarak, 2-3 mg her reaksiyon için kullanılan ve her bir reaksiyon toplam hacmi 10 ul olmalıdır. - 4 dakika 65 yaşında bir termalcycler Yukarıdaki reaksiyon karışımı ° C yerleştirin.
- Theromocyler tüpleri çıkarın ve en az 2 dakika boyunca hemen buz koyun.
- Aşağıdaki ekleyerek ilk iplikli master karışımı hazırlayın:
10X RT Tampon 2μl 25mm MgCl 2 4 ul 0.1M DTT 2 ul RNaz çıkışı 1 ul - RNA örnek içeren her tüp, pipeting karışım 9 ul ana karışımı ekleyin ve karışımı kısaca santrifüj.
- PCR tüpleri geri koyun ve 42 ° C'de 2 dakika boyunca inkübe
- Pause termalcycler ve her tüpe 1 ul Üstsimge II ters transkriptaz enzim (Invitrogen) ekleyin. Bu adım, hızla yapılmalıdır.
- Örnekleri, 1.5 saat boyunca 42 ° C'de inkübe edin.
- 70 ° C'de 15 dakika için reaksiyon sonlandırın.
- PCR tüpleri çıkarın ve buz üzerine koyun.
- Her tüpe 1 RNaz H ul ekleyin ve 37 termalcycler yerine geri ° C 20 dakika.
- PCR örnekleri alındıktan sonra, her bir tüp içinde 20 ul nükleaz içermeyen su ekleyin. Bu aşamada, her bir örnek hacmi iki katına çıkar.
- Örnek 2 ul kullanarak her bir numune konsantrasyonu kontrol edin. QRT-PCR kullanımı için 20ng/μl konsantrasyonu yapmak için, her bir numune kısım alın. 20ng/μl bir konsantrasyon örnekleri makyaj su miktarı ilk sentezlenen cDNA konsantrasyonuna bağlı olacaktır.
IV. Mah-PCR:
Primer Tasarım ve referans gen belirlenmesi
- 60 ° C ve ~ 100bp bir ürün boyutu bir erime sıcaklığı (Tm) Tasarım primerler.
- AP-PERI1 Bu deneyde ilgi gen olarak kullanılır. Daha sonra analiz ve veri normalleşmesi için bir referans gen ya da iç kontrol gereklidir. Ribozomal protein (AP-RP1) Bu deneme için referans gen olarak kullanılır.
- Referans gen dahil olmak üzere kullanılacak astar, 5uM çalışma stokları hazırlayın.
Standartların hazırlanması
- Standartları yapılabilir kullanılan primerler verimliliğini hesaplamak için.
- Farklı örnekleri test edilecektir cDNA bir karışımını olun.
- Grafikte istenen her nokta için 5X seri dilüsyonları olun. Dört dilüsyonları yeterli olacaktır, ancak beş son derece tavsiye edilir.
- Hacmi kaç puan ve kaç teknik çoğaltır kullanılan bağlı olarak değişir. Yeterli referans gen dahil olmak üzere test edilen her bir gen için bir standart olmalı.
Plaka Şablon
- QRT-PCR plaka, her bir kuyu için örnek adını gösteren bir şablon tasarlayın. Her bir gen için standartlar ve en az iki teknik örnek başına çoğaltır eklemeyi unutmayın.
Bisiklet parametrelerini ayarlamak
- Mah-PCR Makineyi açın ve bisiklet parametreleri girin. Bu deneme için bisiklet parametreleri aşağıdaki gibi:
Adım 1:- 1 döngüsü: 95 ° C'de 3 dakika
- 40 döngü: 95 ° C 15 saniye 60 ° C'de 30 sn
(Opsiyonel: erime eğrisi belirlemek için aşağıdaki adımları içerir) Adım 3: - 1 periyot: 95 ° C 1 dakika
- 1cycle: 55 ° C 1 dakika
- 81 döngüleri: 55 ° C 'de 30 sn
Tabak CFX96 (BioRad) makine kurdu
- Ayrı bir tüp (referans gen dahil olmak üzere) her bir gen için master karışımı hazırlayın. Her bir kuyu için, ana karışımı oluşur.
Nükleazlar ücretsiz su 2μl 2.5 X SYBR yeşil 4 ul Ileri Astar 1 ul Primer ters 1 ul Toplam hacim Ul 8 - Hazırlarken ana karışımı pipetleme hataları hesaba 1-2 ekstra reaksiyonları içerir.
- Önceden tasarlanmış şablon göre, 2 mcL (20 ng / mcL) her iyi için cDNA ekleyin. Daha sonra, reaksiyon başına 10 mcL toplam hacmi, her bir kuyunun ana karışımı 8 mcL ekleyin.
- Numune iyice karıştırılır emin olmak için yukarı ve aşağı Pipet (2-3X). Herhangi bir sıvı ucu açık kalır emin olun. Çapraz kontaminasyonu engellemek için, her bir örnek için yeni bir ucu kullanın.
- Tüm plaka kurulum sonra, optik bant ile plaka kapsar. Gres varlığı okuma etkileyebilir bant dokunmaktan kaçının. Daha sonra plaka, plakanın altındaki kuyularda tüm ürünler olduğundan emin olmak için 1 dakika için 500 rpm'de santrifüj.
- Santrifüj sonrasında, plakanın alt tarafında herhangi bir buz veya su olup olmadığını kontrol edin. Son olarak, Mah-PCR makine plaka ve PCR programı çalıştırın.
V. Deney şematik Temsilciliği
Şekil 1: Akış şeması, gen ekspresyonu çalışma için adımları sırayla resmeden .
Şekil 2: ortasında midgut gösteren A) larva EAB diseksiyonu. B) larva EAB izole midgut
Şekil 3: A) Ortalama manikür (Cu), midgut (MG) ve yağ organları (FB) dahil olmak üzere farklı larva dokularında peritrophin geni (AP-PERI1) göreceli ifade değerleri (devir). EAB özel bir ribozomal protein (burada adlı AP-RP1) ilgi gen, AP-PERI1 elde edilen veriler normalleştirilmesi için iç kontrol olarak kullanıldı . B) larva dokularında AP-PERI1 Göreli kat değişim. Manikür doku en az ifade gösterdi ve bu nedenle kalibratör (1X) örnek (Pfaffl 2001) olarak alınmıştır.
Şekil 4: A) Ortalama EAB larva instars (1., 2., 3. ve 4.), prepupae (PP) ve yetişkinler (A) dahil olmak üzere farklı gelişim evreleri peritrophin geni (AP-PERI1) göreceli ifade değerleri (devir). EAB özel bir ribozomal protein (AP-RP1) ilgi gen, AP-PERI1 elde edilen veriler normalleştirilmesi için iç kontrol olarak kullanıldı. B) AP-PERI1 çeşitli gelişim evreleri Göreli kat değişim. PP örnek mRNA düzeyleri en az düzeyde gösterdi ve bu nedenle kalibratör (1X örnek) olarak alınmıştır.
VI. Sonuç
Kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR) mRNA düzeyleri farklı böcek doku ve gelişim evreleri teşhis etmek için etkili bir araçtır. Ayrıca, Mah-PCR çoğunlukla böyle mikroarray'ler ve yeni nesil RNA-Seq gibi yüksek kapasiteli gen ekspresyon analizleri elde edilen verileri doğrulamak için önemli bir araç olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eşik döngüleri (Ct) değeri, QRT-PCR plaka her bir numune için elde edilir. Standart eğri yapmak için, her bir dilüsyon için elde Ct değeri, onun konsantrasyonu günlük karşı çizildi. Deney numuneleri için Ct değerlerini daha sonra bu seyreltme serisi standart eğrisi üzerine çizilen. Hedef miktarları, her deney yani doku ve gelişim ifade için ayrı bir standart eğrileri hesaplandı. Göreceli ifade değerleri (devir), daha sonra iç kontrol için elde edilen miktar (AP-RP1) ile ilgi hedef dizisi miktarları (Bu durumda AP-PERI1) bölünmesi ile belirlenir. Anlamlılık hesaplamaları için, her bir gen için devir günlükleri ANOVA (Varyans Analizi), SAS (SAS Institute Inc. SAS / İST Kullanıcı s Kılavuzu, Sürüm 9.1) PROC KARIŞIK prosedür kullanılarak analiz edildi. Ifade düzeyde Anlamlılık p <0.05 düzeyinde tespit edildi. Kalibratör (1X örnek, Pfaffl, 2001) gibi kütikül örnek alarak dokuların durumda Göreli kat değişiklikleri hesaplandı. Bu nedenle, midgut ve yağ organları ekspresyon düzeyleri manikür göre. Gelişim ifade durumda, kalibratör prepupal örnek olarak alınmıştır. Her iki çalışmada, iki biyolojik çoğaltır ve üç teknik çoğaltır.
Yapılan deneme test diğer dokulara kıyasla (p <0.05) anlamlı midgut doku AP-PERI1 transkript yüksek seviyeleri saptandı (Şekil 3). Beslenme aşamaları (yani, larva instars ve yetişkin) gelişimi sırasında (p <0.05) anlamlı prepupae örnek (Şekil 4) daha yüksek bulunmuştur. Manikür ve prepupae (Şekil 3 ve 4) en mRNA seviyeleri hesaplandı. Peritrophins sonuçlar, (Mittapalli ark 2007), diğer böcek türlerinin önceki bulguları doğrulamak böcek midgut ayrılmaz bir bileşeni olduğunu göz önüne alındığında. Gelişim aşamalarında gözlemlenen desenleri, sindirim ve ilgili işlemler AP-PER1 fonksiyonu daha teyit etmektedir. Kültür bitkilerinin yaygın olarak kullanılan Bacillus thuringiensis (Bt) toksinleri gerçekten hedef ve böcekler PM (Pauchet ve ark, 2009) bozabilir. Bu nedenle, bu çalışmada elde edilen sonuçlar sadece EAB için potansiyel kontrol hedefleri ortaya çıkarmak değil, aynı zamanda böcek türlerinin yeni ortamlara adapte nasıl invaziv olarak temel bilgi sağlamak olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz deneylerin kurulum, Lourdes Delta Arrueta Antequera (Entomoloji Bölümü, Ohio State Üniversitesi / OARDC, Wooster, OH) tarafından sağlanan yardım kabul etmiş sayılırsınız. Dr Therese Polonya (USDA, Orman Hizmetleri, NRS) EAB larva örnekleri göndermek için teşekkür ederim. Yardım mikroskop kurulum takdir Dr. Luis Canas ve Nuriş M Acosta tarafından sağlanan. Ohio Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Merkezi, Ohio State Üniversitesi tahsis Eyalet ve Federal fonları tarafından bu proje için finansman sağlanmıştır.
References
- Lehane, M. J. Peritrophic matrix structure and function. Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).
- Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say]. Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).
- Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol. 39, 403-413 (2009).
- Pfaffl, W. M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).
- Tellam, R. L. Biology of the Insect Midgut. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).
