Summary
Estímulo evocado [Ca
Abstract
Microscopia de fluorescência de células carregadas com fluorescentes, Ca
Protocol
Esperma de homens saudáveis fértil, com uma análise do sêmen normal, são normalmente preparadas para imagens como se segue.
- Amostras de sêmen são armazenadas a 37 ° C por não mais de 30 min. Células são isoladas do plasma seminal de nadar até em complementada solução salina de Earle equilibrada (sEBSS; mM: 1,8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 .7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, NaCl 116,4, 55,6 D-glicose, 2,73 piruvato Na, 41,8 lactato Na) suplementado com 0,3% de carvão de-lipidated/fatty ácido livre Fraction V BSA (qualidade da BSA é crucial para o sucesso da capacitação espermática). 1 ml de sEBBS é pipetado em cada um de uma série de 5 tubos de ml e gentilmente underlayered com 0,3 ml de sêmen. Após a incubação por 1 hora (37 ° C; 6% CO 2) a 0,7 ml de topo é suavemente retirada de cada tubo e agrupados. 10 ml da suspensão de espermatozóides é diluído com 90 mL de 1% (v / v) de formol para imobilizar as células, então, os espermatozóides são contados em câmara de Neubauer. Densidade de células na suspensão é então ajustada (com sEBSS) a 6 milhões de células / ml.
- A amostra é então dividido em alíquotas de 200 mL em tubos fracamente cobertas e incubadas (37 ° C; 6% CO 2) por 5-6, em h para permitir a capacitação.
- Lamelas (22x50 mm) foram previamente tratadas com poli-D-lisina. 10 ml de poli-D-lisina solução (10% w / v) é aplicado como um número de gotas pequenas para o centro da lamela. O poli-D-lisina é então permitido secar ao ar. Isto pode ser em um palco e deve ser aquecida até à dessecação completa. A lamela é anexado com graxa de vácuo para um fechado, purpose-built, perfusable, policarbonato imagem câmara (dimensões 35 mm x 20 mm x 5 mm, capacidade de ≈ 180 mL). Semelhantes à câmara RC20 Warner O poli-D-lisina lamela revestido forma a base da câmara quando as células são visualizadas em um microscópio invertido e 12 mm de diâmetro circular lamela forma a superfície superior da câmara, permitindo a transmissão de luz.
- Oregon Verde BAPTA1-AM (OGB) ou cálcio Verde 1-AM são usados para as células de rotulagem. OGB é preparada pela dissolução em DMSO. PLURONIC ácido F127 (detergente) está incluído no DMSO para evitar "aglomeração" do corante. Isto pode ser preparado em laboratório (100 PLURONIC mg em 0,5 ml DMSO), imediatamente antes do uso, ou pode ser adquirido pré-preparados. 20 l é adicionado a uma alíquota de 50 mg de OGB (2,5 mg / ml). O frasco pode ser conservado congelado e descongelado para uso posterior.
- Após a capacitação dos espermatozóides (5-6 h em sEBBS, 37 ° C; 6% CO 2) de um tubo é selecionado para imagens e 1,2 ml de solução OGB é adicionado, dando uma concentração final de 10 mM. O tubo é então incubada por 40 min mais um, após o qual a suspensão celular é suavemente injetada na porta de entrada da câmara de imagem com um p1000 ponta da pipeta (azul). A câmara é colocada no lado lamela incubadora, poli-D-lisina-revestido para baixo, por 20 min. Células tendem a nadar ao longo das superfícies da câmara e vai aderir ao espaço poli-D-lisina-revestido.
- A câmara está montada no microscópio, conectado ao aparelho de perfusão e perfundidos em min aproximadamente 0,5 ml /. A bomba de roletes alimenta salina na câmara e estouro da porta de saída é removido por uma bomba de sucção com armadilha. A preparação é deixado no escuro por pelo menos 10 min, enquanto as células soltas e corante extracelular são removidos por perfusão da câmara. Estabilidade de temperatura é crucialmente importante porque pequenas flutuações podem não afetam apenas células Ca 2 + homeostase, mas também pode afetar K d do corante. Experimentos são normalmente realizadas a 25 ° C, alcançado por manter a temperatura da sala escura, a este nível. Nós descobrimos que a manutenção da temperatura ambiente no nível exigido proporciona maior estabilidade de temperatura e foco do que usar um estágio de temperatura controlada ou um aquecedor controlado termostaticamente sobre o fluxo de solução salina.
- Células são vistas sob contraste de fase (40x ou 60x de imersão em óleo) objetivas e uma área para a imagem é selecionada. A parte da área poli-D-lisina revestido que está perto da porta de entrada é a preferida, onde o fluxo de solução salina é laminar e consistente. Também é importante o uso de uma área onde a densidade celular é apropriado (densidade excessiva afeta a qualidade e integridade de dados através da captação de sinal a partir de células adjacentes) e onde as células estão devidamente ligados mas a atividade flagelar é discernível. Uma imagem de contraste de fase é salvo. O microscópio é então ligado ao modo de fluorescência (excitação 480 nm; nm de emissão 540) e tempo de exposição é reduzido ao mínimo necessário para obter uma imagem clara de fluorescência (geralmente 5-20 ms).
- O experimento é iniciado pela ativação da série de tempo software de aquisição de imagem (IQ). Geralmente as imagens são adquiridas a 0,1 Hz e iluminação é restrita aos períodos de aquisição de imagens usando apenas um software obturador controlado. Taxas de aquisição muito maior imagem pode ser usada mas tendo em conta deve ser feita para problemas de branqueamento e geração de artefatos devido a foto de danos às células (ver discussão). IQ (e mais outras plataformas de software de aquisição) permitirá em tempo real de gráficos de fluorescência durante o experimento.
- Após um período de controle de 3-5 minutos de duração manipulação de constituintes salina (como [Ca 2 +] o) e aplicação de drogas é conseguido através da substituição de soro fisiológico no cabeçalho de perfusão. Tempo de adição de cada estímulo é anotado para que o tempo de chegada na câmara de imagem pode ser calculada, fornecendo uma precisão suficiente para a avaliação das respostas lentas descrito aqui (amostrado a 0,1 Hz). Para respostas mais rápidas maior precisão pode ser obtida pela adição de estímulos diretamente para o fluxo de soro fisiológico através de uma porta entrada segundo, tal como previsto no RC20 Warner câmara.
- As imagens são analisados off-line usando QI. Regiões de interesse (ROIs) são desenhados em volta de cada célula (ou parte da célula) e também uma área livre da pilha é selecionado (por subtração de fundo automática pelo software. A série de imagens é então verificado para remover as células que morreram ou foram submetidos a reação acrossômica ( que aparece como um aumento considerável e rápido de fluorescência seguidos de perda de corante citoplasmático) durante o experimento e as que mostraram movimento suficiente para causar artefatos quando analisada como uma série temporal.
- Uma série de intensidade de fluorescência de tempo é, então, obtidos para cada ROI e esses dados são analisados off-line no Excel. Inicialmente fluorescência é normalizado para o valor médio obtido durante o período de controle, usando a equação R = [(resto FF) / F resto] x 100%, onde R é a mudança de fluorescência% em comparação com o período de controle, F é a intensidade de fluorescência no tempo t e descansar F é a média de pelo menos 30 determinações de F obtidos durante o período de controle.
Resultados representante
A Figura 1 mostra uma série de imagens a partir de um experimento no qual as células foram estimuladas com 3 mM progesterona. A linha superior e um filme de mostrar as imagens de fluorescência em escala de cinza e os magos mesmo são mostrados abaixo (e no filme 2) no pseudo (lookup '16_colors tabela 'em Image J), onde' cool 'cores indicam a intensidade fluorescente de baixa e "quente" cores indicam alta intensidade de fluorescência. As células podem ser visualizadas em pseudo durante o experimento, utilizando tabelas de pesquisa de QI, mas usando escala de cinza é geralmente mais informativa para avaliar. Se as células estão bem marcadas. As duas primeiras imagens foram coletadas em 0 s e 100 s após o início da gravação. Fluorescência deve ser estável e tende a ser mais forte na área de pós-acrossomal e pescoço esperma. Progesterona entrou na câmara de imagens em aproximadamente 175 s e 3 ª e 4 ª imagens (180 e 220 s s) mostra um rápido aumento na [Ca 2 +] i (fluorescência), originários da cabeça e pescoço posterior da célula. Imagens seguintes são de 290, 360, 740, 990 e 1440 s, mostrando a decadência da inicial [Ca 2 +] i transitória e desenvolvimento de uma elevação sustentada secundário. A Figura 2 mostra uma análise de planilhas, convertendo-prima valores de fluorescência para cada ROI de fluorescência normalizados (% de mudança de fluorescência em comparação com o período de controle) A Figura 3 mostra-tempo normalizado parcelas de fluorescência por 3 células mostrando "típico" respostas a 3 mM progesterona.
Figura 1. Exemplo de dados de uma célula estimulada com progesterona. Uma série de imagens de fluorescência em tons de cinza (linha superior) e pseudo (linha inferior) são mostrados. Pontos no tempo são de 0, 180, 220, 290, 360 e 990s. 3 progesterona mM entrou na câmara de imagens a 175 s. ROIs são mostrados no primeiro painel.
Figura 2. Análise de dados única célula de fluorescência em Excel. Números em preto são séries temporais de dados de fluorescência, dispostos verticalmente. Números em vermelho (abaixo) são dados normalizados obtidos pela equação dada no texto. Gráfico mostra enredo fluorescência tempo normalizado para 64 celulares neste experimento que, com a estimulação, mostra uma elevação transitória na fluorescência seguido por um crescimento lento e uma série de pequenas oscilações.
Figura 3. Fluorescência em tempo vestígios de três células individuais, expressa como alteração% em relação ao controle de valor .. 3 progesterona mM foi adicionado no momento marcado pela seta. Mostra linha tracejada significa fluorescência de controle.
Discussion
Quando realizados com sucesso, esta técnica permite a gravação da distribuição e da cinética de espontânea e induzida por Ca 2 + sinais no esperma humano. Respostas podem ser obtidas a partir de um grande número de células (até 200), que é importante, pois o esperma humano pode mostrar uma grande variação na sua espontânea e estimulada Ca 2 + sinais. Rotulagem de sucesso e sobrevivência das células durante a gravação são altamente dependentes da qualidade da amostra. Amostras pobres dão rotulagem pobres, as respostas pobres e as células podem morrer durante a gravação.
Esperma humano são muito sensíveis a danos foto-e, portanto, use a iluminação mínima necessária (tanto a intensidade e tempo de exposição), a fim de maximizar a sobrevivência da célula e minimizar artefatos devido à morte celular. Uma câmera de alta sensibilidade (permitindo uso de iluminação de baixa intensidade) é um grande benefício já que a câmera vai pegar fluorescência fraca. Retro-iluminado, EM-câmeras CCD são particularmente bem adequada, embora muito caro. Iluminação de LED (em vez de usar uma lâmpada de mercúrio ou de xenônio com filtro de excitação também melhora a sobrevivência da célula (Nishigaki et al, 2006).
Nós não usamos Fura-2, apesar das vantagens óbvias de relação de métricas de imagem, porque Fura requer excitação com luz UV e porque é necessário tomar duas imagens para cada relação. Para os dados obtidos com único comprimento de onda, corantes luz visível, a normalização da intensidade de fluorescência compensa largamente diferença no carregamento de corante entre as células, mas não para distribuição de tinta dentro de uma cela individual, e isso deve-se ter em mente. Apesar de corantes único comprimento de onda pode, em princípio, ser calibrado, a precisão da técnica é pobre e não tentar fazer isso.
Considerando que os dados obtidos com relação Fura-2 (ou a emissão de relação de corante indo), mesmo sem calibração, dar uma representação fiel aceitável de mudanças relativas de [Ca 2 +] i, a intensidade de fluorescência dos corantes único comprimento de onda está longe de ser linear relacionados com a [Ca 2 +] i. Sobre a parte mais útil da curva de saturação a relação de corantes único comprimento de onda é normalmente próximo a logarítmica. Atualmente usamos Oregon Verde BAPTA-1 (Figura 4), porque ele é sensível a pequenas alterações na [Ca 2 +] i perto de descanso nível s (5-10 nM). Quando [Ca 2 +] i sobe acima de 1 mM respostas serão sub-representados em termos de mudança de fluorescência ea tintura pode saturar. Uma opção para aprimoramento da técnica, sem recorrer a excitação UV é dobrar células de carga com um corante como Fluo-3 e vermelho Fura. Ambos podem ser animado a 488 nm, mas simultânea suas respostas são muito diferentes. Gravação de emissão a 540 e 650 nM fornece uma relação que pode fornecer um método melhor para o monitoramento preciso de [Ca 2 +] i (Haughland, 2002) e pode ser aplicável ao esperma (Nisigaki et al, 2006).
Figura 4. Relação entre livre [Ca 2 +] (nm) e emissão de fluorescência no pico de comprimento de onda (nm aproximadamente 525) Oregon Verde BAPTA-1 e Verde Oregon BAPTA-2. OGB1 dá uma maior fluorescência em repouso [Ca 2 +], mas satura em níveis mais baixos e, portanto, tem um intervalo menor utilizável. Dados para essas parcelas foram obtidos a partir da Molecular Probes manual (Haughland, 2002).
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é financiado pelo Wellcome Trust, The Medical Research Council, The Royal Society, Ciência Birmingham City e The Research Trust Infertilidade. Gostaríamos de agradecer o apoio de especialistas de Pesquisa Cairn em construção e integração dos equipamentos de imagem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low light level Camera | QImaging | Rolera XR | |
| Oregon Green BAPTA-1 | Invitrogen | 06807 | |
| Imaging Software | Andor | IQ | |
| Imaging Software | National Institutes of Health | Image J | Public domain software |
| LED illumination system | Cairn Research | Opto LED | |
| Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) | Invitrogen | P3000MP |
References
- Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).
- Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41, 191-197 (2006).
