और Zebrafish Hindbrain में लेबल इमेजिंग कक्ष

Summary

Morphogenetic प्रक्रियाओं है कि जल्दी भ्रूण आकार को समझने के लिए कुंजी उच्च संकल्प छवि कोशिकाओं करने की क्षमता है. हम यहाँ पूरे zebrafish भ्रूण में झिल्ली लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एकल कक्षों या कक्षों छोटे समूहों लेबलिंग के लिए एक तकनीक का वर्णन.

Abstract

Morphogenetic प्रक्रियाओं है कि जल्दी हड्डीवाला भ्रूण के आकार को समझने के लिए कुंजी उच्च संकल्प छवि कोशिकाओं करने की क्षमता है. Zebrafish भ्रूण, मोज़ेक अभिव्यक्ति में प्लास्मिड डीएनए परिणामों के इंजेक्शन, एकल कक्षों या कक्षों के छोटे समूहों के दृश्य के लिए अनुमति

Protocol

1.Microinjection

1. पतला प्लाज्मिड झिल्ली लक्षित एन्कोडिंग ग्रीन प्रतिदीप्त प्रोटीन (mGFP, रिचर्ड Harland के सौजन्य से) 40 एनजी / एमएल के एक एकाग्रता के लिए. डीएनए प्लाज्मिड (रिचर्ड Harland mGFP/PCS2 + शिष्टाचार) शुद्ध Qiagen मैक्सी तैयारी किट का उपयोग linearizing द्वारा तैयार है. Phenol लाल (1 / 10 कुल मात्रा पतला) के समाधान के लिए जोड़ समाधान कल्पना करने के लिए पसंद है. बर्फ पर डीएनए समाधान रखें.
2. एक स्नातक की उपाधि प्राप्त स्लाइड पर सुई aligning और धीरे से सुई का हिस्सा है जहां व्यास 1μm है एक साफ के रेजर का उपयोग दोहन करके, एक stereomicroscope के तहत, इंजेक्शन सुई (बिल्ली सं NA-GD-1 Narishinge वैज्ञानिक से 90mm कांच capillaries) जांचना ब्लेड (उपयुक्त आकार के एक टिप को प्राप्त).
3. आदेश में सुई जांचना करने के लिए एक ज्ञात मात्रा (2nl) इंजेक्षन, microinjection तंत्र सुई कनेक्ट (पीसीआई 100 Microinjector, हार्वर्ड उपकरण) और सामने 0.5μl phenol लाल और पानी के एक टुकड़े पर रखा युक्त समाधान के साथ सुई भरने आयल की. समाधान एक पैर पेडल का उपयोग कर तिरस्कृत किया जा सकता है है. 7 kPa के लिए दबाव सेट और समय भिन्न (10msec 30msec) इतना है कि यह 250 pedals लेता है के लिए समाधान के 0.5μl बग़ैर.
4. एक humidified 100 मिमी पेट्री डिश में मोम की एक पट्टी पर ध्यान से calibrated सुई जगह. पकवान गीला करने के लिए, किनारों के आसपास गीली Kimwipes (इस सुई में समाधान के वाष्पीकरण रोकता) जगह है.
5. सुई अंत (अंत है कि नहीं कैलिब्रेटेड था) में डीएनए के 0.5 1μl लोड micropipette का प्रयोग करें.
6. एक बार सुई टिप समाधान तक पहुँच गया है, सुई है कि एक microinjection तंत्र को लोड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के अंत कनेक्ट. Microinjector पर सेटिंग्स समायोजित करने के लिए लगभग 2 nl / एक पैर पेडल का उपयोग इंजेक्शन देने के लिए.
7. अगला एक पेट्री भ्रूण मध्यम (1.0 मिलीलीटर है हांक स्टॉक # 1, 0.1 मिलीलीटर है हांक स्टॉक # 2, 1.0 मिलीलीटर है हांक शेयर # 4, 95.9 मिलीलीटर DDH ₂ हे, 1.0 मिलीलीटर है हांक स्टॉक # 5 से भरा पकवान के बीच में, स्थिति zebrafish भ्रूण 1.0 मिलीलीटर ताजा हांक स्टॉक # 6, 10 बूँदें एम 1 पीएच 7.2 NaOH के बारे में प्रयोग).
8. एक बार भ्रूण इच्छित चरण के लिए विकसित किया है, धीरे ठीक संदंश के साथ chorion पकड़ और सुई इंजेक्शन के लिए लक्षित क्षेत्र में बैठाना. व्यापक रेंज mGFP अभिव्यक्ति के लिए, या 1cell चरण में cytoplasm जर्दी में डीएनए इंजेक्षन. एक छोटे क्षेत्र mGFP की अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए, (या अधिक) कोशिकाओं चरण 4 में किसी एकल कक्ष के cytoplasm में डीएनए इंजेक्षन.
9. Microinjection तंत्र के पैर पेडल प्रेस और लगभग 2 nl देने के लिए, सुनिश्चित करना है कि समाधान (phenol लाल के अलावा कारण दिखाई) इंजेक्शन ठीक है.
10. ध्यान से भ्रूण से सुई को हटा दें.
11. पेट्री डिश में सभी भ्रूण के लिए दोहराएँ.
12. भ्रूण 28.5 पर ° सी इच्छित चरण के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें.
13. धीरे बंद छीलने chorion ठीक संदंश (अगर भ्रूण 24hpf की तुलना में छोटी कर रहे हैं, एक गिलास पेट्री डिश में dechorionating भ्रूण के जीवित रहने की दर बढ़ जाती है) का उपयोग करके Dechorionate भ्रूण.
14. एक गिलास पिपेट का उपयोग पेट्री डिश से खाली chorion निकालें.

2. लेबल इमेजिंग mGFP vibratome वर्गों

1. एक गिलास विंदुक प्रयोग लगानेवाला (1X फॉस्फेट समाधान बफर (पीबीएस) में 4% paraformaldehyde में भ्रूण परिवहन में भ्रूण फिक्स 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात.
2. 5 मिनट प्रत्येक के लिए भ्रूण 1X पीबीएस में 3 बार धोएं.
3. पेट्री डिश और, ठीक संदंश का प्रयोग में भ्रूण प्लेस, भ्रूण को नुकसान पहुँचाए बिना जर्दी हटा दें. संभव के रूप में के रूप में ज्यादा जर्दी निकालें.
4. एच ₂ ओ में 4% की कम पिघल agarose तैयार
5. प्लास्टिक सेक्शनिंग मोल्ड में पिघला हुआ agarose रखें.
6. पेट्री डिश से एक इंजेक्शन भ्रूण लिफ्ट और के लिए जगह और agarose में पूरबी ठीक संदंश का प्रयोग करें. भ्रूण आचारण के एक छोर की ओर तैनात किया जाना चाहिए.
7. एक बार agarose कठोर है, एक फ्लैट सतह उपकरण, जैसे एक रंग का उपयोग करें, मोल्ड से agarose ब्लॉक हटायें.
8. एक धार के साथ agarose ब्लॉक के नीचे अंत कट इतना है कि यह भी है.
9. Vibratome चरण के लिए सुपर गोंद की एक बूंद जोड़ें और जगह पर agarose (ब्लॉक कि बंद रेजर के साथ लगाया गया था की ओर गोंद का सामना करना चाहिए) ब्लॉक. कई भ्रूण सेक्शनिंग के लिए, मंच पर कई agarose एम्बेडेड नमूनों माउंट.
10. Vibratome vibratome चरण संलग्न (Vibratome इंक).
11. (:; मोटाई 50μm गति 3 आम सेटिंग्स) vibratome के मापदंडों सेट. यदि एकाधिक भ्रूण सेक्शनिंग मंच पर agarose ब्लॉक संरेखित करें और सुनिश्चित करें कि ब्लेड पूरे भ्रूण के माध्यम से चला जाता है लेकिन agarose ब्लॉक की पूरी चौड़ाई के माध्यम से (जैसे कि एक ही भ्रूण करने के लिए इसी वर्गों को एक साथ रहेगा).
12. Vibratome चरण में 1X पीबीएस डालो.
13. धारा.
14. एक बार भ्रूण sectio हैंनेड, vibratome मंच से agarose ब्लॉक (ओं) को हटाने.
15. ध्यान agarose ब्लॉक (एस) के पीछे काटने से प्रत्येक अनुभाग अलग.
16. ठीक संदंश का प्रयोग 1X पीबीएस भरा पकवान बहु अच्छी तरह से (अलग भ्रूण करने के लिए इसी वर्गों के लिए अलग कुओं का उपयोग) में वांछित वर्गों और जगह का चयन करें.
17. प्रत्येक भ्रूण के लिए दोहराएँ.
18. एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ आगे बढ़ें, 19 हालांकि 23 कदम mGFP इमेजिंग (यह चरण आवश्यक नहीं हो सकता है अगर वर्गों या तैयारी के दो दिन के भीतर imaged सकता है) बढ़ाने.
19. 1X पीबीएस में अवरुद्ध समाधान के लिए गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए वर्गों को समझो.
20. प्राथमिक एंटीबॉडी (एक GFP खरगोश, Invitrogen बिल्ली सं A11122) एक प्रकार के बरतन पर अवरुद्ध समाधान में 1:200 @ 4 में कमरे के तापमान पर 5 घंटे या रात भर के लिए पतला डिग्री सेल्सियस के साथ सेते वर्गों
21. % 1 BSA/1X पीबीएस / 1% DMSO समाधान में चार बार (10 मिनट, 15 मिनट, 30 मिनट और 60 मिनट प्रत्येक) धो लें.
22. कमरे के तापमान पर 5 घंटे या रात भर के लिए उपयुक्त अवरुद्ध समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 4 वर्गों दावत ° सी.
23. % 1 BSA/1X पीबीएस / 1% DMSO समाधान में चार बार (10 मिनट, 15 मिनट, 30 मिनट और 60 मिनट प्रत्येक) धो लें.
24. 30 मिनट नाभिक दाग के लिए, DAPI (Invitrogen बिल्ली सं D1306 0.1 50ml 1X पीबीएस में% DAPI) के साथ वर्गों का समझो.
25. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1X पीबीएस में तीन बार धोएं.
26. स्लाइड पर माउंट.
27. Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि.

3. लाइव इमेजिंग

1. Dechorionate रहते हैं, इंजेक्शन भ्रूण 30 मिनट पहले वे वांछित विकास मंच तक पहुँचने. शामक समाधान में भ्रूण (0.01% भ्रूण मध्यम में Tricaine) 15 मिनट के लिए रखें.
2. एक 35 मिमी गिलास नीचे संस्कृति डिश पर 1% agarose की एक बूंद प्लेस (MatTek, भाग P35G सं-O-20-सी).
3. Agarose जमना करने के लिए अनुमति दें.
4. हीट agarose 3 छेद (micropipette सुझावों जैसे अन्य वस्तुओं के लिए छेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) बनाने के लिए लौ पर केशिका ट्यूब. सुनिश्चित करें कि वहाँ छेद के तल में कोई अवशिष्ट agarose है.
5. भ्रूण मध्यम के साथ पेट्री डिश भरें.
6. छेद में भ्रूण की जगह एक गिलास विंदुक का प्रयोग करें.
7. अगला, पूरबी भ्रूण ठीक संदंश ताकि क्षेत्र imaged किया जा करने के लिए (पृष्ठीय सिर) का उपयोग कर गिलास के साथ संपर्क में है.
8. ध्यान खुर्दबीन मंच (पेट्री के लिए वाष्पीकरण को रोकने के पकवान पर ढक्कन जगह) के लिए पेट्री डिश परिवहन.
9. इमेजिंग जबकि यह सुनिश्चित करें कि भ्रूण 28.5 डिग्री सेल्सियस

4. परिणाम

हम यहाँ zebrafish मोज़ेक अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए तंत्रिका ट्यूब में छवि एकल कक्षों के लिए एक सीधा दृष्टिकोण का वर्णन. Zebrafish भ्रूण के ऑप्टिकल पारदर्शिता के बावजूद, हमने पाया है कि तंत्रिका कोशिकाओं के दृश्य बहुत पार एक vibratome का उपयोग करने के लिए प्राप्त वर्गों में बढ़ाया है. इन वर्गों मोटी (50 मिमी) विभिन्न फोकल एक confocal खुर्दबीन का उपयोग विमानों में एक दिया सेल से सेलुलर एक्सटेंशन के इमेजिंग के लिए अनुमति. ² कहीं इस पद्धति का उपयोग कर परिणाम प्रकाशित किया गया है, लेकिन कक्षों की एक WT (चित्रा 1) भ्रूण और एक एन cadherin (एन पाजी) के न्यूरल ट्यूब में प्रतिनिधि छवियों उत्परिवर्ती (चित्रा 2) प्रदान की जाती हैं. बाद म्यूटेंट midline (चित्रा 2) की ओर उन्मुख करने के लिए ठीक से विफल एन पाजी में तंत्रिका प्लेट के पार्श्व क्षेत्रों में है कि कोशिकाओं का पता चलता है. इस मोज़ेक की लेबलिंग विपरीत, बीटा catenin के रूप में एक सामान्य कोशिका की सतह मार्कर के साथ neuroepithelium immunostaining व्यक्ति की कोशिकाओं के morphology visualized किया जा करने के लिए (चित्रा 3) की अनुमति नहीं है.

समय रहते भ्रूण की चूक इमेजिंग तय नमूनों के मोज़ेक लेबलिंग पूरित है, सेलुलर गतिशीलता है कि neurulation के दौरान जगह लेने के एक बेहतर समझ को सक्षम करने. एक मूवी से पता चला है कि WT कोशिकाओं को सक्रिय medially उन्मुख झिल्ली protrusions बढ़ाकर midline की ओर विस्थापित.

चित्रा 1 WT zebrafish भ्रूण न्यूरल ट्यूब में mGFP अभिव्यक्ति.

चित्रा 2 एन cadherin zebrafish भ्रूण न्यूरल ट्यूब में mGFP अभिव्यक्ति.

चित्रा 3. बी catenin neuroepithelium के इम्युनो धुंधला हो जाना.

Discussion

अंत में, लेबलिंग तकनीक यहाँ वर्णित zebrafish भ्रूण में morphogenetic प्रक्रियाओं की एकल कोशिका विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. इस प्रोटोकॉल के प्राथमिक एक सर्वव्यापी प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन तंत्रिका mGFP का उपयोग कर ट्यूब में इमेजिंग कोशिकाओं लेबल के लिए तरीकों पर जोर दिया है. इस क्षणिक अभिव्यक्ति परख पाठकों के अतिरिक्त अनुप्रयोगों के लिए एंडरसन एट अल द्वारा हाल ही में एक अखबार के लिए ^{उल्लेख 3.} चाहिए .

Materials

Solutions

Hank's Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O Hank's Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O Hank's Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O Hank's Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3 Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)