Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Påvisning av mitophagi i Caenorhabditis elegans og pattedyrceller ved bruk av organelle-spesifikke fargestoffer

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65337
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, Institute for Medical Research, Israel-Canada (IMRIC), The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Å utforske mitofagi gjennom elektronmikroskopi, genetiske sensorer og immunfluorescens krever kostbart utstyr, dyktig personell og en betydelig tidsinvestering. Her demonstrerer vi effekten av et kommersielt fluorescensfargesett ved kvantifisering av mitofagiprosessen i både Caenorhabditis elegans og en leverkreftcellelinje.

Abstract

Mitokondrier er essensielle for ulike biologiske funksjoner, inkludert energiproduksjon, lipidmetabolisme, kalsiumhomeostase, hemebiosyntese, regulert celledød og generering av reaktive oksygenarter (ROS). ROS er avgjørende for viktige biologiske prosesser. Men når de ikke er kontrollert, kan de føre til oksidativ skade, inkludert mitokondriell skade. Skadede mitokondrier frigjør mer ROS, og derved intensiverer cellulær skade og sykdomstilstanden. En homeostatisk prosess kalt mitokondriell autofagi (mitofagi) fjerner selektivt skadede mitokondrier, som deretter erstattes av nye. Det er flere mitofagiveier, med det vanlige endepunktet som nedbrytningen av de skadede mitokondriene i lysosomer.

Flere metoder, inkludert genetiske sensorer, antistoffimmunfluorescens og elektronmikroskopi, bruker dette endepunktet til å kvantifisere mitofagi. Hver metode for å undersøke mitofagi har sine fordeler, for eksempel spesifikk vev / cellemålretting (med genetiske sensorer) og stor detalj (med elektronmikroskopi). Imidlertid krever disse metodene ofte dyre ressurser, trent personell og en lang forberedelsestid før selve forsøket, for eksempel for å skape transgene dyr. Her presenterer vi et kostnadseffektivt alternativ for måling av mitofagi ved bruk av kommersielt tilgjengelige fluorescerende fargestoffer rettet mot mitokondrier og lysosomer. Denne metoden måler effektivt mitofagi i nematoden Caenorhabditis elegans og humane leverceller, noe som indikerer dens potensielle effektivitet i andre modellsystemer.

Introduction

Mitokondrier er essensielle for alle aerobe dyr, inkludert mennesker. De konverterer den kjemiske energien til biomolekyler til adenosintrifosfat (ATP) via oksidativ fosforylering1, syntetiserer heme2, nedbryter fettsyrer gjennom β oksidasjon3, regulerer kalsium4 og jern 5-homeostase, kontrollerer celledød ved apoptose6 og genererer reaktive oksygenarter (ROS), som spiller en viktig rolle i redokshomeostase7. To komplementære og motsatte prosesser opprettholder integriteten og riktig funksjon av mitokondriene: syntesen av nye mitokondrielle komponenter (biogenese) og selektiv fjerning av skadede gjennom mitokondriell autofagi (dvs. mitofagi)8.

Flere mitofagiveier medieres av enzymer, som PINK1 / Parkin, og reseptorer, inkludert FUNDC1, FKBP8 og BNIP / NIX 9,10. Spesielt kan den selektive nedbrytningen av mitokondrielle komponenter forekomme uavhengig av autofagosommaskineriet (dvs. gjennom mitokondrielle avledede vesikler)11. Imidlertid er endepunktene til de forskjellige selektive mitofagiveiene like (dvs. mitokondriell nedbrytning av lysosomale enzymer)12,13. Av denne grunn er ulike metoder for å identifisere og måle mitofagi avhengig av samlokalisering av mitokondrielle og lysosomale markører 14,15,16,17 og reduserte nivåer av mitokondrielle proteiner / mitokondrielt DNA 18.

Nedenfor er en kortfattet beskrivelse av eksisterende eksperimentelle metoder for måling av mitofagi i dyreceller ved bruk av fluorescensmikroskopi, med vekt på mitofagy-endepunktfasen.

Mitophagy biosensorer
Mitokondriell nedbrytning skjer i det sure miljøet i lysosomet19. Derfor opplever mitokondrielle komponenter, inkludert proteiner, et skifte fra en nøytral til en sur pH ved endepunktet av mitofagiprosessen. Dette mønsteret underbygger virkningsmekanismen til flere mitofagibiosensorer, inkludert mito-Rosella18 og tandem mCherry-GFP-FIS114. Disse sensorene inneholder et pH-følsomt grønt fluorescensprotein (GFP) og et pH-ufølsomt rødt fluorescensprotein (RFP). Derfor, ved endepunktet for mitofagi, faller det grønne til røde fluorescensforholdet betydelig på grunn av slukkingen av GFP-fluoroforen. De største begrensningene til disse sensorene er (1) mulig Förster resonans energioverføring (FRET) mellom fluoroforene; (2) differensialmodningsgraden av GFP og RFP; (3) dissosiasjon mellom GFP og RFP på grunn av proteolytisk spaltning av polypeptidet som forbinder dem; (4) fluorescens-utslipp overlapping; og (5) differensialfluoroforlysstyrke og slukking15,16.

En sensor som overvinner noen av disse begrensningene er Keima mitokondriesensor17. Mt-Keima-sensoren (avledet fra korallproteinet Keima) viser en enkelt utslippstopp (620 nm). Imidlertid er eksitasjonstoppene pH-følsomme. Som et resultat er det en overgang fra en grønn eksitasjon (440 nm) til en rød (586 nm) når du skifter fra høy pH til en sur pH16,17. En nyere mitofagisensor, Mito-SRAI, har avansert feltet ved å tillate målinger i faste biologiske prøver20. Til tross for de mange fordelene med genetiske sensorer, for eksempel evnen til å uttrykke dem i bestemte vev / celler og målrette dem mot forskjellige mitokondrielle rom, har de også begrensninger. En begrensning er at de genetiske sensorene må uttrykkes i celler eller dyr, noe som kan være tid- og ressurskrevende.

I tillegg kan uttrykket av sensorene i mitokondriene selv påvirke mitokondriefunksjonen. For eksempel utvider uttrykker mitokondriell GFP (mtGFP) i C. elegans orm kroppsveggmuskler mitokondrienettverket21. Denne fenotypen avhenger av funksjonen til den stressaktiverte transkripsjonsfaktoren ATFS-1, som spiller en viktig rolle i aktiveringen av ufoldet proteinrespons i mitokondrier (UPRmt)21. Derfor, selv om genetisk kodede mitokondrier / mitofagibiosensorer er ekstremt nyttige for å overvåke mitokondriehomeostase in vivo, kan de påvirke selve prosessen de er designet for å måle.

Mitokondrier/lysosomspesifikke antistoffer og fargestoffer
En annen strategi for å teste mitokondriell/lysosom-kolokalisering er å bruke antistoffer mot mitokondrielle/lysosomale proteiner, slik som det mitokondrielle ytre membranproteinet TOM20 og lysosomalt assosiert membranprotein 1 (LAMP1)22. I de fleste tilfeller brukes sekundære antistoffer som er konjugert til en fluorofor for å oppdage fluorescenssignalet via mikroskopi. En annen strategi er å kombinere genetiske konstruksjoner med mitokondrielle / lysosomale fargestoffer, for eksempel å uttrykke en LAMP1: GFP-fusjonskonstruksjon i celler mens du farger dem med et rødt mitokondrielt fargestoff (f.eks. Mitotracker Red) 16. Disse metodene, selv om de er effektive, krever spesifikke antistoffer og involverer ofte arbeid med faste prøver eller generering av celler / transgene dyr som uttrykker fluorescerende merkede mitokondrier / lysosomer.

Her skisserer vi bruken av et kommersielt lysosom / mitokondrier / nukleært fargesett for å vurdere mitofagiaktiverende egenskaper av syntetisk diamin O, O (oktan-1,8-diyl) bis (hydroksylamin), heretter referert til som VL-85023, i C. elegans ormer og den humane kreftcellelinjen Hep-3B (figur 1). Fargesettet inneholder en blanding av lysosomale / mitokondrielle / kjernefysiske målrettede fargestoffer som spesifikt flekker disse organellene23. Vi har tidligere brukt dette settet for å demonstrere mitofagiaktiviteten til 1,8 diaminooktan (heretter kalt VL-004) i C. elegans23. Det er viktig at vi validerte fargesettresultatene med mito-Rosella biosensor og qPCR-målinger av mitokondrielt: nukleært DNA-innhold23. Dette fargesettet gir følgende fordeler. For det første er det ikke nødvendig å generere transgene dyr eller celler som uttrykker en mitokondriell biosensor. Derfor kan vi studere umodifiserte dyr eller celler av villtype og dermed spare mye tid, penger og arbeidskraft. Dessuten, som nevnt, kan uttrykke mitokondrielle biosensorer endre mitokondriefunksjonen. For det andre er settet kostnadseffektivt, enkelt å bruke og raskt. For det tredje, selv om vi demonstrerer metoden i C. elegans og humane celler, kan den modifiseres for andre celletyper og organismer.

Når det er sagt, som enhver metode, har fargesettprotokollen ulemper. For eksempel utføres inkubasjonen av ormene med reagenset i fravær av mat (vi har sett at selv døde bakterier reduserer fargeeffektiviteten betydelig). Selv om inkubasjonstiden er relativt kort, er det mulig at selv i denne tidsrammen kan homeostatiske responser endres, inkludert mitofagi. I tillegg kan bindingen av fargestoffene til ER / mitokondrielle / nukleære proteiner og andre biomolekyler påvirke aktivitetene til disse organellene. Dessuten, i motsetning til mitofagimåling med genetiske sensorer, jobber vi med ormer og celler som har gjennomgått kjemisk fiksering. Det er derfor umulig å fortsette overvåkingen av de samme ormene/cellene til forskjellige tider. Derfor anbefaler vi å kombinere ulike metoder for å validere funksjonen til mitofagi i en bestemt fysiologisk prosess. Nedenfor presenterer vi nye data som viser at VL-850 induserer robust mitofagi i C. elegans ormer og Hep-3B-celler. Derfor støtter disse dataene ytterligere hypotesen om at VL-850 forlenger levetiden til C. elegans og beskytter C. elegans mot oksidativ skade gjennom induksjon av sunn mitofagi . Vi har brukt protonionoforkarbonylcyanid 4-(trifluormetoksy)fenylhydrazon (FCCP), som er en potent mitofaginduktor24, som positiv kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: For enkelhets skyld for leserne har vi delt protokollen i to deler: den ene fokuserer på protokollen for måling av mitofagi i C. elegans, og den andre fokuserer på protokollen for måling av mitofagi i leverceller. Listen over materialer finner du i den medfølgende materialfortegnelsen .

1. C. elegans-protokollen

  1. Fremstilling av nematodevekstmedium (NGM) plater og Escherichia coli OP50 bakteriell bestand
    MERK: Som et presiseringspunkt, mens vi fulgte standardprotokoller for fremstilling av NGM-plater og OP50 bakteriebestand25,26, erkjenner vi at det kan være variasjoner i disse protokollene mellom forskjellige laboratorier. Derfor har vi inkludert de komplette protokollene for å sikre nøyaktig replikering av eksperimentet.
    1. Lag en 1 M kaliumfosfatbuffer, pH 6, ved å tilsette ~ 150 ml 1 M K 2 HPO 4 til 500 ml 1 MKH 2PO4 løsning til pH 6 er nådd. Steriliser bufferen ved å føre den gjennom et 0,22 μm vakuumfilter/lagringssystem.
    2. Lag 0,1 M kalsiumklorid (CaCl 2) og magnesiumsulfat (MgSO4), og steriliser dem med et0,2 μm sprøytefilter.
    3. Forbered 5 mg / ml kolesterol i absolutt etanol.
      MERK: Siden kolesterolet er tilberedt i etanol, må du ikke filtrere det.
    4. Klargjør NGM-agar ved å oppløse 1,5 g natriumklorid (NaCl), 1,25 g pepton og 8,5 g agar i 500 ml dobbeltdestillert vann (DDW). Autoklav og la den avkjøles til ~55 °C.
    5. Under sterile forhold tilsettes 12,5 ml kaliumfosfatbuffer (pH 6), 0,5 ml 0,1 M CaCl2, 0,5 ml 0,1 M MgSO4 og 1 ml 5 mg/ml kolesterol. Bland godt etter hver tilsetning.
    6. Tilsett 4 ml smeltet NGM-agar til hver 35 mm plate. La oppvasken stå over natten for å stivne ved romtemperatur (RT, ~21 °C).
    7. For å lage Luria-Bertani (LB) agarplater, oppløs 5 g NaCl, 5 g trypton, 2,5 g gjærekstrakt og 7,5 g agar i 400 ml destillert, avionisert vann (DDW), juster pH i løsningen til 7,0, bring volumet opp til 500 ml med DDW og autoklav. Når oppløsningen er avkjølt til 55 °C, hell 25 ml av blandingen i hver 90 mm petriskål og la platene tørke i 2 dager ved romtemperatur. Deretter stryker du ut OP50-bakterier på de tørkede LB-platene fra glyserolbestanden, og inkuberer ved 37 ° C over natten for å oppnå enkeltkolonier.
    8. Forbered 2x gjærtrypton (YT) ved å oppløse 8 g trypton, 5 g gjærekstrakt og 2,5 g natriumklorid (NaCl) i 0,5 liter DDW. Juster pH til 7 og autoklav.
    9. Ved avkjøling, inokuler en OP50-bakteriekoloni fra den nystripede LB-platen til 50 ml 2x YT-medium i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe. Rist ved 37 °C og 250 o/min til en optisk tetthet (OD600) på ca. 0,6.
  2. Klargjøre kjøretøyet og forsøksplater
    1. Tilsett 100 μL OP50-bakterier til midten av hver 35 mm NGM-agarplate. Tørr overnatting ved RT (romtemperatur, 21 °C).
    2. Forbered 0,5 M VL-850 i DMSO, og fortynn til 10 mM VL-850 ved bruk av M9-buffer (22 mM KH 2 PO 4, 42mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, pH 7 og 1 mM MgSO 4) 26. Bekreft at pH er 7,0 (hvis ikke, titrer med 0,1 M HCl), og filtrersteriliser løsningen med et 0,22 μm sprøytefilter. Forbered kjøretøyet som beskrevet ovenfor, men uten stoffet (i dette tilfellet VL-850). Lag 50 mM FCCP i DMSO, fortynn til 1 mM FCCP med M9-buffer, og filtrersteriliser løsningen med et 0,22 μm sprøytefilter.
    3. Tilsett 25 μL kjøretøy (negativ kontroll), FCCP (positiv kontroll; 5 μM) eller VL-850 (eksperimentell behandling; 62,5 μM) til separat sådde NGM-plater på bakterieplenen.
    4. Dekk platene med aluminiumsfolie, og la dem tørke ved RT (romtemperatur, 21 °C). Bruk platene etter ~16 t.
  3. Innhenting av synkroniserte unge voksne C. elegans hermafroditter
    1. Lag 1 liter M9-buffer med 22 mM KH 2 PO 4, 42mM Na2HPO4 og 86 mM NaCl. Steriliser ved autoklavering, og la det avkjøles. Når den er avkjølt, tilsett 1 ml 1 mM MgSO4 (0,22 μm filtersterilisert).
    2. Bland 0,8 ml 2,5 N natriumhydroksid og 1 ml av en 5 % natriumhypoklorittoppløsning med 2,2 ml DDW for å lage en 4 ml alkalisk hypoklorittløsning (endelig konsentrasjon på 0,5 N for natriumhydroksid og 1,25 % for natriumhypokloritt).
    3. Samle ormene (gravide hermafroditter) i et 15 ml konisk rør ved å vaske NGM-platene med 1 ml M9 buffer 3x for å sikre at alle mødrene er samlet inn i røret.
    4. Sedimenter ormene ved sentrifugering ved 500 × g i 1 min, og kast supernatanten til et volum på 1 ml gjenstår.
    5. Tilsett 1 ml alkalisk hypoklorittløsning, og bland ved å vende røret 5x. Virvel forsiktig røret i 3 minutter for å hjelpe utgivelsen av egg, og observere tilstanden til ormer under et dissekerende stereoskop.
    6. Når ca. 50% av ormene er ødelagte, tilsett 5 ml M9-buffer og sedimenter eggene umiddelbart ved å sentrifugere i 1 min ved 500 × g.
    7. Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten. Tilsett 5 ml M9-buffer, og gjenta vaskeprosedyren 2x.
    8. Fjern supernatanten til det gjenstår 2 ml, og roter slangen (360° rotasjon) ved 20 rpm i ~16 timer (RT, 21 °C) for å få synkroniserte L1-larver. Fra dette røret, ta en 5 μL dråpe på et lysbilde, telle antall larver under et stereoskop, gjenta dette trinn 3x, ta et gjennomsnitt av de tre tellingene, og anslå antall ormer per mikroliter (μL). Basert på disse beregningene, legg til ~ 200 larver per NGM-plate sådd med OP50-bakterier.
    9. Dyrk L1-larvene ved 21 °C i ~48 timer til det unge voksne stadiet.
  4. Medikamentell behandling og mikroskopiprosedyre
    1. Sett 100 ormer på hver av eksperimentelle eller kontrollplater. Forsikre deg om at de negative, positive og eksperimentelle platene inneholder kjøretøyet, henholdsvis 5 μM FCCP og 62,5 μM VL-850. Inkuber ved 21 °C i 6 timer.
    2. Bruk 1 ml M9-buffer til å vaske ormene fra hver plate inn i et mikrosentrifugerør på 1,7 ml. Spinn røret kort (~3 s) i en minisentrifuge. Deretter kastes supernatanten ved å pipetere M9-bufferen forsiktig ut uten å forstyrre ormepelleten. Gjenta dette vasketrinn 2x, og fjern deretter supernatanten forsiktig uten å forstyrre ormepelleten.
    3. Tilsett 200 μL M9-buffer, som inneholder 0,1% v/v Poloxamer 188, 0,1% v/v Pluronic F127 og 2 μL av fargesettreagenset, til ormpelleten. La blandingen rotere ved 20 rpm (360 ° rotasjon) i 1 time ved RT (romtemperatur, 21 ° C). For å beskytte fargestoffene mot lys, dekk rørene med aluminiumsfolie.
    4. Snurr ormene forsiktig, som beskrevet i trinn 1.3.4. Fjern deretter fargeløsningen uten å forstyrre ormepelleten. Deretter vasker du ormene som beskrevet i trinn 1.3.2, og overfører dem til en frøet NGM-agarplate som inneholder riktig behandling - for eksempel overføres ormer behandlet med FCCP til en plate som inneholder FCCP. Dekk platene med aluminiumsfolie fordi fargereagenset er lysfølsomt.
      MERK: Vi overførte ormene til dyrkningsplater som inneholder bakterier og tilhørende behandlingsmiddel for å minimere bakgrunnsstøyen på grunn av overflødig fargestoff. For eksempel ble ormer behandlet med FCCP overført til FCCP-supplerte plater, og så videre.
    5. Vask ormene av platene i friske mikrosentrifugerør med 1 ml M9-buffer; vask ormene på samme måte 2x. Fest deretter ormene med 1% formaldehyd på is i 30 minutter, og vask ormene med 1 ml M9-buffer 3x for å fjerne gjenværende formaldehyd. Etter vaskene, spinn ormene ned til en pellet, og aspirer den maksimale mengden supernatant, hold ormepelleten intakt i 10 μL M9.
    6. For å forberede 2,5% agarose, veier 0,125 g agarose i et 10 ml borosilikatglassreagensrør, tilsett 5 ml M9-buffer og oppløs agarosen ved forsiktig oppvarming av røret med en Bunsen-brenner. Overfør den smeltede agarose til et tørt bad ved 75 °C, og bruk en spiss på 1 ml til å sette 100 μl av den smeltede agarosen på et Deckgläser mikroskopdekselglass (24 mm x 60 mm). Legg umiddelbart et annet lysbilde vinkelrett på agarosedråpen, og danner en kryssform. Vent ~ 2 min, og skill lysbildene forsiktig ved å (forsiktig) skyve det øvre dekselglasset, og dermed forlate agaroseputen på bunndekselet.
      MERK: Vær forsiktig når du oppvarmer agarose i røret, og sørg for at røret holdes vekk fra kroppen. Klipp kanten på spissen på 1 ml for å minimere koagulering av agarose.
    7. Overfør ormene til agaroseputen med en Pasteur-glasspipette (dvs. hele mengden i røret, ~10 μL). Fjern overflødig væske med en veke laget av en laboratorieserviett, og dekk deretter ormene med et mindre deksel (24 mm x 40 mm). Påfør gjennomsiktig neglelakk i periferien av det mindre dekselet for å forhindre fordampning. Sett lysbildet i en mørk boks for å beskytte den mot lys.
    8. Bruk et konfokalmikroskop for å avbilde ormene innen 24 timer ved passende bølgelengder (se nedenfor) ved hjelp av en 60x forstørrelseslinse.
      1. Plasser lysbildet på mikroskopstadiet.
      2. Åpne bildebehandlingsprogramvaren, og høyreklikk på det grå området av programvaren. Åpent oppkjøp | Ti2 Full Pad | ND-anskaffelse | LUT-er ved å klikke på alternativene i popup-vinduet som dukker opp som et resultat av høyreklikk.
      3. Under Ti2 Full Pad velger du 60x.
      4. Under Brukeranskaffelse velger du Okular DIA, og bringer ormene i fokus ved hjelp av mikroskopets finfokusknapp. Velg Spinning disk under Brukeranskaffelse, og velg alternativet 16-biters - Ingen binning. For hvert fluorescensfilter setter du eksponeringstiden til 500 ms og 20 ms for Brightfield. Når disse parametrene er angitt, velger du Kjør nå, og venter på at utdatabildet skal genereres som en ND2-fil.
        MERK: Eksponeringstiden må bestemmes eksperimentelt, da forskjellige bildeoppsett har forskjellige egenskaper. Bruk oppslagstabeller (LUT) til å undersøke fluorescensintensiteten for hver bølgelengde.
  5. Bildeanalyse
    1. Åpne konfokalbildene (her, Nikon ND2-filer) i ImageJ27 med colocalization plugin. Hver ND-fil inneholder bildeplan tatt på tre bølgelengder (ved hjelp av DAPI, GFP / FITC [grønn] og Texas Red [rød] filtre) og synlig lys. Du får tilgang til disse bildene ved å åpne ND-filen på ImageJ-serveren og velge Del bilder i dialogboksen. Arbeid med bilder fra lysfelt (BF), grønn kanal og røde kanaler.
    2. Generer duplikater av disse bildene for å holde det opprinnelige bildet uberørt ved å klikke på Bilde | Dupliser eller bruk hurtigtasten Shift + D.
    3. For å redusere bakgrunnen, generer en annen duplikat av bildet, som nevnt ovenfor. Trekk bakgrunnen med en rullende radius på 100, og velg alternativet Opprett bakgrunn (ikke trekk fra) for å generere et bilde med bakgrunnen til det gitte bildet. Gå deretter til Prosess | Bildekalkulator, og trekk det første dupliserte bildet fra det andre dupliserte bildet. Bruk de resulterende bildene til samlokaliseringsanalysen.
    4. For å bruke plugin-modulen for samlokalisering, konverter den grønne kanalen og røde kanalbilder til 8-bit. For å gjøre dette, klikk på Bilde | Type | 8 biter.
    5. Klikk på Plugins | Samlokalisering. For å måle samlokaliseringen av mitokondrier og lysosomsignaler ved hjelp av kolokaliseringspluginet (se ovenfor), bruk følgende parametere: Forhold = 75%, Terskel rød kanal = 80,0, Terskel grønn kanal = 50,0. Utdataene er et 8-biters binært bilde som inneholder colokalisert puncta og en kombinasjon av de tre 8-biters bildene (grønn, rød og det samlokaliserte bildet) i et RGB-bilde.
    6. Fokuser på puncta i hodet kroppsvegg muskel av ormer ved å manuelt velge dette området og lage en maske ved å klikke på Rediger | Utvalg | Opprett maske, som velger interesseområdet (figur 2A, B). Selektivt fjerne andre fargede enheter (f.eks pharyngeal muskler) for å analysere hodet kroppsvegg muskel regionen.
    7. For å velge partiklene i interesseområdet (ROI), velg de kolokaliserte 8-biters og maskerte bildene ved hjelp av bildekalkulatoren. Bruk deretter operasjonen AND (figur 3A) for å velge puncta i avkastningen. Dette genererer et bilde med puncta i avkastningen (figur 3B).
    8. For å analysere arealet av de kolokaliserte mitokondriene og lysosomene, velg Analyser | Analyser partikler, og mål summeringen av puncta mellom 0,1625 μm 2 og 4 μm2.

2. Hep-3B kreftcelleprotokollen

  1. Klargjøring av legemiddellagerløsningen
    1. Forbered 100 mM VL-850 i DMSO. Fortynn den til 5 mM med 0,5 M HEPES-buffer, pH 7,3, og steriliser løsningen med et 0,22 μm sprøytefilter. Forbered deretter kjøretøyet som beskrevet før, men uten stoffet (i dette tilfellet VL-850).
  2. Dyrking av Hep-3B-celler for forsøket, medikamentell behandling og mikroskopiprosedyre
    1. Dyrk Hep-3B-celler i 10 cm vevskulturplater som inneholder Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) supplert med 10% varmeinaktivert føtal bovint serum (FBS), 2% L-glutamin og 1% tetracyklin (heretter referert til som komplett DMEM). Inkuber cellene ved 37 °C og 5% CO2.
    2. Velg en plate med Hep-3B-celler som viser 70% -80% cellekonfluens (logaritmisk vekstfase), fjern mediet og vask platen med 5 ml forvarmet fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern PBS, og inkuber cellene med 1 ml forvarmet 0,25% trypsin / 0,02% EDTA i ~ 3 min ved 37 ° C; observere cellene under et vevskulturmikroskop (10x). Stopp trypsinfordøyelsen når cellene blir runde og begynn å dissosiere fra platen ved å legge til 5 ml komplett DMEM. Sentrifuge cellene ved 1000 × g i 5 minutter, fjern supernatanten og resuspender cellene i 5 ml fullstendig DMEM.
    3. Bestem cellekonsentrasjonen. Bland 50 μL av cellesuspensjonen med 50 μL trypanblått. Telle cellene ved hjelp av en automatisert celleteller eller ved hjelp av et hemocytometer 5x, og ta et gjennomsnitt av disse tellingene for å sikre nøyaktigheten av tellingene.
    4. Frø 42.000 Hep3G-celler i hver 8-brønns μ-lysbilde i 400 μL komplett DMEM (som beskrevet ovenfor). Inkuber cellene i 24 timer ved 37 °C og 5% CO2.
    5. Etter 24 timer ved ~ 80% -85% samløp, fjern 250 μL medium fra hver av brønnene, og tilsett 50 μL medium med riktig behandling eller kjøretøy. For å følge denne protokollen, behandle cellene med 100 μM VL-850, 5 μM FCCP og et kjøretøy som en kontroll.
    6. Etter 6 timers inkubasjon med forbindelsene, tilsett 50 μL medium til hver brønn som inneholder fargereagenset (0, 5 μL fargestoff for 250 μL i hver brønn). Inkuber cellene med fargestoffet i 30 minutter ved 37 °C og 5% CO2.
      MERK: Siden fargereagenset er lysfølsomt, minimer eksponeringen for lys ved å dekke prøvene med aluminiumsfolie og arbeide i et svakt lett miljø (hvis mulig).
    7. Bruk en 200 μL pipette, fjern forsiktig alt mediet (250 μL) fra hver brønn, og vask deretter cellene med 200 μL forvarmet PBS.
    8. Fest cellene med 200 μL fikseringsløsning inneholdende 4% formaldehyd og 2,5% glutaraldehyd fremstilt i PBS i 15 minutter ved RT.
    9. Dekanter fikseringsløsningen, og vask kort med 200 μL PBS.
    10. Tilsett 200 μL PBS, hold cellene dekket og beskyttet mot lys ved 4 °C, og bilde innen 24 timer.
      MERK: Vi brukte spinnediskens konfokalmikroskop i fire kanaler, inkludert DIC, TRITC, FITC og DAPI, som i trinn 1.4.8. Vi avbildet ~300 celler per behandling.
  3. Bildeanalyse
    1. Utfør trinn 1.5.1-1.5.5. For å oppnå avkastningen på cellene, generer et bilde som fremhever området av celler. For dette velger du et bilde av kolokaliserte punkter (RGB) (figur 4A). Hvis du vil merke hele celleområdet, velger du Prosess | Binær | Opprett maske for å få et binært bilde (figur 4B). Hvis du vil analysere området i cellen, velger du Analyser | Analyser partikler, og mål alle partiklene i bildet fra 0 til uendelig, som er standardinnstillingen for Analyser partikler.
    2. For å analysere arealet av de kolokaliserte mitokondriene og lysosomene, velg et kolokalisert 8-biters bilde, konverter det til binært ved å velge velg Prosess | Binær | Lag binær, velg Analyser | Analyser partikler, og mål summeringen av puncta mellom 0,1625 μm 2 og 4 μm2. For å måle den samlokaliserte punctaen, del arealet av de samlokaliserte mitokondriene og lysosomene med det totale celleområdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Induksjon av en robust mitofagirespons i både C. elegans ormer og Hep-3B celler med VL-850
VL-850 beskytter C. elegans ormer og humane keratinocytter (HaCaT-celler) mot oksidativt stress23. For ytterligere å utforske virkningsmekanismen undersøkte vi om VL-850 induserer mitofagi i C. elegans og andre humane celler. For å teste dette eksponerte vi C. elegans ormer (unge voksne, 3 dager etter L1) for 62,5 μM VL-850, 5 μM FCCP (positiv kontroll) og kjøretøy (negativ kontroll) i 6 timer. Som beskrevet ovenfor målte vi mitofagi ved bruk av fargereagenset. Vi valgte å bruke 62,5 μM-konsentrasjonen for VL-850 fordi den beskytter ormene mot oksidativt stress og forlenger levetiden betydelig23. VL-850 induserte robust mitofagi i ormenes hode-kroppsvegg-muskulatur (figur 5), noe som indikerer at det er en potent mitofaginduktor. Det er verdt å merke seg at mitofagstyrken til VL850 var lik den for FCCP (figur 5).

Videre utførte vi et lignende eksperiment med Hep-3B-celler; Denne cellelinjen stammer fra en 8 år gammel svart mann med primært hepatocellulært karsinom (HCC) 28. I likhet med C. elegans-eksperimentet eksponerte vi cellene for 100 μM VL-850, 5 μM FCCP (positiv kontroll) og kjøretøy (negativ kontroll) i 6 timer og brukte fargereagenset til å kvantifisere mitofagi. VL-850 og FCCP induserte signifikant mitofagi (i tilsvarende grad) i Hep-3B-cellene (figur 6), noe som ytterligere støtter vår hypotese om at VL-850 er en potent mitofaginduktor i både C. elegans og humane celler.

Figure 1
Figur 1 Mitofagimåling i C. elegans og Hep-3B celler. Skjematisk tegning som illustrerer bruken av fargesettet for å måle mitofagi i både C. elegans ormer og leverkreftceller. Forkortelser: VL-850 = O,O (oktan-1,8-diyl)bis(hydroksylamin); FCCP = karbonylcyanid 4-(trifluormetoksy)fenylhydrazon; PBS = fosfatbufret saltvann; NGM = nematodevekstmedium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Valg av hode-kroppsvegg-muskelregion av interesse hos C. elegans. (A) Interesseområdet velges manuelt, og en maske genereres. (B) Det resulterende maskebildet viser hovedområdet av interesse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kvantifisering av den samlokaliserte puncta i en region av interesse for C. elegans. (A) For å velge puncta i interesseområdet, må operasjonen "OG" velges. (B) Det resulterende bildet viser puncta i interesseområdet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Velge celler i et interesseområde . (A) Et RGB-bilde (colocalized points) genereres etter kolokaliseringsfunksjonen. (B) Et maskebilde som representerer hele celleområdet der puncta skal studeres. Forkortelse: RGB = rød, grønn og blå. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Induksjon av robust mitofagi i C. elegans med VL-850. (A) Pilspissene skildrer samlokalisering av mitokondrier og lysosomer som et eksempel på representativ samlokalisering. Innsatsen, som har en åtte-fold utvidelse, er gitt for bedre visualisering. Skalastenger = 100 μm. (B) Samlokaliseringen ble kvantifisert med tre biologiske repetisjoner og 30 ormer per behandling. Betydningen av resultatene ble bestemt ved å sammenligne dem med kjøretøykontrollene, og stjernene indikerer statistisk signifikans. Statistisk analyse ble utført med en uparret enveis ANOVA (Brown-Forsythe og Welch ANOVA-test med Welchs korreksjon), og en p-verdi på mindre enn 0,0001 (****p < 0,0001) ble ansett som statistisk signifikant. Forkortelse: FCCP = karbonylcyanid 4-(trifluormetoksy)fenylhydrazon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: VL-850 induserer signifikant mitofagi i Hep-3B-celler. (A) Pilspissene viser samlokalisering av mitokondrier og lysosomer for å representere samlokaliseringen, og et innfelt er inkludert for å demonstrere samlokaliseringen ved åtte ganger utvidelse. Skalastenger = 25 μm. (B) Samlokaliseringen ble kvantifisert med tre biologiske repetisjoner og N ≥ 411 celler per behandling (411 faller innenfor området som muliggjør statistisk signifikans og tillit til resultatene). Statistisk signifikante forskjeller ble vurdert sammenlignet med kjøretøykontrollene, og stjernene indikerer signifikans. Dataene ble analysert med en uparret enveis ANOVA (Brown-Forsythe og Welch ANOVA-tester med Welchs korreksjon), og en p-verdi på mindre enn 0,0001 (****p < 0,0001) ble ansett som statistisk signifikant. Forkortelse: FCCP = karbonylcyanid 4-(trifluormetoksy)fenylhydrazon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere mitofagiveier involverer forskjellige proteiner og biomolekyler (f.eks. Kardiolipin29). Imidlertid er endepunktet for disse veiene likt - nedbrytningen av mitokondrier av lysosomale enzymer12,13. Faktisk bruker flere metoder dette endepunktet for å kvantifisere mitofagi. Noen metoder, som elektronmikroskopi, krever imidlertid tilgang til kostbart utstyr, trente eksperter og en utvidet forberedelsestid for prøvene og analysen. Videre, til tross for fordelene ved å bruke mitofagibiosensorer, som inkluderer måling av mitofagi i spesifikke vev / celler / subcellulære rom, kan uttrykket av slike sensorer endre cellens fysiologi21. Derfor er det behov for en pålitelig, kostnadseffektiv og rask metode for å kvantifisere mitofagi uten behov for langsiktig interferens med normal cellefysiologi.

Her beskriver vi en slik metode, som innebærer bruk av en rimelig kommersiell blanding av mitokondrier / lysosom / nukleært fargestoffcocktail. Vi har nylig demonstrert nytten av å måle mitofagi i C. elegans og udødeliggjorte humane keratinocytter (HaCaT-celler)23. Resultatene fra fargesettet ble validert med to biosensorer, inkludert mito-Rosella (i C. elegans) og cox8-mCherry-EGFP (i humane SH-SY5Y-neuroblastomceller), samt qPCR-eksperimenter som kvantifiserte forholdet mellom mitokondrielt og nukleært DNA-innhold og ekspresjonen av flere mitofagi/autofagi-gener23.

I denne studien utvidet vi vår forskning for å utforske mitofagi-aktiverende potens av VL-850 i C. elegans ormer og humant leveradenokarsinom Hep-3B-celler. Resultatene viser at VL-850 er en potent mitofaginduktor (figur 5 og figur 6). Disse resultatene støtter videre de tidligere observasjonene om at VL-850 beskytter C. elegans mot oksidativt stress og forlenger levetiden, samt induserer mitofagi i HaCat-celler23.

Til tross for nytten av fargesettet, har det noen begrensninger med hensyn til C. elegans studier. For det første, i det minste under de studerte forholdene, observerte vi ikke farging av dendritter og axoner. Derfor er den nåværende protokollen ikke nyttig for å måle mitofagi i disse nevrale enhetene. For det andre kan intestinal autofluorescens forstyrre det grønne fluorescenssignalet til mitokondriefargestoffet. Derfor bør det utvises forsiktighet ved bruk av denne metoden for mitofagimålinger i tarmen. Til slutt, og spesielt i sammenheng med menneske / gnagercellelinjer, kan lysosomfargestoffet flekke sure enheter i kjernen. Derfor anbefales det å empirisk titrere fargereagenskonsentrasjonen/inkubasjonstiden for hver cellelinje/mediumsammensetning.

Videre, som antydet ovenfor, er ingen enkelt metode tilstrekkelig for å demonstrere mitofagi. Derfor anbefaler vi validering av fargereagensresultatene ved hjelp av alternative metoder (f.eks. mitofagibiosensorer, qPCR, immunfarging) og inkluderer alltid en positiv mitofagikontroll (f.eks. FCCP). Avslutningsvis gir fargestoffcocktailen en pålitelig og kostnadseffektiv metode for kvantifisering av mitofagi i C. elegans og humane celler. Gitt den betydelige forskjellen mellom humane og C. elegans-celler , forventer vi at denne metoden lett kan tilpasses andre dyresystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Gross-laboratoriet for kritisk lesing av manuskriptet og deres kommentarer og råd. Vi takker Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansiert av National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), for å gi noen av stammene. Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Vitalunga Ltd og Israel Science Foundation (stipend nr. 989/19). Den grafiske abstrakte figuren (figur 1) ble generert med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent or resource
Analytical balance Mettler-Toledo
Bacto Agar BD-Difco 214010
Bacto Peptone BD-Difco 211677
Bacto Tryptone BD-Difco 211705
Bacto Yeast extract BD-Difco 212750
Calcium chloride Sigma C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma C2920
Chemicals
Cholestrol Thermo Fisher C/5360/48
DMEM high glucose Biological Industries 01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
FBS heat inactivated Invitrogen M7514
Gluteradehyde (25%) Sigma G5882
HEPES Buffer 1 M Biological Industries 03-025-1B
L-gluatamine Biological Industries 03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent Abcam ab139487
Magnesium Sulfate Sigma M7506
Nonidet P 40 Sigma 74385
Paraformalydehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15720
Poloxamer 188 Solution Sigma P5556
Potassium dihydrogen phosphate Millipore 1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium Chloride Bio-Lab 1903059100
Sodium Hydroxide Gadot 1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate Sigma 4273
Tetracycline hydrochloride Sigma 87128-25G
Trypsin-EDTA Biological Industries 03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter Millex GV SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes Lifegene LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates Corning 430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB15-500
35 mm Petri dishes Bar Naor BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm Lifegene LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm Marienfeld 101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass Pyrex 99445-13
iBiDi 8 well μ-slides iBiDi 80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm Bar Naor BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire World Precision Instruments PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF DeNovix CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400 Biosan BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software Nikon CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope Olympus SZ61
pH meter Mettler-Toledo MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator Labnet H5600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
  2. Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
  3. Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
  4. Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
  5. Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
  6. Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
  7. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
  8. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
  10. Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
  11. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  12. Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
  13. Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
  14. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  15. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  16. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  17. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
  18. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  19. Yim, W. W. -Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
  20. Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
  21. Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
  22. Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
  23. Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
  24. Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
  25. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  26. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1988).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
  29. Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).

Tags

Biologi utgave 195 Mitofagi mitokondriell autofagi lysosom Caenorhabditis elegans Hep-3B celler
Påvisning av mitophagi i <em>Caenorhabditis elegans</em> og pattedyrceller ved bruk av organelle-spesifikke fargestoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srivastava, V., Gross, E. Detection… More

Srivastava, V., Gross, E. Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes. J. Vis. Exp. (195), e65337, doi:10.3791/65337 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter