Summary
Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.
Abstract
In eukaryote cellen worden membraancomponenten, waaronder eiwitten en lipiden, spatiotemporaal getransporteerd naar hun bestemming binnen het endomembrane systeem. Dit omvat het secretoire transport van nieuw gesynthetiseerde eiwitten naar het celoppervlak of de buitenkant van de cel, het endocytische transport van extracellulaire ladingen of plasmamembraancomponenten in de cel, en het recyclen of afsluiten van ladingen tussen de subcellulaire organellen, enz. Membraanhandel is cruciaal voor de ontwikkeling, groei en aanpassing van het milieu van alle eukaryote cellen en staat dus onder strenge regelgeving. Celoppervlakreceptorkinasen, die ligandsignalen uit de extracellulaire ruimte waarnemen, ondergaan zowel secretoir als endocytisch transport. Veelgebruikte benaderingen om de membraanhandelgebeurtenissen te bestuderen met behulp van een plasmamembraan-gelokaliseerd leucine-rich-repeat receptorkinase, ERL1, worden hier beschreven. De benaderingen omvatten de bereiding van plantmateriaal, farmacologische behandeling en confocale beeldvorming. Om de spatiotemporale regulatie van ERL1 te monitoren, beschrijft deze studie de co-lokalisatieanalyse tussen ERL1 en een multi-vesiculair lichaamsmarkereiwit, RFP-Ara7, de tijdreeksanalyse van deze twee eiwitten en de z-stackanalyse van ERL1-YFP behandeld met de membraanhandelremmers brefeldine A en wortmannine.
Introduction
Membraanverkeer is een geconserveerd cellulair proces dat membraancomponenten (ook bekend als ladingen), waaronder eiwitten, lipiden en andere biologische producten, verdeelt tussen verschillende organellen binnen een eukaryote cel of over het plasmamembraan van en naar de extracellulaire ruimte1. Dit proces wordt vergemakkelijkt door een verzameling membranen en organellen genaamd het endomembrane systeem, dat bestaat uit het kernmembraan, het endoplasmatisch reticulum, het Golgi-apparaat, de vacuole / lysosomen, het plasmamembraan en meerdere endosomen1. Het endomembrane systeem maakt de modificatie, verpakking en transport van membraancomponenten mogelijk met behulp van dynamische blaasjes die tussen deze organellen pendelen. Membraanhandel is cruciaal voor celontwikkeling, groei en aanpassing aan het milieu en valt dus onder strenge en complexe regelgeving2. Momenteel zijn meerdere benaderingen in de moleculaire biologie, chemische biologie, microscopie en massaspectrometrie ontwikkeld en toegepast op het gebied van membraanhandel en hebben ze het begrip van de spatiotemporale regulatie van het endomembrane systeem aanzienlijk verbeterd 3,4. Moleculaire biologie wordt gebruikt voor klassieke genetische manipulaties van de vermeende spelers die betrokken zijn bij membraanhandel, zoals het veranderen van de genexpressie van het eiwit van belang of het labelen van het eiwit van belang met bepaalde tags. Hulpmiddelen in de chemische biologie omvatten het gebruik van moleculen die specifiek interfereren met het verkeer van bepaalde routes 4,5. Massaspectrometrie is krachtig voor het identificeren van de componenten in een organel dat mechanisch is geïsoleerd door biochemische benaderingen 3,4. Membraanverkeer is echter een dynamisch, divers en complex biologisch proces1. Om het membraantransportproces in levende cellen onder verschillende omstandigheden te visualiseren, is lichtmicroscopie een essentieel hulpmiddel. Er is voortdurend vooruitgang geboekt in geavanceerde microscooptechnieken om de uitdagingen bij het meten van de efficiëntie, kinetiek en diversiteit van de gebeurtenissen te overwinnen4. Hier richt deze studie zich op de algemeen aanvaarde methodologieën in de chemische / farmacologische biologie, moleculaire biologie en microscopie om membraanhandelgebeurtenissen te bestuderen in een natuurlijk vereenvoudigd en experimenteel toegankelijk systeem, het stomatale ontwikkelingsproces.
Huidmondjes zijn microporiën op de luchtoppervlakken van planten die open en dicht gaan om de gasuitwisseling tussen de binnenste cellen en de omgeving te vergemakkelijken 6,7,8. Daarom zijn huidmondjes essentieel voor fotosynthese en transpiratie, twee gebeurtenissen die cruciaal zijn voor de overleving en groei van planten. De ontwikkeling van het stomatale wordt dynamisch aangepast door omgevingssignalen om de aanpassing van de plant aan de omgeving te optimaliseren9. Daterend uit studies in 2002, opende de identificatie van het receptoreiwit Too Many Mouths (TMM) de deur naar een nieuw tijdperk van onderzoek naar de moleculaire mechanismen van stomatale ontwikkeling in de modelplant Arabidopsis thaliana10. Al na enkele decennia is een klassieke signaleringsroute geïdentificeerd. Van stroomopwaarts naar stroomafwaarts omvat deze route een groep secretoire peptideliganden in de epidermale patroonfactoren (EFP) familie, verschillende celoppervlak leucine-rich-repeat (LRR) receptorkinasen in de EREECTA (ER) familie, het LRR-receptoreiwit TMM, een MAPK-cascade en verschillende bHLH-transcriptiefactoren, waaronder SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA en SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Eerder werk geeft aan dat een van de receptorkinasen, ER-LIKE 1 (ERL1), actief subcellulair gedrag vertoont bij EPF-perceptie20. ERL2 verkeert ook dynamisch tussen het plasmamembraan en sommige intracellulaire organellen27. Het blokkeren van de membraanhandelstappen veroorzaakt abnormale stomatale patronen, resulterend in stomatale clusters op het bladoppervlak28. Deze resultaten suggereren dat membraanverkeer een essentiële rol speelt in de stomatale ontwikkeling. Deze studie beschrijft een protocol om spatiotemporaal de ERL1-dynamiek te onderzoeken met behulp van eiwit-eiwit subcellulaire co-lokalisatieanalyse in combinatie met farmacologische behandeling met behulp van enkele membraanhandelremmers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van de oplossingen
- Bereid zaadsterilisatieoplossing door 15 ml bleekmiddel te mengen met 35 ml gedestilleerd water en 50 μL Triton X-100.
- Bereid brefeldine A (BFA)-oplossing door het BFA-poeder op te lossen in ethanol tot een eindconcentratie van 10 mM (bouillon). Bereid wortmannine (Wm) oplossing door het Wm poeder op te lossen in DMSO tot een uiteindelijke concentratie van 10 mM (voorraad).
2. De zaden zaaien
- Aliquot 10-50 zaden van elk van de vereiste transgene planten in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Voeg 1 ml zaadsterilisatieoplossing toe aan elke buis en meng grondig door de buis gedurende 10 minuten voorzichtig om te keren op een shaker.
- Gooi de zaadsterilisatieoplossing weg en was de zaden vijf keer met 1 ml geautoclaveerd gedestilleerd water.
- Voeg 300 μL gedistilleerd water met autoclaaf toe aan elke buis en zaai de zaden op halfsterkte MS-media met 1% (w / v) sucrose en 0,75% (w / v) agar. Vul het medium indien nodig aan met de bijbehorende antibiotica.
- Houd de plaat 2 dagen ondersteboven bij 4 °C in het donker om de kieming te synchroniseren.
- Breng de plaat na 2 dagen over in een groeiruimte met een licht/8 uur donkere cyclus van 16 uur (80 μmol/m2/s1) bij 22 °C. Dit wordt beschouwd als de eerste dag na ontkieming (1 dpg).
- Verplant de zaailingen in de grond met 10 dpg voor verdere groei.
3. Bereiding van tweekleurige F1 transgene planten
- Kweek homozygote transgene planten met ERL1-YFP (plant A) en homozygote transgene planten met een RFP-gelabeld markereiwit RFP-Ara7 (plant B)20 naast elkaar tot de bloei in een groeiruimte met een licht/8 uur donkere cyclus van 16 uur (80 μmol/m2/s1) bij 22 °C.
- Kies een jonge bloeiwijze van plant A. Houd één bloem die op het punt staat open te gaan op de bloeiwijze voor genetische kruisingen. Verwijder alle oudere bloemen en siliques. Verwijder bovendien voorzichtig de jongere bloemen en bloemige meristeem om toekomstige verwarring te voorkomen.
- Ontleed de ongeopende bloem voorzichtig door de kelkbladen, bloemblaadjes en meeldraden te verwijderen met een scherp pincet. Laat de stamper alleen op de bloeiwijze staan.
- Neem een volwassen meeldraden van een geopende bloem op plant B en deponeer de stuifmeelkorrels op het stigma van de ontleedde stamper op plant A.
- Label deze handmatig gekruiste bloem door de vader, moeder en de datum van het genetische kruis aan te geven. Laat de bloem rijpen en oogst de F1-zaden wanneer de silique geel / bruin wordt (~ 20 dagen na de kruising). Controleer of er een succesvolle F1-installatie is met zowel YFP- als RFP-signalen.
4. Farmacologische behandeling
- Verwijder voor de BFA-behandeling de zaadlobben van 7 dagen oude zaailingen, dompel de rest van de zaailingen onder in een nepoplossing (0,3% ethanol) of 30 μM BFA-oplossing, breng 1 minuut vacuüm aan en houd het monster 30 minuten ondergedompeld voordat u beeldvorming maakt.
- Verwijder voor de wortmanninebehandeling de zaadlobben van 7 dagen oude zaailingen, dompel de rest van de zaailingen onder in 0,25% DMSO-oplossing of 25 mM wortmannine, breng 1 minuut vacuüm aan en houd het monster 30 minuten ondergedompeld voordat u beeldvorming maakt.
- Voeg voor de vacuümbehandeling van monsters in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 500 μL van de overeenkomstige geneesmiddeloplossing toe en dompel de ontlede zaailingen onder in de oplossing. Bevestig een spuit van 10 ml stevig aan de microcentrifugebuis en breng gedurende 1 minuut vacuüm aan (figuur 1). Verwijder de spuit en bewaar het monster gedurende de vereiste tijd in de oplossing. Haal de zaailingen voorzichtig uit voor beeldvormingsvoorbereiding.
Figuur 1: Eenvoudig vacuümapparaat. Een spuit van 10 ml is bevestigd aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml voor de vacuümbehandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Monstervoorbereiding voor beeldvorming
- Ontleed het ware blad van het behandelde monster met een scherp scheermesje. Doe het echte blad voorzichtig in een druppel water op een glazen dia en houd de abaxiale kant omhoog. Bedek het echte blad langzaam met een dekslip en vermijd het vangen van bubbels.
6. Confocale beeldvorming
OPMERKING: Een Leica SP8 omgekeerde scanning confocale microscoop werd gebruikt om het fluorescentiesignaal van de monsters in dit werk in beeld te brengen.
- Beam path instellen
- Selecteer een 514 nm laser voor YFP excitatie. Gebruik een hoog laservermogen om de signaalintensiteit te verhogen en zo een hoge beeldkwaliteit te verkrijgen. Laservermogens van meer dan 5% lopen echter het risico op fotobleken en de gezondheid van het monster kan worden beïnvloed. Als het monstersignaal niet te zwak is, begin dan met een lage laserintensiteit.
- Schakel PMT/HyD in voor detectie en definieer de bovenste en onderste emissiebanddrempels op basis van het spectrum voor de YFP-fluorofoor. Stel een detectievenster van 530-570 nm in om het YFP-signaal te verzamelen.
- Sequentiële beeldvorming voor de tweede kleur: Klik op de Seq-knop en voeg een nieuw kanaal toe. Standaard is het eerder ontworpen YFP-straalpad Seq 1. Selecteer in Seq 2 een 561 nm-laser voor de RFP-excitatie en stel een detectievenster in van 570-630 nm om het RFP-signaal te verzamelen.
- Scancondities instellen (afbeelding 2)
- Om de subcellulaire membraanverkeersactiviteit in stomatale voorlopercellen in beeld te brengen, kiest u een Corr-lens van 63x/1,2 W op het systeem voor beeldvorming.
- De indeling verwijst naar de afbeeldingsgrootte in pixels. Begin met 1.024 pixels x 1.024 pixels en optimaliseer dit vervolgens op basis van de zoomfactor en de objectieve instellingen voor een goede resolutie van de publicatiekwaliteit.
- De snelheid verwijst naar de snelheid van de scankop als de laser over elke pixel gaat. Hoewel lage scansnelheden vaak resulteren in een betere signaal-ruisverhouding, kunnen ze de snel veranderende membraantransportgebeurtenissen mogelijk niet efficiënt vastleggen. Begin met een snelheid van 400 Hz en optimaliseer dit op basis van de specifieke situatie van de samples.
- De zoomfactor wordt gebruikt om in te zoomen op een interessant gebied zonder de objectieflens te veranderen. Begin met een zoomfactor van 1 en optimaliseer deze op basis van de specifieke behoeften van het experiment.
- Het lijngemiddelde verwijst naar het aantal keren dat elke X-lijn wordt gescand om een gemiddeld resultaat te verkrijgen. Een groter lijngemiddelde vermindert de ruis in het resulterende beeld, maar het verhoogt ook de scantijd en de belichtingstijd voor het laserlicht. Gebruik geen hoog lijngemiddelde om membraanhandelgebeurtenissen in beeld te brengen. Begin met een 2x lijngemiddelde en optimaliseer indien nodig.
- Een tijdreeks verzamelen
OPMERKING: Bij het bestuderen van membraanhandelgebeurtenissen is vaak een tijdreeks nodig om de snelle beweging van de subcellulaire endosomen vast te leggen.- Selecteer in de acquisitiemodus de xyt-scanmodus om het hulpprogramma tijdreeksen in te schakelen.
- Bepaal een wachttijd tussen de tijdstippen onder Tijdsinterval. U kunt ook op Minimaliseren klikken om de afbeeldingen onmiddellijk achter elkaar te maken. Een tijdsinterval van 7 s werd gebruikt in het volgende tijdreeksexperiment.
- Selecteer Duur en voer de totale tijd in voor het uitvoeren van het experiment. U kunt ook het aantal frames definiëren dat moet worden verzameld door Frames te selecteren (afbeelding 3).
- Als u de driedimensionale informatie over de membraanhandelgebeurtenis in de hele cel wilt verzamelen, gebruikt u de Z-stack-scanmodus. De maximale intensiteit projectie van de Z-stack beelden wordt vaak gebruikt voor de analyse.
- Selecteer de xyz-scanmodus in de acquisitiemodus en vervolgens wordt het hulpprogramma Z-Stack toegankelijk.
- Selecteer de optie Z-wide. Definieer onder de scanmodus de bovenste afbeelding en de onderste afbeelding van de Z-stack met de knoppen Begin en Einde .
- Definieer de dikte van de z-stap door op z-stapgrootte te klikken. U kunt ook definiëren hoeveel foto's u wilt maken om het hele bereik van de Z-stack te bestrijken. Om de consistentie tussen de monsters te garanderen, definieert u de grootte van de z-stap (figuur 4).
- Beeldverwerking
- De maximale intensiteitsprojectie van de z-stack beelden wordt gegenereerd door de confocale software (http://www.leica-microsystems.com). Kies op het primaire tabblad Proces eerst het geïnteresseerde z-stack-bestand onder het tabblad Projecten openen helemaal links. Schakel vervolgens over naar het middelste tabblad met de naam Proceshulpmiddelen, selecteer de projectiefunctie, kies Maximum in het vervolgkeuzevenster van Methode en klik op de knop Toepassen. Een z-stack projectiebeeld wordt gegenereerd onder het tabblad Open projecten.
- De video van de tijdreeksbeelden is gegenereerd door Fiji (https://imagej.net/Fiji). Gebruik op het tabblad Bestand de functie Openen om alle tijdreeksafbeeldingen in de juiste volgorde te openen. Zoek op het tabblad Afbeelding de functie Stapelen en kies Afbeeldingen om te stapelen om een video te genereren. Sla het bestand op in de .avi-indeling met de gewenste framesnelheid (5 frames /s voor Video 1).
Afbeelding 2: Het scanmoduspaneel van de XY-dimensie. Het deelvenster scanmodus wordt gebruikt om de voorwaarden voor het scannen van afbeeldingen in te stellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het hulpprogramma tijdreeksen onder de xyt-scanmodus. Het hulpprogramma tijdreeksen wordt gebruikt om de beeldvormingsvoorwaarden in te stellen om achtereenvolgens een reeks afbeeldingen te verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het hulpprogramma z-stack onder de xyz-scanmodus. Het hulpprogramma z-stack wordt gebruikt om de beeldcondities in te stellen om een reeks afbeeldingen op de z-as te verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een eerdere studie gaf aan dat ERL1 een actief receptorkinase is dat dynamische membraanhandelgebeurtenissen ondergaat20. ERL1 is een transmembraan LRR-receptorkinase op het plasmamembraan. Nieuw gesynthetiseerd ERL1 in het endoplasmatisch reticulum wordt verwerkt in de Golgi-lichamen en verder getransporteerd naar het plasmamembraan. De ERL1-moleculen op het plasmamembraan kunnen EPF-liganden waarnemen met behulp van hun extracellulaire LRR-domein18. Na activering door de remmende EPF's, waaronder EPF1, wordt ERL1 geïnternaliseerd in endosomen, getransporteerd naar de multi-vesiculaire lichamen (MVB) en vervolgens getransporteerd naar de vacuolen voor degradatie om het signaal20 te beëindigen. Daarentegen behoudt het antagonistische EPFL9-ligand, dat stomatale vorming14 bevordert, ERL1 in het endoplasmatisch reticulum. Als alternatief kan het plasmamembraan-gelokaliseerde ERL1 recyclen tussen endosomen en het plasmamembraan20.
Hier werden transgene planten met ERL1-promotor: :ERL1-YFP gedurende 7 dagen gekweekt volgens het bovengenoemde protocol. Toen het net tevoorschijn kwam, werd het ware blad ontleed voor beeldvorming, omdat ERL1 alleen tot expressie komt in stomatale afstammingscellen in jonge bladeren20. Zoals verwacht werden verspreide cellen gemarkeerd door het YFP-signaal, waarbij ERL1-YFP het plasmamembraan labelde (figuur 5). Bovendien werden ook meerdere punctate-signalen waargenomen, wat suggereert dat ERL1 ook gelokaliseerd was in de endosomen.
Verschillende organellen in plantencellen zijn aanwezig als punctate fluorescerende signalen wanneer ze worden waargenomen onder een lichtmicroscoop, zoals het trans-Golgi-netwerk en de MVB's. Toen de MVB-markerlijn met RFP-Ara7 genetisch werd gekruist met de ERL1-YFP-transgene lijn, werden beide markereiwitten waargenomen met behulp van de sequentiële beeldvormingsbenadering zoals hierboven beschreven. Zoals te zien is in figuur 6, heeft RFP-Ara7 meerdere punctate-signalen in bijna alle cellen gemarkeerd, wat de MVB's in deze cellen aangeeft (figuur 6B). Bij het samenvoegen met het ERL1-YFP-signaal overlapte het grootste deel van het ERL1-YFP-positieve punctaat met het RFP-Ara7-gelabelde punctate. Dit resultaat suggereert dat sommige van de ERL1-YFP-moleculen naar de MVB's worden getransporteerd.
Om de dynamiek van deze snel bewegende endosomen te volgen, werden tijdreeksbeelden verzameld van de 7 dagen oude echte bladeren met ERL1-YFP en RFP-Ara7 (figuur 7). Tijdsintervallen van 7 s werden toegepast voor 203 s en de verzamelde 30 afbeeldingen werden gebruikt om een video te genereren in afbeelding J (video 1). De video toonde aan dat ERL1-YFP-gelabelde endosomen samen met RFP-Ara7 binnen de stomatale afstammingscellen bewogen, wat bevestigde dat ERL1-YFP gelokaliseerd was in de MVB's.
Om de ERL1-smokkelroutes te onderzoeken met behulp van een farmacologische benadering, werd het effect van twee veelgebruikte membraanhandelgeneesmiddelen, brefeldin A (BFA) en wortmannine (Wm), geanalyseerd. BFA kan, door het remmen van de ADP-ribosyleringsfactor guanine-nucleotide uitwisselingsfactoren, waaronder GNOM, de endosomale recycling en endocytose van membraaneiwitten blokkeren29. Na 30 minuten blootstelling aan de BFA-oplossing werd ERL1-YFP gedetecteerd in enkele grote compartimenten die bekend staan als BFA-lichamen (figuur 8B, C). Dit geeft aan dat ERL1-handel kan worden geblokkeerd door BFA, wat suggereert dat ERL1 recycling of endocytose ondergaat. Wm kan fosfatidylinositol-3 en fosfatidylinositol-4-kinasen remmen en veroorzaakt zo de fusie van MVB's5. Bij behandeling met Wm gedurende 30 minuten werden enkele ringachtige structuren waargenomen die door ERL1-YFP werden gemarkeerd, die meestal Wm-lichamen worden genoemd (figuur 8C). Dit resultaat geeft aan dat ERL1-YFP naar MVB's wordt getransporteerd, wat suggereert dat ERL1 de route volgt naar vacuolen voor degradatie.
Figuur 5: Enkelvlaksbeeld van ERL1-YFP. (A) Het fluorescentiebeeld, (B) het helderveldbeeld en (C) het samengevoegde beeld laten zien dat ERL1-YFP het plasmamembraan en enkele zeer mobiele punctate in stomatale afstammingscellen labelt. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Sequentiële beelden van ERL1-YFP en RFP-Ara7. (A) ERL1-YFP en (B) RFP-Ara7 labelen beide punctatesignalen in de cel. De witte punctate in (C) het samengevoegde beeld en (D) het inzetbeeld geeft aan dat de twee eiwitten co-lokaliseren op de MVB's binnen stomatale afstammingscellen. De witte pijlen geven endosomen aan die zijn gelabeld door zowel ERL1-YFP als RFP-Ara7. De rode pijlen geven endosomen aan die zijn gelabeld door RFP-Ara7. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Tijdreeksbeelden van ERL1-YFP en RFP-Ara7. De beelden zijn gemaakt met een tijdsinterval van 7 s. Het tijdstip van elke afbeelding wordt aangegeven in de linkerbovenhoek. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Z-stack beelden van ERL1-YFP. (A, B) Z-stack beelden van de ERL1-YFP planten behandeld met (A) mock of (B) BFA. De getallen in de rechterbovenhoek geven de positie van de afbeelding in de z-stack van boven naar beneden aan. Schaalbalk: 10 μm. (C) Projectie van de z-stackbeelden van ERL1-YFP behandeld met mock- of BFA-oplossing en mock- of Wm-oplossing, zoals aangegeven in de rechterbovenhoek. De pijlen geven de aggregatielichamen van ERL1-YFP aan die door de medicijnen worden veroorzaakt. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Video van de tijdreeksbeelden van ERL1-YFP en RFP-Ara7. De tijdreeksbeelden van ERL1-YFP en RFP-Ara7 worden gestapeld in een video met Fiji met een snelheid van 5 frames / s. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het endomembrane systeem scheidt het cytoplasma van een eukaryote cel in verschillende compartimenten, wat de gespecialiseerde biologische functie van deze organellen mogelijk maakt. Om ladingeiwitten en macromoleculen op het juiste moment op hun eindbestemming af te leveren, worden tal van blaasjes geleid om tussen deze organellen te pendelen. Sterk gereguleerde membraanhandelgebeurtenissen spelen een fundamentele rol in de levensvatbaarheid, ontwikkeling en groei van cellen. Het mechanisme dat dit cruciale en gecompliceerde proces reguleert, is nog steeds slecht begrepen.
Verschillende benaderingen zijn hier beschreven voor het observeren van de subcellulaire lokalisatie van membraaneiwitten, het analyseren van de co-lokalisatie tussen twee membraaneiwitten gelabeld met verschillende fluorescerende eiwitten, het monitoren van de dynamische beweging van een membraaneiwit met behulp van tijdreeksafbeeldingen en het verzamelen van 3D-informatie over een membraaneiwit door het uitvoeren van z-stack beeldvorming die de hele cel bedekt. Naast de membraanhandel die hier wordt beschreven, kunnen deze benaderingen gemakkelijk worden toegepast op andere biologische processen. De tijdreeksbeeldvorming kan bijvoorbeeld over een lange periode (meerdere dagen) worden uitgevoerd om een ontwikkelingsproceste volgen 30. De z-stack imaging kan worden uitgevoerd om de abundantie van een eiwit in een cel te kwantificeren30. Bovendien kunnen deze beeldvormingsbenaderingen perfect worden gecombineerd met farmacologische toepassingen, waaronder verschillende geneesmiddelen, hormonen en zelfs omgevingssignalen, wat aangeeft dat deze beeldvormingsbenaderingen gemakkelijk toepasbaar zijn op levende biologische monsters. Naast de flexibiliteit in de monsterbehandeling, vereisen de hier beschreven methoden alleen economisch betaalbare apparaten, behalve de confocale microscoop, en alleen lichte training van het personeel in de technische vaardigheden, wat betekent dat deze methoden op grote schaal kunnen worden toegepast.
Voorzichtigheid is geboden bij verschillende kritieke stappen van het protocol. Ten eerste variëren de optimale concentraties van de membraanhandeldrugs afhankelijk van het materiaal en de behandeling. Een eerdere studie suggereert dat 30 μM BFA een lage concentratie is die karakteristieke BFA-lichaamsvorming kan veroorzaken zonder de ineenstorting van het Golgi-apparaat in meristoïdente veroorzaken 20. Evenzo is 25 μM Wm een lage maar effectieve concentratie die Wm-lichaamsvorming kan verlenen zonder de meristeloïden ernstig te beschadigen. Wanneer een nieuw materiaal (verschillende plantensoorten, verschillende delen van de plant, enz.) wordt behandeld, moeten de concentraties van de geneesmiddelen dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. Ten tweede, om de fysiologische toestand van de monsters maximaal te behouden tijdens de behandeling, worden de zaailingen gedeeltelijk intact gehouden (alleen de zaadlobben verwijderen) tot de beeldvormingsstap. Echte bladeren worden ontleed voor de voorbereiding van de dia en het monster wordt daarna afgebeeld. Elk monster moet afzonderlijk worden behandeld en de dia moet vers worden gemaakt voor beeldvorming. Ten slotte vereisen zowel z-stack imaging als time-series imaging herhaalde laserscanning van het monster. Om het risico op fotobleaching en fototoxiciteit op de monsters te minimaliseren, wordt een laag laservermogen sterk aanbevolen.
De hoge efficiëntie van membraanhandelgebeurtenissen wordt gewaarborgd door de diversiteit van de smokkelroutes en hun kinetiek als reactie op de specifieke ontwikkelings- en omgevingsomstandigheden van de cel1. De beschreven methoden hebben een beperkte spatiotemporele resolutie, dus meer geavanceerde lichtmicroscopietechnieken zijn in opkomst om gedetailleerde kennis te krijgen van membraanverkeer binnen een eukaryote cel. Superresolutiemicroscopie, inclusief stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM) en fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM), verhogen bijvoorbeeld de ruimtelijke resolutie van een fluorescentie-gelabeld eiwit31,32 aanzienlijk, hoewel alleen vaste monsters kunnen worden geanalyseerd; spinning-disk microscopie versnelt de scansnelheid aanzienlijk en vermindert het fotobleachen van de monsters33, hoewel het een uitdaging is om de dynamiek van eiwitten met een lage abundantie met deze methode vast te leggen; light-sheet microscopie biedt snelle en zachte 3D-beeldvorming34,35; en twee-fotonenmicroscopie maakt de detectie van fluorescentiesignalen van diepere weefselsmogelijk 35,36, hoewel ten koste van een iets lagere resolutie, enz. Bovendien heeft de chemische biologie meer specifieke drugs geïdentificeerd die bepaalde smokkelroutes verstoren. Ondanks de beperkingen zullen deze technieken samen met andere opkomende geavanceerde technieken onze kennis aanzienlijk verbeteren en licht werpen op de mechanismen van het celmembraansmokkelsysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) en de University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
References
- Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
- Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
- Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
- Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
- Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
- Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
- Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
- Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
- Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
- MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
- Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
- Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
- Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
- Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
- Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
- Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
- Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R.
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
- Nwaneshiudu, A., et al.
- Sanderson, J.
