Ca इमेजिंग तकनीक के लिए ^{2 +} मानव शुक्राणु में संकेतन

Summary

उत्तेजना से पैदा [Ca

Abstract

फ्लोरोसेंट, CA के साथ लोड कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

Protocol

एक सामान्य वीर्य विश्लेषण के साथ स्वस्थ उपजाऊ पुरुषों से शुक्राणु, सामान्य रूप से निम्नानुसार इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं.

1. वीर्य के नमूने 37 ° C पर कोई अधिक 30 मिनट के लिए जमा कर रहे हैं. : 1.8 ₂ 0.2 CaCl एच ₂ हे, KCl 5.37, 0.81 MgSO ₄ 0.7 एच ₂ हे, 26.2 NaHCO _3, 1.0 नाह ₂ पीओ ₄ मिमी, कक्ष पूरक है Earle संतुलित नमक (समाधान sEBSS में तैरने के द्वारा लाभदायक प्लाज्मा से अलग कर रहे हैं . 2H ₂ हे, NaCl 116.4, 55.6 डी - ग्लूकोज, 2.73 ना पाइरूवेट, ना लैक्टेट 41.8) 0.3% की लकड़ी का कोयला de-lipidated/fatty एसिड मुक्त भिन्न वी (BSA BSA के गुणवत्ता शुक्राणु के सफल capacitation लिए महत्वपूर्ण है) के साथ पूरक . SEBBS के 1 मिलीलीटर 5 मिलीलीटर ट्यूब की एक श्रृंखला के प्रत्येक में pipetted है और धीरे से वीर्य की 0.3 मिलीलीटर के साथ underlayered. शीर्ष 0.7 मिलीलीटर धीरे प्रत्येक ट्यूब से निकाल दिया जाता है और जमा; 1 घंटा (6% सीओ ₂ 37 डिग्री सेल्सियस) के लिए ऊष्मायन के बाद शुक्राणु निलंबन के 10 μl 1% (v / v) कोशिकाओं को स्थिर formalin के 90 μl के साथ पतला है, तो शुक्राणु एक NEUBAUER कक्ष में गिने जाते हैं. निलंबन में सेल घनत्व तो 6 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के लिए निकाला जाता है (sEBSS के साथ).
2. 5-6 घंटे के लिए capacitation अनुमति देने के लिए. नमूना तो शिथिल छाया ट्यूबों और incubated _(6% सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस) में 200 μl की aliquots में विभाजित है
3. Coverslips (22x50 मिमी) पहले पाली - डी - lysine के साथ इलाज किया गया है है. पाली - डी - lysine समाधान (10% w / v) के 10 μl coverslip के केंद्र के लिए छोटे बूंदों के एक नंबर के रूप में लागू किया जाता है. पाली-D-lysine तब शुष्क हवा की अनुमति दी है. यह एक गर्म मंच पर हो सकता है और सूखापन का पूरा किया जाना चाहिए कर सकते हैं. वार्नर RC20 चैम्बर के लिए इसी तरह पाली - डी - lysine, एक coverslip निर्वात एक संलग्न, उद्देश्य से बनाया, perfusable, polycarbonate इमेजिंग कक्ष (180 ≈ μl क्षमता आयाम 35 मिमी x 20 एक्स 5 मिमी) के लिए तेल के साथ जुड़ा हुआ है लेपित coverslip जब कोशिकाओं को एक औंधा माइक्रोस्कोप पर देखा जाता है और एक 12 मिमी व्यास परिपत्र coverslip कक्ष के ऊपरी सतह रूपों, प्रकाश के संचरण की अनुमति कक्ष के आधार रूपों.
4. ओरेगन BAPTA1 AM ग्रीन (OGB) या कैल्शियम 1-AM ग्रीन लेबलिंग कोशिकाओं के लिए उपयोग किया जाता है. OGB DMSO में भंग द्वारा तैयार की है. Pluronic एसिड F127 DMSO (एक साबुन) में शामिल है डाई के clumping 'को रोकने के. इस प्रयोगशाला (0.5 मिलीलीटर DMSO में 100 मिलीग्राम Pluronic) में तैयार किया जा सकता है है, तुरंत का उपयोग करने से पहले, या पूर्व तैयार खरीदा जा सकता है है. 20 μl OGB (2.5 मिलीग्राम / एमएल) की एक 50 μg विभाज्य करने के लिए जोड़ा है. शीशी तो संग्रहित जमे हुए और बाद में उपयोग के लिए thawed जा सकता है.
5. शुक्राणु की capacitation बाद (sEBBS में 5-6 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ ₂₎ एक ट्यूब इमेजिंग और OGB समाधान के 1.2 μl के लिए चुना है जोड़ा है, 10 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता दे. ट्यूब तो एक और आगे 40 मिनट के लिए incubated है, जो सेल निलंबन के बाद धीरे P1000 (नीला) विंदुक टिप के साथ इमेजिंग चैम्बर के प्रवाह बंदरगाह में इंजेक्शन है. चैम्बर इनक्यूबेटर, पाली - डी lysine-लेपित coverslip पक्ष में रखा जाता है 20 मिनट के लिए नीचे. कक्ष के लिए कक्ष की सतहों के साथ तैरना करते हैं और पाली - डी lysine-लेपित क्षेत्र के लिए पालन करना होगा.
6. चैम्बर अब खुर्दबीन पर मुहिम शुरू की है, छिड़काव तंत्र से जुड़ा है और लगभग 0.5 मिलीग्राम / मिनट पर perfused है. रोलर पंप फ़ीड कक्ष और बाहर निकलें पोर्ट से अतिप्रवाह में खारा जाल के साथ एक चूषण पंप द्वारा हटा दिया जाता है. तैयारी के अंधेरे में कम से कम 10 मिनट के लिए छोड़ दिया है ढीला कोशिकाओं और कोशिकी डाई whilst चैम्बर के छिड़काव द्वारा हटा रहे हैं. तापमान स्थिरता महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण है क्योंकि छोटे उतार चढ़ाव केवल ^दो सेल homeostasis ⁺ Ca नहीं प्रभावित कर सकता है, लेकिन यह भी कश्मीर की डाई _घ को प्रभावित कर सकता है. प्रयोगों आम तौर पर 25 में प्रदर्शन कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस, इस स्तर पर अंधेरे कमरे के तापमान को बनाए रखने के द्वारा हासिल की. हमने पाया है कि अपेक्षित स्तर पर कमरे के तापमान को बनाए रखने के एक तापमान नियंत्रित चरण या खारा आमद पर एक thermostatically नियंत्रित हीटर का उपयोग कर से अधिक तापमान और ध्यान केंद्रित स्थिरता प्रदान करता है.
7. कक्ष चरण (40x या 60x तेल विसर्जन) विपरीत उद्देश्य और इमेजिंग के लिए एक क्षेत्र का चयन किया है के तहत देखा जाता है. पाली - डी lysine लेपित क्षेत्र है कि प्रवेश के बंदरगाह के निकट है के हिस्से पसंद है, जहां खारा प्रवाह लामिना और संगत है. यह भी महत्वपूर्ण है एक क्षेत्र है जहां सेल घनत्व उपयुक्त है का उपयोग करें (अत्यधिक घनत्व सन्निकट कक्षों से संकेत की पिक के माध्यम से गुणवत्ता और डेटा की अखंडता को प्रभावित करता है) और जहां कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से संलग्न हैं, लेकिन flagellar गतिविधि प्रत्यक्ष है. एक चरण विपरीत छवि को बचाया है. और प्रदर्शन एक स्पष्ट प्रतिदीप्ति छवि (आमतौर पर 5-20 एमएस) प्राप्त करने के लिए आवश्यक न्यूनतम करने के लिए समय कम है, खुर्दबीन तो प्रतिदीप्ति (उत्सर्जन 540 एनएम 480 एनएम उत्तेजना) मोड बंद है.
8. प्रयोग समय श्रृंखला छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (बुद्धि) को सक्रिय करने के द्वारा शुरू कर दिया है. आमतौर पर छवियों 0.1 हर्ट्ज पर अर्जित कर रहे हैं और रोशनी छवि अधिग्रहण की अवधि तक ही सीमित है केवल एक softwa का उपयोगपुनः नियंत्रित शटर. बहुत अधिक छवि अधिग्रहण दरों पर इस्तेमाल किया जा सकता है भत्ता विरंजन की समस्याओं और कोशिकाओं (चर्चा देखें) तस्वीर क्षति की वजह से कलाकृतियों की पीढ़ी के लिए किया जाना चाहिए. बुद्धि (और अधिकांश अन्य अधिग्रहण सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों) प्रतिदीप्ति के प्रयोग के दौरान वास्तविक समय रेखांकन की अनुमति देगा.
9. खारा के छिड़काव के शीर्ष लेख में प्रतिस्थापन द्वारा खारा घटक के 3-5 मिनट की अवधि हेरफेर (जैसे ^{[2 Ca _+]} ओ के रूप में) और दवाओं के आवेदन की एक नियंत्रण अवधि के बाद हासिल की है. प्रत्येक प्रोत्साहन के अलावा का समय नोट किया गया है ताकि इमेजिंग कक्ष में आगमन के उस समय, परिकलित किया जा सकता है धीमी गति से यहाँ वर्णित (0.1 हर्ट्ज पर नमूना) प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए पर्याप्त सटीकता प्रदान. अधिक तेजी से प्रतिक्रिया के लिए अधिक से अधिक सटीकता एक दूसरे अंतर्वाह वार्नर RC20 कक्ष में प्रदान के रूप में बंदरगाह के माध्यम से सीधे खारा प्रवाह उत्तेजनाओं को जोड़ने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
10. छवियाँ बुद्धि का उपयोग कर ऑफ़लाइन विश्लेषण कर रहे हैं. ब्याज (ROIs) के क्षेत्र के प्रत्येक कक्ष (या सेल का हिस्सा) दौर तैयार कर रहे हैं और भी एक सेल मुक्त क्षेत्र (स्वचालित पृष्ठभूमि घटाव के लिए सॉफ्टवेयर के द्वारा चयनित छवि श्रृंखला फिर कोशिकाओं है जो मर गया है या लिया acrosome प्रतिक्रिया को हटाने की जाँच की है. ( जो प्रतिदीप्ति में एक बड़े और तेजी से वृद्धि प्रयोग और उन है कि पर्याप्त आंदोलन कलाकृतियों के कारण जब एक समय की श्रृंखला के रूप में विश्लेषण से पता चला के दौरान cytoplasmic डाई की हानि) द्वारा पीछा के रूप में प्रकट होता है.
11. एक समय प्रतिदीप्ति तीव्रता श्रृंखला तो प्रत्येक रॉय के लिए प्राप्त की है और इन डेटा Excel में विश्लेषण ऑफ़लाइन हैं. प्रारंभ प्रतिदीप्ति मतलब मूल्य नियंत्रण की अवधि के दौरान प्राप्त करने के लिए सामान्यीकृत किया जाता है, समीकरण का उपयोग कर आर ₌ [(एफएफ _{बाकी)} / एफ बाकी] x 100%, जहां आर नियंत्रण अवधि की तुलना में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन% है , एफ प्रतिदीप्ति तीव्रता है एक बार टी और एफ _बाकी पर कम से कम 30 एफ के determinations नियंत्रण अवधि के दौरान प्राप्त का मतलब है.

प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1 जिसमें कोशिकाओं 3 सुक्ष्ममापी प्रोजेस्टेरोन के साथ प्रेरित किया गया एक प्रयोग से छवियों की एक श्रृंखला से पता चलता है. ऊपरी पंक्ति और 1 मूवी ग्रे पैमाने में प्रतिदीप्ति छवियों को दिखाने के लिए और एक ही mages नीचे दिखाए जाते हैं (और 2 फिल्म में) (तालिका '16_colors लुकअप 'छवि जम्मू में) pseudocolor में, जहां' शांत 'रंग कम फ्लोरोसेंट तीव्रता से संकेत मिलता है और 'गर्म' रंग उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता का संकेत मिलता है. कक्ष pseudocolor में प्रयोग के दौरान देखा जा सकता है, बुद्धि में लुकअप तालिकाओं का उपयोग, लेकिन ग्रे स्केल का उपयोग आम तौर पर आकलन करने के लिए जानकारीपूर्ण है कि क्या कोशिकाओं को अच्छी तरह से लेबल रहे हैं.. पहले दो छवियों 0 एस और रिकॉर्डिंग शुरू करने के बाद 100 एस में एकत्र किए गए थे. प्रतिदीप्ति स्थिर हो और पोस्ट acrosomal क्षेत्र और शुक्राणु गर्दन में मजबूत हो जाता है चाहिए. प्रोजेस्टेरोन लगभग 175 एस इमेजिंग कक्ष में प्रवेश ^किया और 3 Rd ^और 4 वें छवियाँ (180 और 220) में एक तेजी से ^{वृद्धि} से पता ^चलता है [2 Ca ^+] (प्रतिदीप्ति) मैं पीछे सेल के सिर और गर्दन के क्षेत्र में प्रारंभिक. बाद छवियों 290 पर, 360, 740, 990 और 1440 एस, प्रारंभिक के क्षय को ^{दर्शाता} है ^[2 Ca +] मैं क्षणिक और एक माध्यमिक निरंतर ऊंचाई के विकास. चित्रा 2 एक स्प्रेडशीट विश्लेषण से पता चलता है, सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति के लिए प्रत्येक रॉय (% प्रतिदीप्ति में नियंत्रण अवधि की तुलना में परिवर्तन) के लिए कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों परिवर्तित चित्रा 3 3 3 सुक्ष्ममापी प्रोजेस्टेरोन के लिए 'विशिष्ट' प्रतिक्रियाओं दिखा कोशिकाओं के लिए समय सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति भूखंडों से पता चलता है.

चित्रा 1. कक्ष से उदाहरण डेटा प्रोजेस्टेरोन के साथ प्रेरित है . ग्रे पैमाने (ऊपरी पंक्ति) और pseudocolor (कम पंक्ति) में प्रतिदीप्ति छवियों की एक श्रृंखला दिखाए जाते हैं. समय अंक 0, 180, 220, 290 360, और 990s हैं. 3 सुक्ष्ममापी प्रोजेस्टेरोन 175 इमेजिंग कक्ष में प्रवेश एस ROIs पहली पैनल में दिखाए जाते हैं.

चित्रा 2 Excel में एकल सेल प्रतिदीप्ति डेटा का विश्लेषण. काले रंग में आंकड़े प्रतिदीप्ति डेटा के समय श्रृंखला हैं, खड़ी व्यवस्था. लाल रंग में आंकड़े (नीचे) सामान्यीकृत पाठ में दिए गए समीकरण का उपयोग करने के लिए प्राप्त डेटा हैं. ग्राफ़ जो उत्तेजना पर, एक धीमी वृद्धि और छोटे दोलनों की श्रृंखला के द्वारा पीछा प्रतिदीप्ति में एक क्षणिक वृद्धि से पता चलता है इस प्रयोग में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति समय सेल 64 के लिए भूखंड से पता चलता है.

चित्रा 3. प्रतिदीप्ति समय निशान, 3 व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए मूल्य नियंत्रण करने के लिए सम्मान के साथ% परिवर्तन के रूप में व्यक्त ... 3 सुक्ष्ममापी प्रोजेस्टेरोन तीर द्वारा चिह्नित समय में जोड़ा गया है. डैश्ड रेखा से पता चलता नियंत्रण प्रतिदीप्ति मतलब है.

Discussion

जब सफलतापूर्वक बाहर किया जाता है, इस तकनीक की अनुमति देता है और ^सहज और प्रेरित 2 Ca मानव शुक्राणु में संकेतों के वितरण कैनेटीक्स की रिकॉर्डिंग. प्रतिक्रियाएँ कक्षों की एक बड़ी संख्या (200 के लिए), जो महत्वपूर्ण है के बाद से मानव शुक्राणु ^उनके सहज और 2 Ca प्रेरित संकेतों में बदलाव की एक बहुत कुछ दिखा सकते हैं से प्राप्त किया जा सकता है. सफल लेबलिंग और रिकॉर्डिंग के दौरान कोशिकाओं के अस्तित्व नमूना गुणवत्ता पर अत्यधिक निर्भर हैं. गरीब नमूने गरीब लेबलिंग, गरीब प्रतिक्रियाएं और कोशिकाओं रिकॉर्डिंग के दौरान मर सकते हैं दे.

मानव शुक्राणु बहुत तस्वीर क्षति के प्रति संवेदनशील हैं और इसलिए हम न्यूनतम आवश्यक रोशनी (दोनों तीव्रता और जोखिम समय) का उपयोग क्रम में सेल अस्तित्व को अधिकतम और कोशिका मृत्यु की वजह से कलाकृतियों को कम से कम. एक कैमरा उच्च संवेदनशीलता कम तीव्रता रोशनी के उपयोग की अनुमति एक महान लाभ है के बाद से कैमरा कमजोर प्रतिदीप्ति ले जाएगा. वापस प्रबुद्ध EM-सीसीडी कैमरों विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल हैं, हालांकि बहुत महंगा है. एलईडी रोशनी (उत्तेजना फिल्टर के साथ एक क्सीनन या पारा दीपक का उपयोग करने के बजाय यह भी सेल अस्तित्व (Nishigaki एट अल, 2006) में सुधार.

हम Fura-2 का उपयोग नहीं करते हैं अनुपात - मीट्रिक इमेजिंग के स्पष्ट लाभ के बावजूद, क्योंकि Fura यूवी प्रकाश के साथ उत्तेजना की आवश्यकता है और क्योंकि यह प्रत्येक अनुपात के लिए दो छवियों को ले आवश्यक है. एकल तरंगदैर्ध्य, दृश्य प्रकाश रंजक, बड़े पैमाने पर कोशिकाओं के बीच डाई लोडिंग में अंतर के लिए compensates प्रतिदीप्ति तीव्रता का सामान्यीकरण है, लेकिन एक व्यक्ति सेल के भीतर डाई वितरण के लिए नहीं, और यह मन में वहन किया जाना चाहिए के साथ प्राप्त डेटा के लिए. हालांकि एकल तरंगदैर्ध्य रंजक, सिद्धांत रूप में, कैलिब्रेटेड जा सकता है, तकनीक की सटीकता गरीब है और हम यह करने के लिए प्रयास नहीं करते.

जबकि अनुपात Fura - 2 (या उत्सर्जन अनुपात डाई भारत) के साथ प्राप्त अंशांकन के बिना भी, डेटा, में एक रिश्तेदार परिवर्तन के acceptably वफादार प्रतिनिधित्व दे ^{[2 Ca} +], मैं एकल तरंगदैर्ध्य रंगों के प्रतिदीप्ति तीव्रता रैखिक से दूर है [ca ^{2 +]} i. से संबंधित एकल तरंगदैर्ध्य रंजक के लिए संतृप्ति वक्र के सबसे उपयोगी हिस्सा ओवर संबंध आमतौर पर लघुगणकीय approximates. हम वर्तमान में उपयोग ओरेगन ग्रीन BAPTA 1 (चित्रा 4) क्योंकि यह में छोटे परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है ^[2 Ca ^+] मैं करीब स्तर (5-10 एनएम) आराम करने के लिए. जब [Ca ^{+ 2]} मैं उगता ऊपर 1 सुक्ष्ममापी प्रतिक्रियाओं के तहत प्रतिदीप्ति परिवर्तन और डाई के मामले में प्रतिनिधित्व हो सकता है तर जाएगा . यूवी उत्तेजना के लिए सहारा के बिना तकनीक के सुधार के लिए एक विकल्प Fluo-3 और Fura लाल के रूप में एक डाई के साथ लोड कोशिकाओं डबल है. दोनों 488 एनएम उत्साहित किया जा सकता है, लेकिन एक साथ अपनी प्रतिक्रिया बहुत अलग हैं. उत्सर्जन के 540 और 650 एनएम पर रिकॉर्डिंग एक अनुपात है जो की सही निगरानी के लिए एक बेहतर तरीका प्रदान कर सकते हैं प्रदान ^करता है ^[2 Ca +] (Haughland 2002) मैं और शुक्राणु (Nisigaki एट अल, 2006) लागू किया जा सकता है.

चित्रा 4 ओरेगन BAPTA-1 ग्रीन और ओरेगन ग्रीन BAPTA 2 - के लिए मुफ्त ^{[2 Ca} +] (एनएम) और शिखर तरंगदैर्ध्य (लगभग 525 एनएम) में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के बीच संबंध. OGB1 एक उच्च आराम पर प्रतिदीप्ति देता ^[2 Ca ^+] लेकिन निचले स्तर पर संतृप्त और इस तरह एक छोटे useable रेंज है. इन भूखंडों के लिए डेटा आण्विक जांच पुस्तिका (Haughland 2002) से प्राप्त किया गया.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low light level Camera	QImaging	Rolera XR
Oregon Green BAPTA-1	Invitrogen	06807
Imaging Software	Andor	IQ
Imaging Software	National Institutes of Health	Image J	Public domain software
LED illumination system	Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)	Invitrogen	P3000MP