Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Billedbaserede metoder til at studere membranhandel i stomatale afstamningsceller

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65257
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Flere almindeligt anvendte metoder introduceres her til at studere membranhandelshændelserne for en plasmamembranreceptorkinase. Dette manuskript beskriver detaljerede protokoller, herunder plantematerialeforberedelse, farmakologisk behandling og opsætning af konfokal billeddannelse.

Abstract

I eukaryote celler transporteres membrankomponenter, herunder proteiner og lipider, spatiotemporalt til deres destination inden for endomembransystemet. Dette omfatter sekretorisk transport af nyligt syntetiserede proteiner til celleoverfladen eller ydersiden af cellen, endocytisk transport af ekstracellulære laster eller plasmamembrankomponenter ind i cellen og genbrug eller shuttling transport af laster mellem de subcellulære organeller osv. Membranhandel er afgørende for udvikling, vækst og miljøtilpasning af alle eukaryote celler og er derfor under streng regulering. Celleoverfladereceptorkinaser, som opfatter ligandsignaler fra det ekstracellulære rum, gennemgår både sekretorisk og endocytisk transport. Almindeligt anvendte tilgange til at studere membranhandelshændelserne ved hjælp af en plasmamembranlokaliseret leucinrig gentagelsesreceptorkinase, ERL1, er beskrevet her. Tilgange omfatter forberedelse af plantemateriale, farmakologisk behandling og opsætning af konfokal billeddannelse. For at overvåge den rumlige tidsmæssige regulering af ERL1 beskriver denne undersøgelse colokaliseringsanalysen mellem ERL1 og et multivesikulært kropsmarkørprotein, RFP-Ara7, tidsserieanalysen af disse to proteiner og z-stack-analysen af ERL1-YFP behandlet med membranhandelshæmmerne brefeldin A og wortmannin.

Introduction

Membrantrafik er en bevaret cellulær proces, der distribuerer membrankomponenter (også kendt som laster), herunder proteiner, lipider og andre biologiske produkter, mellem forskellige organeller i en eukaryot celle eller over plasmamembranen til og fra det ekstracellulære rum1. Denne proces lettes af en samling membraner og organeller kaldet endomembransystemet, som består af kernemembranen, det endoplasmatiske retikulum, Golgi-apparatet, vakuolen / lysosomerne, plasmamembranen og flere endosomer1. Endomembransystemet muliggør modifikation, emballering og transport af membrankomponenter ved hjælp af dynamiske vesikler, der pendler mellem disse organeller. Membranhandel er afgørende for celleudvikling, vækst og miljøtilpasning og er derfor under streng og kompleks regulering2. I øjeblikket er flere tilgange inden for molekylærbiologi, kemisk biologi, mikroskopi og massespektrometri blevet udviklet og anvendt inden for membranhandel og har i høj grad avanceret forståelsen af den rumlige tidsmæssige regulering af endomembransystemet 3,4. Molekylærbiologi bruges til klassiske genetiske manipulationer af de formodede aktører, der er involveret i membranhandel, såsom at ændre genekspressionen af proteinet af interesse eller mærke proteinet af interesse med visse tags. Værktøjer i kemisk biologi omfatter brugen af molekyler, der specifikt forstyrrer trafikken på visse ruter 4,5. Massespektrometri er kraftfuld til at identificere komponenterne i en organel, der er blevet mekanisk isoleret ved biokemiske tilgange 3,4. Membrantrafik er imidlertid en dynamisk, forskelligartet og kompleks biologisk proces1. For at visualisere membranhandelsprocessen i levende celler under forskellige forhold er lysmikroskopi et vigtigt værktøj. Der er gjort løbende fremskridt inden for avancerede mikroskopteknikker for at overvinde udfordringerne ved måling af begivenhedernes effektivitet, kinetik og mangfoldighed4. Her fokuserer denne undersøgelse på de bredt anvendte metoder inden for kemisk/farmakologisk biologi, molekylærbiologi og mikroskopi til at studere membrantrafficking-hændelser i et naturligt forenklet og eksperimentelt tilgængeligt system, den stomatale udviklingsproces.

Stomata er mikroporer på planteoverflader, der åbner og lukker for at lette gasudveksling mellem de indre celler og miljøet 6,7,8. Derfor er stomata afgørende for fotosyntese og transpiration, to begivenheder, der er afgørende for plantens overlevelse og vækst. Stomatal udvikling justeres dynamisk af miljømæssige signaler for at optimere plantens tilpasning til omgivelserne9. Helt tilbage fra studier i 2002 åbnede identifikationen af receptorproteinet Too Many Mouths (TMM) døren til en ny æra med at undersøge de molekylære mekanismer for stomatal udvikling i modelplanten Arabidopsis thaliana10. Efter blot et par årtier er en klassisk signalvej blevet identificeret. Fra opstrøms til nedstrøms inkluderer denne vej en gruppe sekretoriske peptidligander i familien epidermale mønsterfaktorer (EFP), flere celleoverfladeleucin-rige-gentagelsesreceptorkinaser (LRR) i EREECTA (ER) familien, LRR-receptorproteinet TMM, en MAPK-kaskade og flere bHLH-transkriptionsfaktorer, herunder SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA og SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Tidligere arbejde indikerer, at en af receptorkinaserne, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstrerer aktiv subcellulær adfærd ved EPF-opfattelse20. ERL2 trafikerer også dynamisk mellem plasmamembranen og nogle intracellulære organeller27. Blokering af membranhandelstrinnene forårsager unormal stomatal mønster, hvilket resulterer i stomatale klynger på bladoverfladen28. Disse resultater tyder på, at membrantrafik spiller en væsentlig rolle i stomatal udvikling. Denne undersøgelse beskriver en protokol til rumligt tidsmæssigt at undersøge ERL1-dynamikken ved hjælp af protein-protein subcellulær colokaliseringsanalyse kombineret med farmakologisk behandling ved hjælp af nogle membranhandelshæmmere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af opløsningerne

  1. Forbered frøsteriliseringsopløsning ved at blande 15 ml blegemiddel med 35 ml destilleret vand og 50 μL Triton X-100.
  2. Der fremstilles brefeldin A (BFA)-opløsning ved at opløse BFA-pulveret i ethanol til en slutkoncentration på 10 mM (stam). Forbered wortmannin (Wm) opløsning ved at opløse Wm pulver i DMSO til en endelig koncentration på 10 mM (lager).

2. Såning af frøene

  1. Alikvote 10-50 frø fra hver af de krævede transgene planter i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 1 ml frøsteriliseringsopløsning i hvert rør, og bland grundigt ved at vende røret forsigtigt i 10 minutter på en ryster.
  2. Kassér frøsteriliseringsopløsningen, og vask frøene med 1 ml autoklaveret destilleret vand fem gange.
  3. Tilsæt 300 μL autoklaveret destilleret vand i hvert rør, og så frøene på halv styrke MS medier indeholdende 1% (w / v) saccharose og 0,75% (w / v) agar. Suppler mediet med de tilsvarende antibiotika efter behov.
  4. Hold pladen på hovedet ved 4 °C i mørke i 2 dage for at synkronisere spiringen.
  5. Efter 2 dage overføres pladen til et vækstrum med en 16 timers lys/8 timers mørk cyklus (80 μmol/m2/s1) ved 22 °C. Dette betragtes som den første dag efter spiring (1 dpg).
  6. Transplanter frøplanterne i jord ved 10 dpg for yderligere vækst.

3. Forberedelse af dobbeltfarvede F1 transgene planter

  1. Der dyrkes homozygote transgene planter med ERL1-YFP (plante A) og homozygote transgene planter med et RFP-mærket markørprotein RFP-Ara7 (plante B)20 side om side, indtil de blomstrer i et vækstrum med en 16 timers lys/8 timers mørk cyklus (80 μmol/m2/s1) ved 22 °C.
  2. Vælg en ung blomsterstand fra plante A. Hold en blomst, der er lige ved at åbne på blomsterstanden for genetiske kryds. Fjern alle de ældre blomster og siliques. Fjern desuden forsigtigt de yngre blomster og blomstermeristemer for at undgå fremtidig forvirring.
  3. Disseker forsigtigt den uåbnede blomst ved at fjerne bægerblade, kronblade og støvdragere ved hjælp af en skarp pincet. Lad kun støvlen stå på blomsterstanden.
  4. Tag en moden støvdrager fra en åbnet blomst på plante B, og deponer pollenkornene på stigmatiseringen af den dissekerede støvle på plante A.
  5. Mærk denne manuelt krydsede blomst ved at angive dens far, mor og datoen for det genetiske kryds. Lad blomsten modne, og høst F1 frøene, når silique bliver gul / brun (~ 20 dage efter krydset). Se efter et vellykket F1-anlæg, der har både YFP- og RFP-signaler.

4. Farmakologisk behandling

  1. Til BFA-behandlingen fjernes cotyledonerne fra 7 dage gamle frøplanter, nedsænkes resten af frøplanterne i enten en mockopløsning (0,3% ethanol) eller 30 μM BFA-opløsning, påføres vakuum i 1 min, og hold prøven nedsænket i 30 minutter før billeddannelse.
  2. Til wortmannin-behandlingen skal du fjerne cotyledonerne fra 7 dage gamle frøplanter, nedsænke resten af frøplanterne i enten 0,25% DMSO-opløsning eller 25 mM wortmannin, påføre vakuum i 1 min og holde prøven nedsænket i 30 minutter før billeddannelse.
  3. Til vakuumbehandling af prøver tilsættes 500 μL af den tilsvarende lægemiddelopløsning i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og nedsænkes de dissekerede frøplanter i opløsningen. Sæt en 10 ml sprøjte tæt på mikrocentrifugeglasset, og påfør vakuum i 1 min (figur 1). Fjern sprøjten, og opbevar prøven i opløsningen i den ønskede tid. Tag forsigtigt frøplanterne ud til billeddannelsesforberedelse.

Figure 1
Figur 1: Enkel vakuumanordning. En 10 ml sprøjte er fastgjort til et 1,5 ml mikrocentrifugerør til vakuumbehandlingen. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Prøveforberedelse til billeddannelse

  1. Disseker det sande blad fra den behandlede prøve ved hjælp af et skarpt barberblad. Sæt forsigtigt det sande blad i en dråbe vand på et glasglas, og hold den abaxiale side opad. Dæk langsomt det ægte blad med et dæksel, mens du undgår at fange bobler.

6. Konfokal billeddannelse

BEMÆRK: Et Leica SP8 inverteret scanningskonfokalmikroskop blev brugt til at afbilde fluorescenssignalet fra prøverne i dette arbejde.

  1. Opsætning af strålebane
    1. Vælg en 514 nm laser til YFP excitation. Brug en høj lasereffekt til at øge signalintensiteten og dermed opnå høj billedkvalitet. Imidlertid risikerer laserkræfter over 5% fotoblegning, og prøvens sundhed kan blive påvirket. Hvis prøvesignalet ikke er for svagt, skal du starte ved lav laserintensitet.
    2. Tænd PMT / HyD til detektion, og definer de øvre og nedre emissionsbåndtærskler baseret på spektret for YFP-fluoroforen. Indstil et detekteringsvindue på 530-570 nm for at indsamle YFP-signalet.
    3. Sekventiel billedbehandling for den anden farve: Klik på knappen Seq, og tilføj en ny kanal. Som standard vil den tidligere designede YFP-strålebane være Seq 1. I Seq 2 skal du vælge en 561 nm laser til RFP-excitationen og indstille et detekteringsvindue på 570-630 nm til at indsamle RFP-signalet.
  2. Opsætning af scanningsbetingelser (Figur 2)
    1. For at afbilde den subcellulære membrantrafikaktivitet i stomatale forløberceller skal du vælge et 63x / 1,2 W Corr-objektiv på systemet til billeddannelse.
    2. Formatet refererer til billedstørrelsen i pixels. Start med 1.024 pixels x 1.024 pixels, og optimer derefter dette baseret på zoomfaktoren og de objektive indstillinger for en god opløsning af publikationskvalitet.
    3. Hastigheden refererer til scanningshovedets hastighed, når laseren passerer over hver pixel. Selvom langsomme scanningshastigheder ofte resulterer i et bedre signal-støj-forhold, fanger de muligvis ikke effektivt de hurtigt skiftende membranhandelshændelser. Start med en hastighed på 400 Hz, og optimer dette baseret på prøvernes specifikke situation.
    4. Zoomfaktoren bruges til at zoome ind på et område af interesse uden at ændre objektivet. Start med en zoomfaktor på 1, og optimer denne baseret på eksperimentets specifikke behov.
    5. Linjegennemsnittet refererer til antallet af gange, hver X-linje scannes for at opnå et gennemsnitligt resultat. Et større linjegennemsnit reducerer støjen i det resulterende billede, men det øger også scanningstiden og eksponeringstiden for laserlyset. For at afbilde membrantraffickinghændelser skal du ikke bruge et højt linjegennemsnit. Start med et gennemsnit på 2x linjen, og optimer efter behov.
  3. Indsamling af en tidsserie
    BEMÆRK: Når man studerer membranhandelshændelser, er der ofte behov for en tidsserie for at registrere den hurtige bevægelse af de subcellulære endosomer.
    1. I anskaffelsestilstand skal du vælge xyt-scanningstilstand for at aktivere tidsserieværktøjet.
    2. Bestem en ventetid mellem tidspunkterne under Tidsinterval. Alternativt kan du klikke på Minimer for at tage billederne straks efter hinanden. Et 7 s tidsinterval blev anvendt i følgende tidsserieeksperiment.
    3. Vælg Varighed, og angiv den samlede tid, eksperimentet skal køre. Du kan også definere antallet af billeder, der skal indsamles, ved at vælge Rammer (figur 3).
  4. For at indsamle de tredimensionelle oplysninger om membranhandelshændelsen i hele cellen skal du bruge Z-stack-scanningstilstanden. Den maksimale intensitetsprojektion af Z-stack-billederne bruges ofte til analysen.
    1. Vælg xyz-scanningstilstand i erhvervelsestilstand, og derefter bliver Z-Stack-værktøjet tilgængeligt.
    2. Vælg indstillingen Z-bred . Under scanningstilstand skal du definere det øverste billede og det nederste billede af Z-stakken ved hjælp af knapperne Start og Slut .
    3. Definer tykkelsen af z-trinnet ved at klikke på z-trinstørrelse. Alternativt kan du definere, hvor mange billeder der skal tages for at dække hele Z-stakkens område. For at sikre konsistens mellem prøverne defineres z-trinstørrelsen (figur 4).
  5. Billedbehandling
    1. Den maksimale intensitetsprojektion af z-stack-billederne genereres af den konfokale software (http://www.leica-microsystems.com). På den primære procesfane skal du først vælge den interesserede z-stack-fil under fanen Åbn projekter yderst til venstre. Skift derefter til den midterste fane med navnet Procesværktøjer, vælg projektionsfunktionen , vælg Maksimum i rullemenuen med Metode, og klik på knappen Anvend . Der genereres et z-stack-projektionsbillede under fanen Åbn projekter.
    2. Videoen af tidsseriebillederne genereres af Fiji (https://imagej.net/Fiji). På fanen Filer skal du bruge funktionen Åbn til at åbne alle tidsseriebilleder i den rigtige rækkefølge. På fanen Billede skal du finde Stack-funktionen og vælge Billeder, der skal stables for at generere en video. Gem filen i .avi-format med den ønskede billedhastighed (5 billeder/s for video 1).

Figure 2
Figur 2: Panelet med scanningstilstand for XY-dimensionen. Panelet med scanningstilstand bruges til at konfigurere billedscanningsbetingelserne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Tidsserieværktøjet under xyt-scanningstilstand. Tidsserieværktøjet bruges til at oprette billeddannelsesbetingelserne for fortløbende at indsamle en række billeder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: z-stack-værktøjet under xyz-scanningstilstand. Z-stack-værktøjet bruges til at indstille billeddannelsesbetingelserne til at indsamle en række billeder på z-aksen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En tidligere undersøgelse viste, at ERL1 er en aktiv receptorkinase, der gennemgår dynamiske membranhandelshændelser20. ERL1 er en transmembran LRR-receptorkinase på plasmamembranen. Nysyntetiseret ERL1 i det endoplasmatiske retikulum behandles i Golgi-legemerne og transporteres yderligere til plasmamembranen. ERL1-molekylerne på plasmamembranen kan opfatte EPF-ligander ved hjælp af deres ekstracellulære LRR-domæne18. Ved aktivering af de hæmmende EPF'er, inklusive EPF1, internaliseres ERL1 i endosomer, transporteres til multivesikulære legemer (MVB) og transporteres derefter ind i vakuolerne til nedbrydning for at afslutte signalet20. I modsætning hertil bevarer den antagonistiske EPFL9-ligand, som fremmer stomatal dannelse14, ERL1 i det endoplasmatiske retikulum. Alternativt kan plasmamembranlokaliseret ERL1 genbruge mellem endosomer og plasmamembranen20.

Her blev transgene planter med ERL1-promotor: :ERL1-YFP dyrket i 7 dage efter ovennævnte protokol. Da det sande blad lige var dukket op, blev det dissekeret til billeddannelse, da ERL1 kun udtrykkes i stomatale afstamningsceller i unge blade20. Som forventet blev spredte celler fremhævet af YFP-signalet, hvor ERL1-YFP mærkede plasmamembranen (figur 5). Derudover blev der også observeret flere punktsignaler, hvilket tyder på, at ERL1 også var lokaliseret til endosomerne.

Flere organeller i planteceller til stede som punkterede fluorescerende signaler, når de observeres under et lysmikroskop, såsom trans-Golgi-netværket og MVB'erne. Når MVB-markørlinjen med RFP-Ara7 blev genetisk krydset med den transgene ERL1-YFP-linje , blev begge markørproteiner observeret ved hjælp af den sekventielle billeddannelsesmetode som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 6 fremhævede RFP-Ara7 flere punktsignaler i næsten alle cellerne, hvilket indikerer MVB'erne i disse celler (figur 6B). Ved sammenlægning med ERL1-YFP-signalet overlappede det meste af det ERL1-YFP-positive punktsæt med RFP-Ara7-mærket punkt. Dette resultat tyder på, at nogle af ERL1-YFP-molekylerne transporteres til MVB'erne.

For at overvåge dynamikken i disse hurtigt bevægende endosomer blev tidsseriebilleder af de 7 dage gamle ægte blade med ERL1-YFP og RFP-Ara7 indsamlet (figur 7). Tidsintervaller på 7 s blev anvendt i 203 s, og de indsamlede 30 billeder blev brugt til at generere en video i billede J (video 1). Videoen viste, at ERL1-YFP-mærkede endosomer bevægede sig sammen med RFP-Ara7 inden for stomatalafstamningscellerne, hvilket bekræftede, at ERL1-YFP var lokaliseret til MVB'erne.

For at undersøge ERL1-handelsruterne ved hjælp af en farmakologisk tilgang blev effekten af to almindeligt anvendte membranhandelsstoffer, brefeldin A (BFA) og wortmannin (Wm), analyseret. BFA kan ved at hæmme ADP-ribosyleringsfaktoren guanin-nukleotidudvekslingsfaktorer, herunder GNOM, blokere endosomal genanvendelse og endocytose af membranproteiner29. Efter 30 minutters eksponering for BFA-opløsningen blev ERL1-YFP detekteret i nogle store rum kendt som BFA-legemer (figur 8B, C). Dette indikerer, at ERL1-handel kan blokeres af BFA, hvilket tyder på, at ERL1 gennemgår genbrug eller endocytose. Wm kan hæmme phosphatidylinositol-3 og phosphatidylinositol-4 kinaser og forårsager således fusion af MVB'er5. Ved behandling med Wm i 30 minutter blev der observeret nogle ringlignende strukturer fremhævet af ERL1-YFP, som typisk kaldes Wm-legemer (figur 8C). Dette resultat indikerer, at ERL1-YFP transporteres til MVB'er, hvilket tyder på, at ERL1 følger ruten til vakuoler for nedbrydning.

Figure 5
Figur 5: Enkeltplanbillede af ERL1-YFP. (A) Fluorescensbilledet, (B) lysfeltbilledet og (C) det fusionerede billede viser, at ERL1-YFP mærker plasmamembranen og noget meget mobilt punktat i stomatale afstamningsceller. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Sekventielle billeder af ERL1-YFP og RFP-Ara7. (A) ERL1-YFP og (B) RFP-Ara7 mærker begge punktsignaler i cellen. Det hvide punktsæt i (C) det fusionerede billede og (D) det indsatte billede indikerer, at de to proteiner samlokaliserer på MVB'erne inden for stomatale afstamningsceller. De hvide pile angiver endosomer mærket af både ERL1-YFP og RFP-Ara7. De røde pile angiver endosomer mærket af RFP-Ara7. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Tidsseriebilleder af ERL1-YFP og RFP-Ara7. Billederne blev taget med et 7 s tidsinterval. Tidspunktet for hvert billede er angivet i øverste venstre hjørne. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Z-stack-billeder af ERL1-YFP. (A, B) Z-stack-billeder af ERL1-YFP-planter behandlet med (A) mock eller (B) BFA. Tallene i øverste højre hjørne angiver billedets placering i z-stakken fra top til bund. Skalabjælke: 10 μm. (C) Projicering af z-stack-billederne af ERL1-YFP behandlet med mock- eller BFA-opløsning og mock- eller Wm-opløsning som angivet i øverste højre hjørne. Pilene angiver aggregeringsorganerne for ERL1-YFP forårsaget af lægemidlerne. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: Video af tidsseriebillederne af ERL1-YFP og RFP-Ara7. Tidsseriebillederne af ERL1-YFP og RFP-Ara7 stables i en video ved hjælp af Fiji med en hastighed på 5 billeder / s. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endomembransystemet adskiller cytoplasmaet i en eukaryot celle i forskellige rum, hvilket muliggør den specialiserede biologiske funktion af disse organeller. For at levere lastproteiner og makromolekyler til deres endelige destination på det rigtige tidspunkt ledes adskillige vesikler til pendulkørsel mellem disse organeller. Meget regulerede membranhandelshændelser spiller grundlæggende roller i cellernes levedygtighed, udvikling og vækst. Den mekanisme, der regulerer denne afgørende og komplicerede proces, er stadig dårligt forstået.

Flere tilgange er blevet beskrevet her til observation af subcellulær lokalisering af membranproteiner, analyse af co-lokalisering mellem to membranproteiner mærket med forskellige fluorescerende proteiner, overvågning af den dynamiske bevægelse af et membranprotein ved hjælp af tidsseriebilleder og indsamling af 3D-information om et membranprotein ved at udføre z-stack-billeddannelse, der dækker hele cellen. Ud over de membranhandelshændelser, der er beskrevet her, kan disse tilgange let anvendes på andre biologiske processer. For eksempel kan tidsseriebilleddannelse udføres over en langsigtet periode (flere dage) for at overvåge en udviklingsproces30. Z-stack-billeddannelsen kan udføres for at kvantificere forekomsten af et protein i en celle30. Derudover kan disse billeddannelsesmetoder perfekt kombineres med farmakologiske applikationer, herunder forskellige lægemidler, hormoner og endda miljømæssige signaler, hvilket indikerer, at disse billeddannelsesmetoder let kan anvendes til levende biologiske prøver. Ud over fleksibiliteten i prøvebehandlingen kræver de her beskrevne metoder kun økonomisk overkommelige enheder, undtagen konfokalmikroskopet, og kun let træning af personalet i de tekniske færdigheder, hvilket betyder, at disse metoder kan anvendes bredt.

Der skal udvises forsigtighed i flere kritiske trin i protokollen. For det første varierer de optimale koncentrationer af membranhandel afhængigt af materialet og behandlingen. En tidligere undersøgelse tyder på, at 30 μM BFA er en lav koncentration, der kan udløse karakteristisk BFA-kropsdannelse uden at forårsage sammenbrud af Golgi-apparatet i meristemoider20. Ligeledes er 25 μM Wm en lav, men effektiv koncentration, der kan give Wm kropsdannelse uden alvorligt at beskadige meristemoiderne. Når et nyt materiale (forskellige plantearter, forskellige dele af planten osv.) behandles, skal koncentrationerne af lægemidlerne optimeres i overensstemmelse hermed. For det andet, for at opretholde prøvernes fysiologiske tilstand i maksimal grad under behandlingen, holdes frøplanterne delvist intakte (kun fjernelse af cotyledonerne) indtil billeddannelsestrinnet. Ægte blade dissekeres til diasforberedelse, og prøven afbildes bagefter. Hver prøve skal behandles individuelt, og diaset skal laves frisk til billeddannelse. Endelig kræver både z-stack-billeddannelse og tidsseriebilleddannelse gentagen laserscanning af prøven. For at minimere risikoen for fotoblegning og fototoksicitet på prøverne anbefales en lav lasereffekt kraftigt.

Den høje effektivitet af membran trafficking events sikres af mangfoldigheden af smuglerruterne og deres kinetik som reaktion på de specifikke udviklingsmæssige og miljømæssige forhold i celle1. De beskrevne metoder har begrænset rumlig tidsmæssig opløsning, så mere sofistikerede lysmikroskopiteknikker dukker op for at få detaljeret viden om membrantrafik i en eukaryot celle. For eksempel øger superopløsningsmikroskopi, herunder stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM) og fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM), i høj grad den rumlige opløsning af et fluorescensmærket protein31,32, selvom kun faste prøver kan analyseres; Spindeskivemikroskopi accelererer scanningshastigheden væsentligt og reducerer fotoblegningen af prøverne33, selvom det er udfordrende at registrere dynamikken i proteiner med lav overflod ved hjælp af denne metode; lysarkmikroskopi giver hurtig og skånsom 3D-billeddannelse34,35; og to-fotonmikroskopi muliggør påvisning af fluorescenssignaler fra dybere væv35,36, dog på bekostning af lidt lavere opløsning osv. Derudover har kemisk biologi identificeret mere specifikke stoffer, der forstyrrer visse smuglerruter. På trods af begrænsningerne vil disse teknikker sammen med andre nye avancerede teknikker i høj grad forbedre vores viden og kaste lys over mekanismerne i cellemembranhandelssystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) og University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes VWR BD309695 Vacuum samples
Brefeldin A (BFA) Sigma B7651 membrane trafficking drug
Confocal Microscope Leica Lecia SP8 TCS with LAS-X software package Imaging
Dissecting Forceps VWR 82027-402 Genetic cross
Fiji NIH https://imagej.net/Fiji Image processing
Leica LAS AF software Leica http://www.leica-microsystems.com Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7 Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm) Sigma W1628 membrane trafficking drug

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
  3. Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
  4. Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
  5. Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
  6. Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
  7. Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
  8. Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
  9. Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).
  10. Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
  11. Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
  12. Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
  13. Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
  14. Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
  15. Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
  16. Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
  17. Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
  18. Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
  19. Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
  20. Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
  21. MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
  22. Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
  23. Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
  24. Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
  25. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
  26. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
  27. Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
  28. Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
  29. Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
  30. Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
  31. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  32. Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
  33. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  34. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
  35. Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
  36. Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).

Tags

Biologi nr. 195
Billedbaserede metoder til at studere membranhandel i stomatale afstamningsceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, Q., Zhang, H., Qi, X.… More

He, Q., Zhang, H., Qi, X. Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells. J. Vis. Exp. (195), e65257, doi:10.3791/65257 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter