Summary
Explorar la mitofagia a través de microscopía electrónica, sensores genéticos e inmunofluorescencia requiere equipos costosos, personal calificado y una inversión de tiempo significativa. Aquí, demostramos la eficacia de un kit de colorante de fluorescencia comercial para cuantificar el proceso de mitofagia tanto en Caenorhabditis elegans como en una línea celular de cáncer de hígado.
Abstract
Las mitocondrias son esenciales para diversas funciones biológicas, incluida la producción de energía, el metabolismo de los lípidos, la homeostasis del calcio, la biosíntesis del hemo, la muerte celular regulada y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS son vitales para los procesos biológicos clave. Sin embargo, cuando no se controlan, pueden provocar lesiones oxidativas, incluido el daño mitocondrial. Las mitocondrias dañadas liberan más ROS, intensificando así la lesión celular y el estado de la enfermedad. Un proceso homeostático llamado autofagia mitocondrial (mitofagia) elimina selectivamente las mitocondrias dañadas, que luego son reemplazadas por otras nuevas. Existen múltiples vías de mitofagia, siendo el punto final común la descomposición de las mitocondrias dañadas en los lisosomas.
Varias metodologías, incluidos los sensores genéticos, la inmunofluorescencia de anticuerpos y la microscopía electrónica, utilizan este criterio de valoración para cuantificar la mitofagia. Cada método para examinar la mitofagia tiene sus ventajas, como la orientación específica de tejidos/células (con sensores genéticos) y gran detalle (con microscopía electrónica). Sin embargo, estos métodos a menudo requieren recursos costosos, personal capacitado y un largo tiempo de preparación antes del experimento real, como para crear animales transgénicos. Aquí, presentamos una alternativa rentable para medir la mitofagia utilizando tintes fluorescentes disponibles comercialmente dirigidos a mitocondrias y lisosomas. Este método mide eficazmente la mitofagia en el nematodo Caenorhabditis elegans y las células hepáticas humanas , lo que indica su eficiencia potencial en otros sistemas modelo.
Introduction
Las mitocondrias son esenciales para todos los animales aeróbicos, incluidos los humanos. Convierten la energía química de las biomoléculas en trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa1, sintetizan hemo2, degradan los ácidos grasos a través de la oxidación β3, regulan la homeostasis del calcio4 y el hierro5, controlan la muerte celular por apoptosis6 y generan especies reactivas de oxígeno (ROS), que desempeñan un papel vital en la homeostasis redox7. Dos procesos complementarios y opuestos mantienen la integridad y la función propia de las mitocondrias: la síntesis de nuevos componentes mitocondriales (biogénesis) y la eliminación selectiva de los dañados a través de la autofagia mitocondrial (es decir, mitofagia)8.
Varias vías de mitofagia están mediadas por enzimas, como PINK1/Parkin, y receptores, incluyendo FUNDC1, FKBP8 y BNIP/NIX 9,10. En particular, la degradación selectiva de los componentes mitocondriales puede ocurrir independientemente de la maquinaria del autofagosoma (es decir, a través de vesículas derivadas de mitocondrias)11. Sin embargo, los criterios de valoración de las diferentes vías de mitofagia selectiva son similares (es decir, degradación mitocondrial por enzimas lisosomales)12,13. Por esta razón, varios métodos para identificar y medir la mitofagia se basan en la colocalización de marcadores mitocondriales y lisosomales 14,15,16,17 y la disminución de los niveles de proteínas mitocondriales/ADN mitocondrial 18.
A continuación se muestra una descripción concisa de las metodologías experimentales existentes para medir la mitofagia en células animales utilizando microscopía de fluorescencia, enfatizando la fase de punto final de mitofagia.
Biosensores de mitofagia
La degradación mitocondrial ocurre dentro del ambiente ácido del lisosoma19. Por lo tanto, los componentes mitocondriales, incluidas las proteínas, experimentan un cambio de un pH neutro a un pH ácido en el punto final del proceso de mitofagia. Este patrón sustenta el mecanismo de acción de varios biosensores de mitofagia, incluyendo mito-Rosella18 y tándem mCherry-GFP-FIS114. Estos sensores contienen una proteína de fluorescencia verde sensible al pH (GFP) y una proteína de fluorescencia roja (RFP) insensible al pH. Por lo tanto, en el punto final de la mitofagia, la relación de fluorescencia verde-rojo disminuye significativamente debido al enfriamiento del fluoróforo GFP. Las principales limitaciones de estos sensores son (1) posible transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre los fluoróforos; (2) la tasa de maduración diferencial de GFP y RFP; (3) disociación entre la GFP y la RFP debido a la escisión proteolítica del polipéptido que las conecta; (4) superposición de emisiones fluorescentes; y (5) brillo y enfriamiento diferencial del fluoróforo15,16.
Un sensor que supera algunas de estas limitaciones es el sensor mitocondrial Keima17. El sensor mt-Keima (derivado de la proteína de coral Keima) muestra un pico de emisión único (620 nm). Sin embargo, sus picos de excitación son sensibles al pH. Como resultado, hay una transición de una excitación verde (440 nm) a una roja (586 nm) cuando se cambia de un pH alto a un pH ácido16,17. Un sensor de mitofagia más reciente, Mito-SRAI, ha avanzado el campo al permitir mediciones en muestras biológicas fijas20. Sin embargo, a pesar de las muchas ventajas de los sensores genéticos, como la capacidad de expresarlos en tejidos / células específicos y dirigirlos a distintos compartimentos mitocondriales, también tienen limitaciones. Una limitación es que los sensores genéticos deben expresarse en células o animales, lo que puede llevar mucho tiempo y consumir muchos recursos.
Además, la expresión de los sensores dentro de las propias mitocondrias puede influir en la función mitocondrial. Por ejemplo, la expresión de GFP mitocondrial (mtGFP) en los músculos de la pared corporal del gusano C. elegans expande la red mitocondrial21. Este fenotipo depende de la función del factor de transcripción activado por estrés ATFS-1, que desempeña un papel esencial en la activación de la respuesta proteica desplegada en mitocondrias (UPRmt)21. Por lo tanto, aunque los biosensores de mitocondria/mitofagia codificados genéticamente son extremadamente útiles para monitorear la homeostasis de las mitocondrias in vivo, pueden afectar el proceso para el que están diseñados.
Anticuerpos y colorantes específicos de mitocondrias/lisosomas
Otra estrategia para probar la colocalización mitocondrial/lisosomas es usar anticuerpos contra proteínas mitocondriales/lisosomales, como la proteína mitocondrial de la membrana externa TOM20 y la proteína de membrana asociada a lisosomas 1 (LAMP1)22. En la mayoría de los casos, los anticuerpos secundarios que se conjugan a un fluoróforo se utilizan para detectar la señal de fluorescencia a través de microscopía. Otra estrategia es combinar construcciones genéticas con colorantes mitocondriales/lisosomales, como expresar una construcción de fusión LAMP1::GFP en células mientras se tiñen con un colorante mitocondrial rojo (por ejemplo, Mitotracker Red)16. Estas metodologías, aunque efectivas, requieren anticuerpos específicos y a menudo implican trabajar con especímenes fijos o generar células / animales transgénicos que expresan mitocondrias / lisosomas marcados con fluorescencia.
Aquí, describimos la utilización de un kit comercial de tinción lisosoma/mitocondria/nuclear para evaluar las propiedades activadoras de la mitofagia de la diamina sintética O,O (octano-1,8-diil)bis(hidroxilamina), en lo sucesivo denominada VL-85023, en gusanos C. elegans y la línea celular de cáncer humano Hep-3B (Figura 1). El kit de tinción contiene una mezcla de colorantes lisosomales/mitocondriales/nucleares que tiñen específicamente estos orgánulos23. Anteriormente utilizamos este kit para demostrar la actividad mitofagia del 1,8 diaminooctano (en adelante, VL-004) en C. elegans23. Es importante destacar que validamos los resultados del kit de tinción con el biosensor mito-Rosella y las mediciones por qPCR del contenido de ADN mitocondrial:nuclear23. Este kit de tinción ofrece las siguientes ventajas. En primer lugar, no hay necesidad de generar animales transgénicos o células que expresen un biosensor mitocondrial. Por lo tanto, podemos estudiar animales o células de tipo salvaje no modificados y, por lo tanto, ahorrar mucho tiempo, dinero y trabajo. Además, como se mencionó, la expresión de biosensores mitocondriales puede cambiar la función mitocondrial. En segundo lugar, el kit es rentable, fácil de usar y rápido. En tercer lugar, aunque demostramos el método en C. elegans y células humanas, podría modificarse para otros tipos de células y organismos.
Dicho esto, como cualquier método, el protocolo del kit de tinción tiene inconvenientes. Por ejemplo, la incubación de los gusanos con el reactivo se lleva a cabo en ausencia de alimentos (hemos visto que incluso las bacterias muertas disminuyen significativamente la eficiencia de tinción). Aunque el tiempo de incubación es relativamente corto, es posible que incluso en este período de tiempo, las respuestas homeostáticas puedan verse alteradas, incluida la mitofagia. Además, la unión de los colorantes a las proteínas ER/mitocondriales/nucleares y otras biomoléculas puede afectar las actividades de estos orgánulos. Además, a diferencia de la medición de mitofagia con sensores genéticos, trabajamos con gusanos y células que han sufrido fijación química. Por lo tanto, es imposible continuar monitoreando los mismos gusanos / células en diferentes momentos. Por lo tanto, recomendamos combinar diferentes metodologías para validar la función de la mitofagia en un proceso fisiológico particular. A continuación, presentamos nuevos datos que demuestran que VL-850 induce mitofagia robusta en gusanos C. elegans y células Hep-3B. Por lo tanto, estos datos apoyan aún más la hipótesis de que VL-850 extiende la vida útil de C. elegans y protege a C. elegans del daño oxidativo a través de la inducción de mitofagia sana . Hemos utilizado el ionóforo de protones cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP), que es un potente inductor de mitofagia24, como control positivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Para la comodidad de los lectores, hemos dividido el protocolo en dos partes: una se centra en el protocolo para medir la mitofagia en C. elegans, y la otra se centra en el protocolo para medir la mitofagia en las células hepáticas. La lista de materiales se puede encontrar en la Tabla de materiales proporcionada.
1. El protocolo de C. elegans
- Preparación de las placas del medio de crecimiento de nematodos (NGM) y la cepa bacteriana OP50 de Escherichia coli
NOTA: Como punto de aclaración, si bien seguimos los protocolos estándar para la preparación de las placas NGM y OP50 cepas bacterianas25,26, reconocemos que puede haber variaciones en estos protocolos entre diferentes laboratorios. Por lo tanto, hemos incluido los protocolos completos para garantizar la replicación precisa del experimento.- Hacer un tampón de fosfato de potasio de 1 M, pH 6, agregando ~150 ml de 1 M K 2 HPO 4a 500 ml de solución de 1 M KH2PO4 hasta alcanzar el pH 6. Esterilice el tampón pasándolo a través de un filtro de vacío/sistema de almacenamiento de 0,22 μm.
- Hacer 0,1 M de cloruro de calcio (CaCl 2) y sulfato de magnesio (MgSO4), y esterilizarlos con un filtro de jeringa de0,2 μm.
- Preparar 5 mg/ml de colesterol en etanol absoluto.
NOTA: Dado que el colesterol se prepara en etanol, no lo filtre. - Prepare NGM-agar disolviendo 1,5 g de cloruro de sodio (NaCl), 1,25 g de peptona y 8,5 g de agar en 500 ml de agua doble destilada (DDW). Autoclave y dejar enfriar a ~55 °C.
- En condiciones estériles, agregue 12.5 ml de tampón fosfato de potasio (pH 6), 0.5 ml de 0.1 M CaCl2, 0.5 ml de 0.1 M MgSO4 y 1 ml de colesterol 5 mg / ml. Mezclar bien después de cada adición.
- Agregue 4 ml de agar NGM fundido a cada placa de 35 mm. Deje que los platos se solidifiquen durante la noche a temperatura ambiente (RT, ~ 21 ° C).
- Para hacer placas de agar Luria-Bertani (LB), disuelva 5 g de NaCl, 5 g de triptona, 2.5 g de extracto de levadura y 7.5 g de agar en 400 ml de agua destilada desionizada (DDW), ajuste el pH de la solución a 7.0, eleve el volumen hasta 500 ml con DDW y autoclave. Una vez que la solución se haya enfriado a 55 °C, vierta 25 ml de la mezcla en cada placa de Petri de 90 mm y deje que las placas se sequen durante 2 días a temperatura ambiente. A continuación, extraiga las bacterias OP50 en las placas secas de LB de la cepa de glicerol e incube a 37 ° C durante la noche para obtener colonias individuales.
- Preparar 2x triptona de levadura (YT) disolviendo 8 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 2,5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 0,5 L de DDW. Ajuste el pH a 7 y autoclave.
- Al enfriar, inocular una colonia de bacterias OP50 de la placa LB recién rayada en 50 ml de medio 2x YT en un erlenmeyer de 250 ml. Agitar a 37 °C y 250 rpm hasta una densidad óptica (OD600) de aproximadamente 0,6.
- Preparación del vehículo y placas experimentales
- Agregue 100 μL de bacterias OP50 al centro de cada placa de agar NGM de 35 mm. Secar durante la noche a RT (temperatura ambiente, 21 °C).
- Preparar VL-850 0,5 M en DMSO y diluir a 10 mM VL-850 utilizando tampón M9 (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, pH 7 y1 mM MgSO 4)26. Confirme que el pH es 7.0 (si no, ajuste con HCl 0.1 M) y esterilice la solución con un filtro de jeringa de 0.22 μm. Prepare el vehículo como se describió anteriormente, pero sin el medicamento (en este caso, VL-850). Hacer 50 mM de FCCP en DMSO, diluir a 1 mM de FCCP con tampón M9 y filtrar y esterilizar la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
- Agregue 25 μL de vehículo (control negativo), FCCP (control positivo; 5 μM) o VL-850 (tratamiento experimental; 62.5 μM) a las placas NGM sembradas por separado en el césped bacteriano.
- Cubra las placas con papel de aluminio y déjelas secar a RT (temperatura ambiente, 21 °C). Use las placas después de ~16 h.
- Obtención sincronizada de adultos jóvenes C . elegans hermafroditas
- Haga 1 L de tampón M9 con 22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO4 y 86 mM NaCl. Esterilizar en autoclave, y dejar enfriar. Una vez enfriado, agregue 1 ml de 1 mM MgSO4 (0.22 μm esterilizado por filtro).
- Mezclar 0,8 ml de hidróxido de sodio de 2,5 N y 1 ml de una solución al 5% de hipoclorito de sodio con 2,2 ml de DDW para crear una solución de hipoclorito alcalino de 4 ml (concentración final de 0,5 N para hidróxido de sodio y 1,25% para hipoclorito de sodio).
- Recoja los gusanos (hermafroditas grávidos) en un tubo cónico de 15 ml lavando las placas NGM con 1 ml de tampón M9 3x para asegurarse de que todas las madres hayan sido recogidas en el tubo.
- Sedimentar los gusanos por centrifugación a 500 × g durante 1 min, y desechar el sobrenadante hasta que quede un volumen de 1 ml.
- Agregue 1 ml de solución alcalina de hipoclorito y mezcle invirtiendo el tubo 5x. Mueva suavemente el tubo durante 3 minutos para ayudar a la liberación de huevos y observe el estado de los gusanos bajo un estereoscopio de disección.
- Cuando aproximadamente el 50% de los gusanos estén rotos, agregue 5 ml de tampón M9 e inmediatamente sedimente los huevos centrifugando durante 1 minuto a 500 × g.
- Retire el sobrenadante con cuidado sin alterar el pellet. Agregue 5 ml de tampón M9 y repita el procedimiento de lavado 2x.
- Retire el sobrenadante hasta que queden 2 ml y gire el tubo (rotación de 360°) a 20 rpm durante ~16 h (RT, 21 °C) para obtener larvas L1 sincronizadas. Desde este tubo, tome una gota de 5 μL en un portaobjetos de vidrio, cuente el número de larvas bajo un estereoscopio, repita este paso 3x, tome un promedio de los tres conteos y estime el número de gusanos por microlitro (μL). Con base en estos cálculos, agregue ~ 200 larvas por placa NGM sembrada con bacterias OP50.
- Cultivar las larvas L1 a 21 °C durante ~48 h hasta la etapa adulta joven.
- Tratamiento farmacológico y procedimiento de microscopía
- Coloque 100 gusanos en cada una de las placas experimentales o de control. Asegúrese de que las placas negativa, positiva y experimental contengan el vehículo, 5 μM FCCP y 62,5 μM VL-850, respectivamente. Incubar a 21 °C durante 6 h.
- Use 1 ml de tampón M9 para lavar los gusanos de cada placa en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Gire el tubo brevemente (~3 s) en una minicentrífuga. A continuación, deseche el sobrenadante pipeteando suavemente el amortiguador M9 sin perturbar la bolita del gusano. Repita este paso de lavado 2 veces y luego retire suavemente el sobrenadante sin alterar el pellet de gusano.
- Agregue 200 μL de tampón M9, que contiene 0,1% v/v Poloxámero 188, 0,1% v/v Pluronic F127 y 2 μL del reactivo del kit de tinción, al pellet de lombriz. Deje girar la mezcla a 20 rpm (rotación de 360°) durante 1 h a RT (temperatura ambiente, 21 °C). Para proteger los tintes de la luz, cubra los tubos con papel de aluminio.
- Girar los gusanos suavemente, como se describe en el paso 1.3.4. Luego, retire la solución de tinción sin alterar el pellet de gusano. A continuación, lave los gusanos como se describe en el paso 1.3.2 y transfiéralos a una placa de agar NGM sembrada que contenga el tratamiento adecuado; por ejemplo, los gusanos tratados con FCCP se transfieren a una placa que contiene FCCP. Cubra las placas con papel de aluminio porque el reactivo de tinción es sensible a la luz.
NOTA: Transferimos los gusanos a placas de cultivo que contienen bacterias y el agente de tratamiento correspondiente para minimizar el ruido de fondo debido al exceso de colorante. Por ejemplo, los gusanos tratados con FCCP se transfirieron a placas suplementadas con FCCP, y así sucesivamente. - Lave los gusanos de las placas en tubos de microcentrífuga nuevos utilizando 1 ml de tampón M9; Lave los gusanos de la misma manera 2x. A continuación, fije los gusanos con formaldehído al 1% en hielo durante 30 minutos y lave los gusanos con 1 ml de tampón M9 3x para eliminar el formaldehído residual. Después de los lavados, girar los gusanos hasta convertirlos en una bolita y aspirar la cantidad máxima de sobrenadante, manteniendo el pellet de gusano intacto en 10 μL de M9.
- Para preparar agarosa al 2,5%, pese 0,125 g de agarosa en un tubo de ensayo de vidrio borosilicato de 10 ml, agregue 5 ml de tampón M9 y disuelva la agarosa calentando suavemente el tubo con un quemador Bunsen. Transfiera la agarosa derretida a un baño seco a 75 °C y, con una punta de 1 ml, coloque 100 μL de agarosa fundida en un vidrio de cubierta de microscopio Deckgläser (24 mm x 60 mm). Inmediatamente, coloque otro tobogán perpendicularmente sobre la gota de agarosa, formando una forma de cruz. Espere ~ 2 minutos y separe suavemente las diapositivas empujando (suavemente) el vidrio de la cubierta superior, dejando así la almohadilla de agarosa en la diapositiva de la cubierta inferior.
NOTA: Tenga cuidado al calentar la agarosa en el tubo y asegúrese de que el tubo se mantenga alejado del cuerpo. Corte el borde de la punta de 1 ml para minimizar la coagulación de la agarosa. - Transfiera los gusanos a la almohadilla de agarosa con una pipeta de vidrio Pasteur (es decir, la cantidad total en el tubo, ~ 10 μL). Retire el exceso de líquido con una mecha hecha de una toallita de laboratorio y luego cubra los gusanos con un portaobjetos de cubierta más pequeño (24 mm x 40 mm). Aplique esmalte de uñas transparente en la periferia del portaobjetos más pequeño para evitar la evaporación. Coloque la corredera en una caja oscura para protegerla de la luz.
- Use un microscopio confocal para obtener imágenes de los gusanos dentro de las 24 h en las longitudes de onda apropiadas (ver más abajo) usando una lente de aumento de 60x.
- Coloque el portaobjetos sobre la platina del microscopio.
- Abra el software de imágenes y haga clic con el botón derecho en el área gris del software. Adquisición abierta | Ti2 Full Pad | Adquisición de ND | LUTs haciendo clic en las opciones de la ventana emergente que surge como resultado del clic derecho.
- En Ti2 Full Pad, seleccione 60x.
- En Adquisición, seleccione Ocular DIA y enfoque los gusanos con la perilla de enfoque fino del microscopio. En Adquisición, seleccione Disco giratorio y elija la opción 16 bits - Sin agrupación. Para cada filtro de fluorescencia, ajuste el Tiempo de exposición a 500 ms y 20 ms para Brightfield. Una vez establecidos estos parámetros, seleccione Ejecutar ahora y espere a que la imagen de salida se genere como un archivo ND2.
NOTA: El tiempo de exposición debe determinarse experimentalmente, ya que las diferentes configuraciones de imágenes tienen diferentes características. Utilice tablas de búsqueda (LUT) para examinar la intensidad de fluorescencia para cada longitud de onda.
- Análisis de imágenes
- Abra las imágenes confocales (aquí, archivos ND2 de Nikon) en ImageJ27 con el complemento de colocalización. Cada archivo ND contiene planos de imagen tomados en tres longitudes de onda (usando filtros DAPI, GFP/FITC [verde] y Texas Red [rojo]) y luz visible. Para acceder a estas imágenes, abra el archivo ND en el servidor ImageJ y seleccione Dividir imágenes en el cuadro de diálogo. Trabaje con imágenes de campo claro (BF), canal verde y canal rojo.
- Genere duplicados de estas imágenes para mantener la imagen original intacta haciendo clic en Imagen | Duplicar o usar el método abreviado de teclado Mayús + D.
- Para reducir el fondo, genere otro duplicado de la imagen, como se mencionó anteriormente. Resta el fondo con un radio de rodadura de 100 y selecciona la opción Crear fondo (no restar) para generar una imagen con el fondo de la imagen dada. A continuación, vaya a Proceso | Calculadora de imágenes, y reste la primera imagen duplicada de la segunda imagen duplicada. Utilice las imágenes resultantes para el análisis de colocalización.
- Para utilizar el plugin de colocalización, convierta las imágenes del canal verde y del canal rojo a 8 bits. Para ello, haga clic en Imagen | Tipo | 8 bits.
- Haga clic en Plugins | Colocalización. Para medir la colocalización de las mitocondrias y las señales de lisosomas utilizando el complemento de colocalización (ver arriba), use los siguientes parámetros: Relación = 75%, Canal rojo umbral = 80.0, Canal verde umbral = 50.0. El resultado es una imagen binaria de 8 bits que contiene puntos colocalizados y una combinación de las tres imágenes de 8 bits (verde, rojo y la imagen colocalizada) en una imagen RGB.
- Concéntrese en el punto en el músculo de la pared del cuerpo de la cabeza de los gusanos seleccionando manualmente esta área y creando una máscara haciendo clic en Editar | Selección | Crear máscara, que selecciona la región de interés (Figura 2A, B). Elimine selectivamente otras entidades teñidas (por ejemplo, los músculos faríngeos) para analizar la región muscular de la pared corporal de la cabeza.
- Para seleccionar las partículas en la región de interés (ROI), seleccione las imágenes colocalizadas de 8 bits y enmascare utilizando la calculadora de imágenes. A continuación, utilice la operación Y (Figura 3A) para seleccionar los puntos en el ROI. Esto genera una imagen con puntcta en el ROI (Figura 3B).
- Para analizar el área de las mitocondrias y lisosomas colocalizados, seleccione Analizar | Analizar partículas, y medir la suma de los puntos entre 0,1625 μm 2 y 4 μm2.
2. El protocolo de células cancerosas Hep-3B
- Preparación de la solución madre de medicamentos.
- Prepare 100 mM VL-850 en DMSO. Diluirlo a 5 mM con tampón HEPES 0,5 M, pH 7,3, y esterilizar la solución utilizando un filtro de jeringa de 0,22 μm. Luego, prepare el vehículo como se describió anteriormente, pero sin el medicamento (en este caso, VL-850).
- Cultivo de células Hep-3B para el experimento, tratamiento farmacológico y procedimiento de microscopía
- Cultivar células Hep-3B en placas de cultivo de tejido de 10 cm que contengan el medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 2% de L-glutamina y 1% de tetraciclina (en adelante, DMEM completo). Incubar las células a 37 °C y 5% deCO2.
- Elija una placa de células Hep-3B que muestren una confluencia celular del 70% al 80% (fase de crecimiento logarítmico), retire el medio y lave la placa con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada. Retire el PBS e incube las células con 1 ml de tripsina al 0,25% precalentada/EDTA al 0,02% durante ~3 min a 37 °C; Observe las células bajo un microscopio de cultivo de tejidos (10x). Detenga la digestión de tripsina cuando las células se vuelvan redondas y comience a disociarse de la placa agregando 5 ml de DMEM completo. Centrifugar las células a 1.000 × g durante 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de DMEM completo.
- Determinar la concentración celular. Mezclar 50 μL de la suspensión celular con 50 μL de azul de tripano. Cuente las células usando un contador celular automatizado o usando un hemocitómetro 5x, y tome un promedio de estos recuentos para garantizar la precisión de los recuentos.
- Semilla 42,000 células Hep3G en cada μ portaobjetos de 8 pocillos en 400 μL de DMEM completo (como se describió anteriormente). Incubar las células durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2.
- Después de 24 h a ~80%-85% de confluencia, retire 250 μL de medio de cada uno de los pocillos y agregue 50 μL de medio con el tratamiento o vehículo apropiado. Para seguir este protocolo, trate las células con 100 μM VL-850, 5 μM FCCP y un vehículo como control.
- Después de la incubación de 6 h con los compuestos, añadir 50 μL de medio a cada pocillo que contenga el reactivo de tinción (0,5 μL de colorante por 250 μL en cada pocillo). Incubar las células con el colorante durante 30 min a 37 °C y 5% deCO2.
NOTA: Como el reactivo de tinción es sensible a la luz, minimice la exposición a la luz cubriendo las muestras con papel de aluminio y trabajando en un ambiente con poca luz (si es posible). - Con una pipeta de 200 μL, retire suavemente todo el medio (250 μL) de cada pocillo y, a continuación, lave las células con 200 μL de PBS precalentado.
- Fijar las células con 200 μL de solución fijadora que contiene 4% de formaldehído y 2,5% de glutaraldehído preparado en PBS durante 15 min a RT.
- Decantar la solución fijadora y lavar brevemente con 200 μL de PBS.
- Añadir 200 μL de PBS, mantener las células cubiertas y protegidas de la luz a 4 °C, y la imagen en un plazo de 24 h.
NOTA: Utilizamos el microscopio confocal de disco giratorio en cuatro canales, incluidos DIC, TRITC, FITC y DAPI, como en el paso 1.4.8. Tomamos imágenes de ~ 300 células por tratamiento.
- Análisis de imágenes
- Realice los pasos 1.5.1-1.5.5. Para obtener el ROI de las células, genere una imagen que resalte el área de las células. Para ello, elija una imagen de puntos colocalizados (RGB) (Figura 4A). Para seleccionar toda el área de celda, seleccione Proceso | Binario | Crear máscara para obtener una imagen binaria (Figura 4B). Para analizar el área de la celda, seleccione Analizar | Analizar partículas y medir todas las partículas de la imagen de 0 a infinito, que es la configuración predeterminada para Analizar partículas.
- Para analizar el área de las mitocondrias y lisosomas colocalizados, seleccione una imagen colocalizada de 8 bits, conviértala en binaria seleccionando seleccionar Proceso | Binario | Crear binario, seleccione Analizar | Analizar partículas, y medir la suma de puntos entre 0,1625 μm 2 y 4 μm2. Para medir el punto colocalizado, divida el área de las mitocondrias y lisosomas colocalizados por el área celular total.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inducción de una respuesta mitofagia robusta tanto en gusanos C. elegans como en células Hep-3B con VL-850
VL-850 protege a los gusanos C. elegans y queratinocitos humanos (células HaCaT) del estrés oxidativo23. Para explorar más a fondo su mecanismo de acción, examinamos si VL-850 induce mitofagia en C. elegans y otras células humanas. Para probar esto, expusimos gusanos C. elegans (adultos jóvenes, 3 días después de L1) a 62.5 μM VL-850, 5 μM FCCP (control positivo) y vehículo (control negativo) durante 6 h. Como se describió anteriormente, medimos la mitofagia utilizando el reactivo de tinción. Elegimos usar la concentración de 62.5 μM para VL-850 porque protege a los gusanos del estrés oxidativo y alarga significativamente su vida útil23. VL-850 indujo una mitofagia robusta en los músculos de la pared del cuerpo de la cabeza de los gusanos (Figura 5), lo que indica que es un potente inductor de mitofagia. Cabe destacar que la potencia mitofagia de VL850 fue similar a la de FCCP (Figura 5).
Además, realizamos un experimento similar con células Hep-3B; esta línea celular se originó en un varón negro de 8 años con carcinoma hepatocelular primario (CHC)28. Similar al experimento de C. elegans, expusimos las células a 100 μM VL-850, 5 μM FCCP (control positivo) y vehículo (control negativo) durante 6 h y utilizamos el reactivo de tinción para cuantificar la mitofagia. VL-850 y FCCP indujeron mitofagia significativa (en una medida similar) en las células Hep-3B (Figura 6), apoyando aún más nuestra hipótesis de que VL-850 es un potente inductor de mitofagia tanto en C. elegans como en células humanas.
Figura 1: Medición de mitofagia en células de C. elegans y Hep-3B. Dibujo esquemático que ilustra el uso del kit de tinción para medir la mitofagia tanto en gusanos C. elegans como en células de cáncer de hígado. Abreviaturas: VL-850 = O,O (octano-1,8-diil)bis(hidroxilamina); FCCP = cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona; PBS = solución salina tamponada con fosfato; NGM = medio de crecimiento de nematodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Selección de la región músculo-pared corporal de la cabeza de interés en C. elegans. (A) La región de interés se selecciona manualmente y se genera una máscara. (B) La imagen de máscara resultante muestra la región principal de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de los puntos colocalizados en una región de interés en C. elegans. (A) Para seleccionar los puntos en la región de interés, se debe seleccionar la operación "Y". (B) La imagen resultante muestra los puntos en la región de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Selección de celdas en una región de interés . (A) Se genera una imagen de puntos colocalizados (RGB) después de la función de colocalización. (B) Una imagen de máscara que representa toda el área celular en la que se van a estudiar los puntos débiles. Abreviatura: RGB = rojo, verde y azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Inducción de mitofagia robusta en C. elegans por VL-850. (A) Las puntas de flecha representan la colocalización de mitocondrias y lisosomas como un ejemplo de colocalización representativa. El recuadro, que tiene una ampliación de ocho veces, se proporciona para una mejor visualización. Barras de escala = 100 μm. (B) La colocalización se cuantificó con tres repeticiones biológicas y 30 gusanos por tratamiento. La significación de los resultados se determinó comparándolos con los controles del vehículo, y los asteriscos indican significación estadística. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando un ANOVA unidireccional no pareado (pruebas ANOVA de Brown-Forsythe y Welch con corrección de Welch), y un valor p de menos de 0,0001 (****p < 0,0001) se consideró estadísticamente significativo. Abreviatura: FCCP = cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: VL-850 induce mitofagia significativa en células Hep-3B . (A) Las puntas de flecha muestran la colocalización de mitocondrias y lisosomas para representar la colocalización, y se incluye un recuadro para demostrar la colocalización a ocho veces más amplia. Barras de escala = 25 μm. (B) La colocalización se cuantificó con tres repeticiones biológicas y N ≥ 411 células por tratamiento (411 cae dentro del rango que permite significación estadística y confianza en los resultados). Se evaluaron diferencias estadísticamente significativas en comparación con los controles del vehículo, y los asteriscos indican significación. Los datos se analizaron utilizando un ANOVA unidireccional no pareado (pruebas ANOVA de Brown-Forsythe y Welch con corrección de Welch), y un valor p de menos de 0,0001 (****p < 0,0001) se consideró estadísticamente significativo. Abreviatura: FCCP = cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Múltiples vías de mitofagia involucran varias proteínas y biomoléculas (por ejemplo, cardiolipina29). Sin embargo, el punto final de estas vías es similar: la degradación de las mitocondrias por enzimas lisosomales12,13. De hecho, varios métodos utilizan este criterio de valoración para cuantificar la mitofagia. Sin embargo, algunos métodos, como la microscopía electrónica, requieren acceso a equipos costosos, expertos capacitados y un tiempo de preparación prolongado para las muestras y el análisis. Además, a pesar de las ventajas del uso de biosensores de mitofagia, que incluyen la medición de la mitofagia en tejidos/células/compartimentos subcelulares específicos, la expresión de tales sensores puede cambiar la fisiología de la célula21. Por lo tanto, existe la necesidad de un método confiable, rentable y rápido para cuantificar la mitofagia sin la necesidad de interferencia a largo plazo con la fisiología celular normal.
Aquí, describimos dicho método, que implica el uso de una mezcla comercial asequible de cóctel de mitocondrias / lisosoma / tinte nuclear. Recientemente hemos demostrado su utilidad en la medición de mitofagia en C. elegans y queratinocitos humanos inmortalizados (células HaCaT)23. Los resultados del kit de tinción fueron validados con dos biosensores, incluyendo mito-Rosella (en C. elegans) y cox8-mCherry-EGFP (en células humanas de neuroblastoma SH-SY5Y), así como experimentos de qPCR que cuantificaron la relación entre el contenido de ADN mitocondrial y nuclear y la expresión de varios genes de mitofagia/autofagia23.
En este estudio, ampliamos nuestra investigación para explorar la potencia activadora de la mitofagia de VL-850 en gusanos C. elegans y células Hep-3B de adenocarcinoma hepático humano. Los resultados muestran que VL-850 es un potente inductor de mitofagia (Figura 5 y Figura 6). Estos resultados apoyan aún más las observaciones previas de que VL-850 protege a C. elegans del estrés oxidativo y extiende su vida útil, además de inducir mitofagia en las células HaCat23.
A pesar de la utilidad del kit de tinción, tiene algunas limitaciones con respecto a los estudios de C. elegans. En primer lugar, al menos en las condiciones estudiadas, no observamos tinción de dendritas y axones. Por lo tanto, el protocolo actual no es útil para medir la mitofagia en estas entidades neuronales. En segundo lugar, la autofluorescencia intestinal puede interferir con la señal de fluorescencia verde del tinte mitocondrial. Por lo tanto, se debe tener precaución al aplicar este método para mediciones de mitofagia en el intestino. Finalmente, y especialmente en el contexto de líneas celulares humanas/roedores, el colorante lisosómico puede teñir entidades ácidas dentro del núcleo. Por lo tanto, se recomienda valorar empíricamente la concentración del reactivo de tinción / tiempo de incubación para cada composición de línea celular / medio.
Además, como se sugirió anteriormente, ningún método único es suficiente para demostrar la mitofagia. Por lo tanto, recomendamos la validación de los resultados del reactivo de tinción utilizando métodos alternativos (por ejemplo, biosensores de mitofagia, qPCR, inmunotinción) e incluir siempre un control positivo de la mitofagia (por ejemplo, FCCP). En conclusión, el cóctel de colorante reactivo de tinción proporciona un método confiable y rentable para cuantificar la mitofagia en C. elegans y células humanas. Dada la diferencia significativa entre las células humanas y C. elegans , anticipamos que este método podría adaptarse fácilmente a otros sistemas animales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio Gross por la lectura crítica del manuscrito y sus comentarios y consejos. Agradecemos al Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los Institutos Nacionales de Salud (P40 OD010440), por proporcionar algunas de las cepas. Esta investigación fue apoyada por una subvención de Vitalunga Ltd y la Fundación de Ciencias de Israel (subvención No. 989/19). La figura gráfica abstracta (Figura 1) se generó con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
- Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
- Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
- Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
- Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
- Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
- Martinez-Vicente, M.
- Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
- Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Yim, W. W. -Y., Mizushima, N.
- Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
- Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
- Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
- Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
- Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1988).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
- Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).
