Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Summary

Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. Descriviamo qui una tecnica per l'etichettatura di singole cellule o piccoli gruppi di cellule in embrioni di zebrafish intero con membrana mirati proteina verde fluorescente.

Abstract

Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce vertebrati è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. In embrioni di zebrafish, l'iniezione di risultati del DNA plasmide di espressione mosaico, consentendo la visualizzazione di singole cellule o piccoli gruppi di cellule

Protocol

1.Microinjection

1. Diluire plasmide codifica membrana mirati Green Fluorescent Protein (mGFP, per gentile concessione di Richard Harland) ad una concentrazione di 40 ng / ml. Il DNA è preparato da linearizzazione plasmide (mGFP/PCS2 +, per gentile concessione di Richard Harland) purificato utilizzando il kit Qiagen Maxi Prep. L'aggiunta di rosso fenolo (diluito volume totale 1 / 10) alla soluzione è preferibile per visualizzare la soluzione. Mantenere soluzione di DNA su ghiaccio.
2. Sotto uno stereomicroscopio, calibrare l'ago di iniezione (90mm di vetro capillari da Narishinge scientifico; Cat. No. NA-GD-1), allineando l'ago su un vetrino graduato e picchiettando delicatamente la parte dell'ago in cui il diametro è 1μm usando un rasoio pulito lama (per ottenere una punta di dimensioni adeguate).
3. Al fine di calibrare l'ago per iniettare un volume noto (2NL), collegare l'ago per l'apparato microiniezione (PCI 100 Microinjector; Harvard Apparatus) e davanti riempire l'ago con 0.5μl di una soluzione contenente rosso fenolo e acqua posto su un pezzo di paraffina. La soluzione può essere dispensato con un pedale. Impostare la pressione a 7 KPa e variare il tempo (10msec 30msec) in modo che ci vogliono 250 pedali per erogare 0.5μl della soluzione.
4. Accuratamente posto l'ago calibrato su una striscia di cera in un piatto 100 millimetri umidificato Petri. Per umidificare il piatto, posto Kimwipes bagnato intorno ai bordi (questo impedisce l'evaporazione della soluzione l'ago).
5. Utilizzare una micropipetta per caricare 0,5-1ml di DNA in fine dell'ago (che alla fine non è stata calibrata).
6. Una volta che la soluzione ha raggiunto la punta dell'ago, collegare l'estremità dell'ago che è stato utilizzato per il caricamento di un apparato di microiniezione. Regolare le impostazioni sul microinjector per fornire circa 2 nl / iniezione utilizzando un comando a pedale.
7. Successivamente, zebrafish embrioni posizione nel bel mezzo di una piastra di Petri piena di medio degli embrioni (Stock 1,0 ml di Hank # 1, 0,1 ml di Hank Stock # 2, Stock 1,0 ml di Hank # 4, 95,9 ml DDH ₂ O, Stock 1,0 ml di Hank # 5 , Stock 1,0 ml fresca di Hank # 6, Usa circa 10 gocce di NaOH 1 M a pH 7,2).
8. Una volta che gli embrioni si sono sviluppati allo stadio desiderato, gentilmente presa il corion con una pinza sottile e situare l'ago nel area di destinazione per l'iniezione. Per l'espressione ampia gamma mGFP, iniettare DNA nel tuorlo o del citoplasma nella fase 1cell. Per limitare l'espressione di mGFP per una regione più piccola, iniettare il DNA a 4 (o più) stadio delle cellule nel citoplasma di una cellula singola.
9. Premere il pedale dell'apparato microiniezione e fornire circa 2 nl, assicurando che la soluzione (visibile a causa dell'aggiunta di fenolo rosso) è correttamente iniettato.
10. Rimuovere con attenzione l'ago dall'embrione.
11. Ripetere l'operazione per tutti gli embrioni nella scatola di Petri.
12. Permettono di sviluppare gli embrioni a 28,5 ° C di mettere in scena desiderata.
13. Embrioni Dechorionate delicatamente staccando il corion con una pinza sottile (se gli embrioni sono più giovani di 24hpf, dechorionating in un piatto di vetro Petri aumenta il tasso di sopravvivenza degli embrioni).
14. Rimuovere corion vuoto dalla piastra di Petri con una pipetta di vetro.

2. Imaging mGFP marcato sezioni vibratome

1. Utilizzare una pipetta di vetro per il trasporto di embrioni in fissativo (paraformaldeide 4% in soluzione 1X tampone fosfato (PBS). Fissare gli embrioni a 4 ° C durante la notte.
2. Lavare gli embrioni in PBS 1X 3 volte per 5 minuti ciascuno.
3. Mettere gli embrioni in piastra di Petri e, utilizzando una pinza sottile, togliete il tuorlo senza danneggiare l'embrione. Rimuovere il tuorlo più possibile.
4. Preparare il 4% bassa temperatura di fusione agarosio in H ₂ O.
5. Luogo agarosio fuso in stampi di plastica sezionamento.
6. Utilizzare una pinza sottile per sollevare un embrione iniettato dalla piastra di Petri e di luogo e orientare nel agarosio. L'embrione deve essere posizionato verso una delle estremità dello stampo.
7. Una volta che l'agarosio è indurito, utilizzare uno strumento superficie piana, come una spatola, per rimuovere il blocco di agarosio dallo stampo.
8. Tagliare l'estremità inferiore del blocco di agarosio con una lametta in modo che sia pari.
9. Aggiungere una goccia di colla super per la fase vibratome e posizionare il blocco di agarosio su di esso (il lato del blocco che è stato stabilizzato con il rasoio deve essere rivolta la colla). Per sezionamento più embrioni, montare diversi agarosio-embedded campioni sul palco.
10. Collegare la fase vibratome al vibratome (Vibratome, Inc.).
11. Impostare i parametri del vibratome (impostazioni comuni: velocità-3;-spessore 50 micron). Se sezionare embrioni multipli, allineare i blocchi agarosio sul palco e in modo che la lama attraversa tutta l'embrione ma non attraverso l'intera larghezza dei blocchi agarosio (in modo tale che sezioni corrispondenti per l'embrione stesso rimarrà insieme).
12. Versare PBS 1X nella fase vibratome.
13. Sezione.
14. Una volta che gli embrioni sono SEZIONEned, rimuovere il blocco di agarosio (s) dal palco vibratome.
15. Accuratamente separati ogni sezione, tagliando la parte posteriore del blocco di agarosio (s).
16. Utilizzare una pinza sottile per selezionare le sezioni desiderata e posto in un pieno di PBS 1X e multi-piatto (uso pozzi diversi per sezioni corrispondenti alle diverse embrioni).
17. Ripetere per ogni embrione.
18. Procedere con l'etichettatura degli anticorpi, anche se i passaggi 19 23, per migliorare mGFP immagini (questo passo potrebbe non essere necessario se le sezioni sono esposte all'interno di uno o due giorni di preparazione).
19. Trattare sezioni per 30 minuti a temperatura ambiente con una soluzione di blocco in PBS 1X per bloccare legame non specifico.
20. Sezioni incubare con l'anticorpo primario (coniglio a-GFP, Invitrogen Cat. No. A11122) @ diluito 1:200 nella soluzione bloccante su un agitatore per 5 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
21. Lavare quattro volte (10 min, 15 min, 30 min e 60 min ciascuna) in 1% BSA/1X PBS / 1% di soluzione di DMSO.
22. Trattare con adeguate sezioni anticorpo secondario in soluzione di blocco per 5 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
23. Lavare quattro volte (10 min, 15 min, 30 min e 60 min ciascuna) in 1% BSA/1X PBS / 1% di soluzione di DMSO.
24. Trattare le sezioni con DAPI (0,1% DAPI in 50ml di PBS 1X; Invitrogen Cat. No. D1306) per 30 minuti per colorare i nuclei.
25. Lavare tre volte in PBS 1X per 5 minuti ciascuno.
26. Montaggio sul vetrino.
27. Immagine mediante microscopia confocale.

3. Vivere l'imaging

1. Dechorionate vivi, embrioni iniettata 30 minuti prima che raggiungano lo stadio di sviluppo desiderato. Mettere gli embrioni in soluzione sedativo (0,01% in media Tricaine embrioni) per 15 min.
2. Mettere una goccia di agarosio all'1% su un piatto di 35 millimetri cultura fondo di vetro (MatTek; Codice P35G-o-20-C).
3. Lasciare agarosio a solidificarsi.
4. Calore capillare sul fuoco per fare 3 fori in agarosio (altri oggetti come punte micropipetta può essere usato per fare i fori). Garantire che non c'è residuo agarosio nel fondo foro.
5. Riempire la piastra Petri con Media embrione.
6. Utilizzare una pipetta di vetro al posto dell'embrione nel foro.
7. Quindi, orientare l'embrione utilizzando una pinza sottile in modo che l'area da acquisire (testa dorsale) è in contatto con il vetro.
8. Cura il trasporto scatola di Petri alla fase microscopio (posizionare il coperchio sulla piastra di Petri per prevenire l'evaporazione).
9. Mentre imaging, in modo che gli embrioni sono a 28.5 ° C.

4. Risultati

Descriviamo qui un approccio diretto alle cellule singola immagine nel tubo neurale utilizzando l'espressione zebrafish mosaico. Nonostante la trasparenza ottica dell'embrione zebrafish, abbiamo trovato che la visualizzazione di cellule neurali è notevolmente migliorata in sezioni ottenuti utilizzando un vibratome. Queste sezioni sono di spessore (50 mm) che consente di estensione per l'imaging cellulare da una data cellula in diversi piani focali utilizzando un microscopio confocale. I risultati di tale metodologia sono stati pubblicati altrove ^2, ma immagini rappresentative delle cellule del tubo neurale di un embrione WT (Figura 1) e di un N-caderina (N-cad) mutante (Figura 2) sono forniti. Quest'ultimo rivela che le cellule nelle regioni laterali della piastra neurale in N-cad mutanti non riescono ad orientarsi correttamente verso la linea mediana (Figura 2). In contrasto con questa etichettatura mosaico, immunostaining il neuroepitelio con un indicatore generale di superficie cellulare, come il beta-catenina non consente la morfologia delle singole cellule da visualizzare (Figura 3).

Lasso di tempo di imaging di embrioni vivi completato l'etichettatura mosaico di campioni fissati, permettendo una migliore comprensione delle dinamiche cellulari che avvengono durante neurulazione. Movie 1 ha rivelato che le cellule WT attivamente migrano verso la linea mediana, estendendo medialmente orientata sporgenze membrana.

Figura 1. MGFP espressione nel tubo neurale di un embrione di zebrafish WT.

Figura 2. MGFP espressione nel tubo neurale di un N-caderina embrione zebrafish.

Figura 3. B-catenina colorazione immuno del neuroepitelio.

Discussion

In conclusione, le tecniche descritte qui di etichettatura consentono di analisi singola cella dei processi morfogenetici nell'embrione zebrafish. L'enfasi principale di questo protocollo è sui metodi di imaging per le cellule etichettate nel tubo neurale utilizzando mGFP sotto il controllo di un promotore ubiquitario. Per ulteriori applicazioni di questa analisi lettori transitoria espressione deve fare riferimento ad un recente articolo da Andersen et al. ^3.

Materials

Solutions

Hank's Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O Hank's Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O Hank's Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O Hank's Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3 Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)