Summary
刺激诱发的[Ca
Abstract
荧光显微镜观察细胞，用荧光，CA加载
Protocol
从健康生育男性的精子与正常的精液分析，通常准备如下成像。
- 精液样本存储在37 ° C，不超过30分钟。细胞是孤立的精浆游泳进入补充Earle的平衡盐的解决方案（sEBSS起来; mM的：1.8氯化钙2 .2 H 2 Ø，5.37氯化钾，0.81硫酸镁4 .7 H，26.2碳酸氢钠3，1.0的NaH 2 PO 4。 · 2H 2 O，116.4氯化钠，55.6 D -葡萄糖，2.73娜丙酮酸，乳酸41.8娜）辅以0.3％的木炭de-lipidated/fatty酸免费分数V牛血清白蛋白（BSA的质量是成功的精子获能的关键）。 1毫升sEBBS吸管到每一个系列的5毫升管，轻轻地用0.3毫升精液underlayered。经过潜伏期为1小时（37 ° C，6％的CO 2）0.7毫升，轻轻地从每管和汇集。 10μL精子悬液稀释90μL的1％（V / V）福尔马林固定的细胞，那么精子计数在纽鲍尔室。然后调整细胞密度在暂停（含sEBSS）至600万细胞/ ml。
- 样本，然后分为200μL分装松散皑皑管和孵育（37℃; 6％的CO 2），允许在5-6 h获能。
- 盖玻片（22x50毫米）先前已与D -聚赖氨酸处理。 10μLD -聚赖氨酸溶液（10％W / V）是适用于盖玻片中心的小水珠。聚- D -赖氨酸然后让其自然风干。这可以在加热阶段，并应完全干燥。盖玻片附有一个封闭的，专用的，perfusable，聚碳酸酯成像室（尺寸35毫米× 20毫米× 5毫米;容量≈180μL）。华纳RC20室类似D -聚赖氨酸的真空润滑脂涂层盖玻片形式当细胞被认为在一个倒置显微镜和一个直径为12毫米的圆形盖玻片上表面形式的会议厅，使光的传输室的基础。
- 俄勒冈州绿BAPTA1 - AM（OGB）或钙绿1 - AM是用于标签的细胞。 OGB准备在DMSO溶解。聚醚酸F127（清洁剂）是包括在二甲基亚砜，以防止“聚集”的染料。这可以准备的实验室（100毫克0.5毫升DMSO聚醚），使用前，或可以购买预先准备。 20μL添加到OGB 50微克（2.5毫克/毫升）等分。小瓶然后可以存储以备后用冷冻和解冻。
- 精子获能后（5-6小时，在sEBBS 37 ° C，6％的CO 2）管成像和1.2μLOGB解决方案中选择添加，给予终浓度为10μm 。管然后再孵育40分钟后，将细胞悬液轻轻地注入到一个P1000（蓝色）枪头成像室流入端口。会议厅内放置在孵化器，D -聚赖氨酸涂层的盖玻片一侧向下，20分钟。细胞往往游泳沿室的表面，将坚持以D -聚赖氨酸涂层的面积。
- 现在会议厅内安装在显微镜上，灌注设备，并连接到灌注约0.5毫升/分钟。滚子泵饲料生理盐水出境口岸进入会议厅和溢出是一个陷阱吸泵中删除。离开的准备工作至少10分钟，在黑暗中，而松散的细胞和细胞外染料灌注室中删除。温度稳定性是非常重要的的，因为小的波动， 不仅可能影响细胞的 Ca 2 +稳态，但也可能会影响K的D的染料。实验，一般在25℃，维持在这个级别的黑暗的房间温度达到。我们发现，室温保持在所要求的水平，提供比使用一个温度控制的阶段或盐水流入温控加热器更高的温度和重点稳定性。
- 细胞被认为在选择目标和成像领域的相衬（40X或60X油浸）。 D -聚赖氨酸涂布面积的进气口附近的部分是首选，生理盐水流动是层流和一致。同样重要的是使用面积是适当的细胞密度（密度过度影响质量和数据的完整性，通过相邻细胞的信号皮卡）和细胞充分附着，但鞭毛的活动是明显的。相衬图像将被保存。该显微镜，然后切换时间缩短为获得清晰的荧光图像（通常是50-200毫秒）所需的最低荧光模式（激发480 nm处;排放量为540 nm）和曝光。
- 实验开始激活的时间序列图像采集软件（IQ）。通常，图像采集0.1 Hz和光照是限制图像采集期间只使用一个softwaRE控制快门。可以使用更大的图像采集率，但必须褪色的问题，由于光损伤的细胞（见讨论）代文物津贴。智商（和其他大多数采集软件平台）将允许在实验过程中实时荧光图形。
- 经过3-5分钟，持续时间盐碱成分操纵（如的[Ca 2 +] O）和应用药物控制期间是实现替代生理盐水灌注头。此外每个刺激的时间，使成像室的到来的时间可以计算，这里描述（在0.1赫兹采样）的反应缓慢的评估提供足够的精度。加入直接刺激盐水流量通过第二流入华纳RC20厅提供的端口，可以实现更高的精度更迅速的反应。
- 图像分析脱机状态下使用的智商。利益（投资回报）的地区是一轮每个单元格（或单元的一部分），并绘制细胞区是由软件选择（自动背景减法。图像序列，然后检查，以去除细胞死亡或接受精子顶体反应（这似乎在实验过程中，那些表现出足够的运动时间序列分析时造成的文物的细胞质染料亏损）作为荧光大和快速增加。
- 时间的荧光强度系列，然后获得每个投资回报率和离线在Excel中，这些数据进行分析。最初荧光标准化控制期间取得的平均值，用公式R = [（FF 休息 ）/ 休息 ] × 100％，其中R％荧光的变化，控制期间相比，F是荧光强度在时间t和F 的其余部分是控制期间获得至少30的F测定的平均值。
代表性的成果
图1显示的图像与3微米的孕激素刺激细胞实验系列。在灰度显示上排和电影1的荧光图像和图所示相同的法师（电影2）伪（查找表'16_colors在图像J），其中“酷”的颜色表明荧光强度低， “温暖”的颜色表示荧光强度高。细胞可视为在伪实验过程中，使用查找表的智商，但使用灰度一般比较翔实的评估。细胞是否标记。前两个图像采集0秒和100秒后开始录音。荧光应稳定，而且往往在后顶体面积和精子颈部。孕酮进入约175小号成像室和3和第 4 次的图像（180 s和220章第），显示了快速增长的[Ca 2 +] i的（荧光），原产于后头部和颈部区域的细胞。随后的图像是290，360，740，990和1440小号，显示初始衰减的[Ca 2 +] i的瞬态和一所中学的持续海拔发展。图2显示了一个电子表格分析，原始荧光值转换为每个归荧光的投资回报率（％相比，这一控制时期的变化，荧光），图3显示了时间标准化荧光图3显示“典型”的反应，3微米的孕激素的细胞。
图1。示例数据从一个细胞与孕激素的刺激。一系列灰度（上排）和伪（下排）的荧光图像显示。时间点0，180，220，290，360和990s。 3微米的孕激素进入成像室，在175号投资回报是第一个面板中显示。
图2：在Excel中的单细胞荧光数据分析。在黑色的数字荧光数据的时间序列，垂直排列。红色数字（下）都用在文本中的方程获得的规范化的数据。图表显示归为64细胞的荧光在这个实验中，刺激后，显示在荧光瞬态一个缓慢的上升和一系列小的振荡上升的情节。
图3。时间的痕迹，3个单个细胞的荧光表达方面控制值增减％... 3微米孕酮是由箭头标记的时间。虚线显示平均控制荧光。
Discussion
当成功地进行了，这种技术允许自发和诱发的Ca 2 +信号在人类精子的分布和动力学的录音。可从大量的细胞（最多200个），这是重要的，因为人类的精子可以在其自发的和刺激的Ca 2 +信号显示了很多的变化的响应。成功的标签，在录制过程中细胞的生存高度依赖对样品质量。可怜的样品给穷人标签，不良反应和细胞可能会死在录制过程中。
人类精子是非常敏感的光损伤，因此，我们用最低限度的，必要的照明（强度和曝光时间），以最大限度地提高细胞的存活和尽量减少由于细胞死亡的文物。一个高感光摄像头（允许使用低强度的照明）是大有裨益的，因为相机会拿起弱荧光。背照，EM - CCD相机特别适合，但非常昂贵。 LED照明（而不是使用一个氙汞灯激发滤光片也可提高细胞存活率（西垣等人，2006年）。
我们不使用FURA - 2，尽管比例度量成像的明显优势，因为FURA需要用紫外光激发，因为它是有必要采取两个图像，每个比例。对于单一波长，可见光染料，荧光强度正常化，主要为在细胞之间的染料加载差别进行补偿，但没有为单个细胞内的染料分布，这必须牢记获得的数据。虽然单一波长的染料，在原则上可以进行校准，技术的准确性差，而且我们不打算这样做。
而比例FURA - 2（或排放比染料印度）获得的数据，甚至无需校准，相对变化可以接受的忠实代表的[Ca 2 +] i的，单一波长的染料荧光强度远从线性相关的[Ca 2 +] i的在最有用的部分饱和曲线为单一波长染料的关系通常近似为对数。我们目前使用俄勒冈绿BAPTA - 1（图4），因为它是敏感的小变化的[Ca 2 +] i的接近静息水平（50-100纳米）。当的[Ca 2 +]我上升1微米以上的反应将荧光的变化和染料的代表性不足可能饱和。改善技术选项，而不诉诸紫外线激发双重负载细胞，如氟- 3和FURA红色染料。都可以被激发波长为488，但同时他们的反应是非常不同的。在540和650 nm处的排放记录提供了一个比它可以提供一个更好的方法，准确监测的[Ca 2 +] i的（Haughland 2002年），并可能适用于精子（Nisigaki等，2006 ）。
图4。俄勒冈绿BAPTA - 1和俄勒冈州的绿BAPTA - 2免费的[Ca 2 +（nm）和荧光发射峰值波长（约525纳米）之间的关系。 OGB1给出了一个较高的荧光在休息的[Ca 2 +]，但饱和在较低水平，从而有一个较小的可用范围。从分子探针手册（Haughland 2002年）获得这些地块的数据。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由威康信托基金会，英国医学研究理事会，英国皇家学会科学城，伯明翰和不孕不育研究信托基金资助。我们要感谢山研究的专家的协助下，在建设和整合成像钻机。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low light level Camera | QImaging | Rolera XR | |
| Oregon Green BAPTA-1 | Invitrogen | 06807 | |
| Imaging Software | Andor | IQ | |
| Imaging Software | National Institutes of Health | Image J | Public domain software |
| LED illumination system | Cairn Research | Opto LED | |
| Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) | Invitrogen | P3000MP |
References
- Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).
- Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41, 191-197 (2006).
