Summary
本研究では、無傷の筋肉体積による筋肉内脂肪組織(IMAT)沈着を視覚化および定量化するための脱細胞化ベースの方法論、およびIMATを構成する個々の脂肪細胞の指標を定量化する方法について説明します。
Abstract
脂肪浸潤は、骨格筋の筋線維間の脂肪細胞の蓄積であり、多くのミオパチー、代謝障害、およびジストロフィーの顕著な特徴です。臨床的には、ヒト集団では、コンピューター断層撮影(CT)、磁気共鳴画像法(MRI)、超音波(米国)などの非侵襲的方法を使用して脂肪浸潤が評価されます。CTやMRIを用いてマウスの筋肉への脂肪浸潤を定量化した研究もあるが、コストや空間分解能の不十分な状況が依然として課題となっている。他の小動物法では、組織学を利用して個々の脂肪細胞を視覚化します。ただし、この方法論は、異質な病理学におけるサンプリングバイアスに悩まされています。このプロトコルは質的に質的に示し、量的に脂肪質の浸潤をそのままのマウス筋肉中そして脱細胞化を使用して個々の脂肪細胞のレベルで包括的に測定する方法論を記述する。このプロトコルは、特定の筋肉や特定の種に限定されず、ヒトの生検にも拡張できます。さらに、標準的な実験装置を使用して、わずかなコストで全体的な定性的および定量的評価を行うことができるため、この手順は研究所全体でよりアクセスしやすくなります。
Introduction
骨格筋内の筋線維間の脂肪細胞の蓄積は、2型糖尿病からサルコペニア、筋骨格系損傷まで、さまざまな状態の顕著な特徴です1,2,3,4,5,6,7。IMAT沈着はインスリン抵抗性3,8,9,10および骨格筋機能の低下と強く相関しているため、この筋肉内脂肪組織(IMAT)の包括的な評価は、これらの状態の病因を理解するために重要です 11,12,13,14,15 .これらの関連性は何十年にもわたって指摘されてきましたが、IMATに関連するメカニズムと起源は、依然として集中的な研究の領域です。これは、骨格筋脂肪浸潤を評価するほとんどの研究がヒトで行われており、そのメカニズム調査が限られていることが一因です16,17。しかし、最近では、マウスを含む小動物モデルが、IMATの発生とシグナル伝達の細胞制御を特定するために利用されています18,19,20。この研究は、骨格筋脂肪浸潤を定性的に視覚化および定量化するための小動物モデルで使用するための新しいツールを提供することを目的としています。
臨床的には、ヒト集団では、コンピューター断層撮影法(CT)6,21、磁気共鳴画像法(MRI)16,17,22,23、超音波(US)17,24などの非侵襲的方法を使用して脂肪浸潤が評価されます。これらのイメージング技術は、典型的には、筋肉内の定義された関心領域(ROI)を識別し、その領域内の画像スライスを取得するが、包括的なアプローチも採用されている25,26,27。これらの画像スライスは、定性的な等級付け6にかけられ、画素閾値28によって定量化される。同様のアプローチは、以前に動物で利用されています29,30;しかし、それらは高価であり、小動物イメージングシステムへのアクセスが必要です。CTやMRIによる空間分解能も大きな問題であり、ボクセル内の骨格筋線維からIMAT脂肪細胞を描写することができず、代わりに主に筋肉領域と主にIMAT領域の主観的な分離に依存しています31,32。そのため、脂肪組織や筋肉組織を正確に識別できないことは、これらの組織の代表量の定量化も不正確になります。
これらの制限により、小動物モデルにおける骨格筋脂肪浸潤を評価するための現在の技術は、最も一般的には、安価でアクセス可能な代替手段として組織学に依存しています33,34。ヘマトキシリンやエオシン(H&E)、オイルレッドO(ORO)、ペリピンなどの脂肪細胞マーカーの免疫染色などの標準的な染色手順により、筋肉内の脂肪浸潤を含む脂肪細胞を簡単に検出および可視化できます。しかし、組織学的アプローチが包括的であることはめったになく、典型的には、IMATの定性的または定量的評価は単一のセクション34に限定される。脂質抽出は、総筋脂質の定量化にも使用されています35。しかし、この手法では、筋細胞内脂質(IMCL)と筋肉内脂肪組織(IMAT)の貯蔵庫を区別できない36。要約すると、筋肉中の脂肪を視覚化および定量化するための現在の方法論は、経済的コストまたはIMATの特定の検出のいずれかによって制限されたままです。
ここでは、骨格筋脂肪浸潤を定性的可視化とマルチスケール定量化の両方によって評価するための詳細な方法について説明します。この方法論は、IMCLを含む筋細胞構造を除去するが、より大きなIMAT脂肪細胞由来の脂質滴をそのまま保持する単純な脱細胞化技術を採用しています。この技術の特異性の検証は、脱細胞化によるIMCLの枯渇を示すための脂質抽出、脱細胞化によるIMATパターニングの保持を示すためのμCT、および脱細胞化で同定されたものと比較してIMAT脂質滴の類似したサイズ分布を示すための組織学の使用を含む37が発表されている37。脱細胞化後、筋肉を脂溶性色素で染色して、パターンや脂肪浸潤の程度を定性的に可視化したり、個々のIMAT脂質滴の定量的イメージングを行ったりすることができます。その後、イソプロパノールで色素を抽出し、得られた溶液の光学密度(OD)を使用してIMAT脂質体積を推定できます。この手法の厳密な検証は、他の場所で公開されています37。本稿では、マウスの筋肉でこの方法を使用するための詳細なプロトコルを提供し、他の種や他の組織の筋肉など、他のアプリケーションでのこの方法の採用をサポートするためのトラブルシューティングのヒントを提供します。
Protocol
マウスの飼育と犠牲は、国立衛生研究所の実験動物の使用と飼育に関するガイドに従って行われました。すべての研究は、ワシントン大学セントルイス医科大学の動物研究委員会によって承認されました。生後2〜3ヶ月の雄のC57BL/6Jマウス( 材料表を参照)を使用して、このプロトコルに含まれるサンプル画像を生成しました。以下に説明するすべてのステップは、室温で実行されます。
1.筋肉の脱細胞化
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1%w/vドデシル硫酸ナトリウム(SDS; 材料表を参照)溶液を調製します。完全に混ざるまで溶液をかき混ぜます。
注:1%SDSはまとめて調製し、室温で1か月間保存できます。 - 前述のように、目的の筋肉を解剖します38,39。
- 70%エタノール溶液で髪と皮膚を濡らし、約2cmの経皮的切開を行った後、鉗子とスプリングハサミで覆っている皮膚を取り除きます。
注:ここで関心のある筋肉には、前脛骨筋(TA)、長指伸筋(EDL)、および横隔膜が含まれます。一部の筋肉は他の筋肉組織の奥深くにあり、他の筋肉の解剖を必要とする場合があります(たとえば、EDLを解剖するにはTAの除去が必要です)。 - 鋭利なハサミまたはブレード( 材料表を参照)を使用して目的の筋肉を解剖し、筋肉の全範囲が得られ、エッジが滑らかであることを確認します。
注:これは、視覚化を改善するために、解剖顕微鏡の下で行うのが理想的です。 - 筋肉を点検して、骨の欠けや不揃いのエッジが含まれていないことを確認してから、必要に応じて鋭利なハサミでこれらを切り取ります。
- 分析天びんを使用して筋肉の重量を量り、重量を記録します。
- 70%エタノール溶液で髪と皮膚を濡らし、約2cmの経皮的切開を行った後、鉗子とスプリングハサミで覆っている皮膚を取り除きます。
- 解剖した筋肉を、重量1ミリグラムあたり少なくとも0.1mLの1%SDSに入れます。6ウェル、12ウェル、または24ウェルプレートは、それぞれ横隔膜、TA、およびEDLマウスの筋肉に適しています。一般的な容量は、6 mL、12 mL、24 ウェルプレートでそれぞれ 6 mL、3 mL、1.5 mL です。
注:SDS溶液は筋肉を変形させることがあるので、最初の浸漬時に筋肉が平ら/伸びていることを確認してください。 - ウェルプレート(または他の容器)を50〜80Hzに設定されたロッキングシェーカーに置きます。
- SDS溶液を定期的に目視検査します。溶液が濁ったら、ピペットで溶液を取り除き(筋肉を吸引しないように注意して)、等量の新鮮な1%SDSと交換します。溶液が24時間透明なままになると、脱細胞化が完了します。
注:溶液交換に必要な頻度は、筋肉のサイズと初期溶液量によって異なります。TAのような大きな筋肉は数時間以内に新しいSDSを必要とし、EDLのような小さな筋肉は元の溶液で一晩中過ごすことができます。 - 脱細胞化した筋肉から最終的なSDS溶液をピペットで除去し(筋肉を誤嚥しないように注意して)、等量のPBSと交換します。
- 解剖顕微鏡で脱細胞化した筋肉を目視検査し、鉗子とハサミを使用して筋肉に付着した髪の毛や破片を取り除きます。
注:また、このステップでは、脱細胞化筋肉の明瞭さにも注意してください。脱細胞化した筋肉が完全に透明ではなく、SDS溶液が24時間にわたって曇りが増加しない場合、脱細胞化は効率的ではありませんでした。これにより、定性的および定量的評価にアーティファクトが作成されるため、実験筋に進む前に、常に練習用サンプルで脱細胞化を最適化する必要があります。 - PBSを慎重に取り出し、等量の3.7%ホルムアルデヒドまたは4%パラホルムアルデヒド溶液と交換し、プレートをロッキングシェーカーに24時間戻します。
注:ホルムアルデヒド溶液が脱細胞化した筋肉を完全に覆っていることを確認してください、そうでなければ染色は不均一になります。
2. オイルレッドOによるIMATの可視化
- OROの溶液を調製する。
- 0.5 gのORO粉末( 材料表を参照)を100 mLのイソプロパノールに溶解して、ストック溶液を生成します。
注意: 溶液に穏やかな熱を加えて完全に溶かします。このストックは室温で1ヶ月間保存できます。 - OROストック溶液と脱イオン水を60:40の比率で組み合わせて、少なくとも0.1 mL / mgの筋肉重量の容量を使用して、すべての筋肉に必要な作業溶液を取得します。一般的な容量は、6 mL、12 mL、24 ウェルプレートでそれぞれ 6 mL、3 mL、1.5 mL です。
注意: 混合する前に原液を検査してください。原液に大量の微粒子が含まれている場合は、新鮮なストックを作ります。 - 作業溶液を10分間覆い、微粒子を沈殿させます。
- 40 μmメッシュで作業溶液をろ過し、続いて0.22 μmシリンジフィルターでろ過します。
注:0.22 μmのシリンジフィルターは急速に目詰まりするため、作業溶液が簡単に押し出されない場合は交換する必要があります。
- 0.5 gのORO粉末( 材料表を参照)を100 mLのイソプロパノールに溶解して、ストック溶液を生成します。
- ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒド溶液を除去し、等量のPBSの3回の溶液交換で脱細胞化した筋肉を洗浄します。
- PBSを等量の60%イソプロパノール溶液と交換し、ロッキングシェーカーで5分間インキュベートします。
- 60%イソプロパノール溶液をOROワーキング溶液と交換し、ロッキングシェーカーで10分間インキュベートします。
注:OROワーキング溶液が脱細胞化筋肉を完全に覆っていることを確認してください、そうでなければ染色は不均一になります。 - ORO作業溶液を等量の1%SDSと交換します。SDS溶液を定期的に目視検査します。溶液が著しくピンク色になったら、ピペットで溶液を取り除き(筋肉を吸引しないように注意して)、新しい1%SDSと交換します。
- 溶液が24時間透明のままになったら、1%SDSをPBSに交換し、4倍の倍率で解剖/実体顕微鏡で染色された筋肉を検査します。筋肉の外側に付着している明らかな破片や微粒子を取り除きます。これが広範囲にわたる場合は、脱細胞化した筋肉を洗浄組織上で優しく転がして、破片/微粒子を剥がすことができます。
- 染色が満足のいくものであれば(透明なマトリックスに真っ赤な球体が浮かんでいる)、実体顕微鏡に取り付けたカメラを使用して、必要に応じて染色の画像を取得します( 材料表を参照)。
注意: 解剖顕微鏡にカメラが取り付けられていない場合は、電話のカメラを使用して接眼レンズを通して写真を撮ることができます。
3. BODIPYによるIMAT脂質滴の可視化
注:共焦点イメージングは、EDLや横隔膜(~2mmの厚さ)のような薄い筋肉で最も効果的です。あるいは、TAのような同等の厚さの筋肉のストリップを使用することもできます。
- PBSで蛍光BODIPY 493/503( 材料表を参照)の1:200溶液を調製して、少なくとも0.1 mL / mgの筋肉重量の作業溶液量を取得します。一般的な容量は、6 mL、12 mL、24 ウェルプレートでそれぞれ 6 mL、3 mL、1.5 mL です。
- ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、または1%SDSを除去し、同量のPBSを3回交換して脱細胞化した筋肉を洗浄します。
- PBSをBODIPYワーキング溶液と交換し、ロッキングシェーカーで20分間インキュベートします。
- 脱細胞化した筋肉を、等量のPBSの3回の溶液交換で洗浄します。
- 利用可能な共焦点顕微鏡と互換性のある透明な底の血管に筋肉を置きます。理想的には、皿の底が凹んでいて、筋肉を変形させることなくカバースリップを筋肉の上に配置します( 材料表を参照)。
- 488レーザーを使用して、標準的な共焦点顕微鏡( 材料表を参照)で画像スタックを取得します。EDLの一般的なスタックサイズは0.5〜1mmで、スライスの厚さは10μmで、スタックあたり50〜100枚の画像が得られます。
注:総脂質体積、IMAT脂質滴の総数、およびクラスタリングの最近傍指数を定量化するには、画像登録のために重複を残すように注意しながら、筋肉体積全体を画像化します。平均脂質液滴量を定量化するには、1スタックで十分です。 - 必要に応じて、セクション2に従って筋肉をOROで染色し、IMAT分布の筋肉全体の画像を補完します。
注:BODIPYは蛍光性であるため、OROの画像を取得すると、光学顕微鏡では見えません。
4. 脂質抽出による総脂質量の推定
- 画像取得後、筋肉を 96 ウェルプレートの個々のウェルで 200 μL のイソプロパノールに移すか、筋肉が大きすぎて収まらない場合はウェル/容量を調整します。
- プレートを軽くたたくか、溶液を上下にピペッティングするか、ピペットチップで筋肉を機械的に押しつぶして、顕微鏡で脱細胞化した筋肉に赤/蛍光球が見えなくなるまで、溶液を攪拌します。
注:最高の信頼性を得るために、すべての筋肉をタッピング、ピペッティング、および破砕の同じ組み合わせで処理します。また、イソプロパノールは急速に蒸発するため、タッピング、ピペッティング、破砕に費やす時間を制限するように注意してください。 - ピペッティングで上下させて各ウェルで溶液を混合し、75 μLをプレートの2つのクリーンウェルに移します。
- プレートを覆い、分光光度計またはプレートリーダーを使用して、複製された75 μLウェルの吸光度を読み取ります。コンストラクトをOROで染色した場合は、溶液を500 nmで読み取ります。BODIPY 493/503で染色した場合は、プレートを493 nmで読み取ります。
注:コンストラクトをBODIPYとOROの両方で染色した場合、500 nmのリードでは、OROのみで染色したコンストラクトとOROとBODIPYで染色したコンストラクトの間で同様の結果が得られるため、プレートを500 nmで読み取ることをお勧めします。 - 必要に応じて、吸光度の読み取り値を記録された筋肉の重量で割り、サンプル間のサイズの違いを補正します。
5. 共焦点画像からのIMAT脂質滴指標の定量化
注: このセクションでは、ImageJ バージョン 1.47 ( 資料表を参照) 以降と ImageJ の基本スキル40 へのアクセスが必要です。
- ImageJ で共焦点スタックを開きます。
注:共焦点顕微鏡が異なれば、共焦点画像を異なる形式で保存できる場合があります。ImageJは、スタック41を開くために、フィジーなどの追加のプラグインまたはバリアントを必要とし得る。使用されるアルゴリズムは、ImageJ ソフトウェア・パッケージの一部です。 - ImageJ でしきい値処理アルゴリズムを実行して、BODIPY 正のピクセルを特定します。これにより、現在のイメージがバイナリ イメージに変換されます。
- 「イメージ」>「>しきい値の調整」を選択して、しきい値ユーザーインターフェイスを開きます。ユーザー インターフェイスで、しきい値設定タイプとして [Intermodes] を選択し、[Dark background] が選択されていることを確認します。他のオプションを選択する必要はありません。次に、[適用]をクリックします。
- スタックをバイナリに変換するためのダイアログボックスが開きます。次のオプションが選択されていることを確認します。 メソッド:インターモード。背景:暗い。各画像と黒の背景(バイナリマスクの)のしきい値を計算します。これにより、白はBODIPYの正のピクセルを示し、黒はBODIPYの負のピクセルを示すバイナリスタックが生成されます。
メモ: インターモードしきい値 処理アルゴリズムは、すべてのユーザーにとって最適な選択ではない場合があります。ImageJ に組み込まれている閾値処理オプションの主観的な検査は、BODIPY の正のピクセルと負のピクセルを分離するための最適なアルゴリズムを選択するのに役立ちます。
- ImageJ で Watershed アルゴリズムを実行して、接触する脂質滴を分離します。[ Process > Binary > Watershed] を選択します。ダイアログボックスが開き、スタック内のすべての画像を処理するかどうかを尋ねられます。[ はい] を選択します。これにより、白一色の広い領域を分割する細い黒い線が追加されます。
- ImageJ の粒子分析アルゴリズムを使用して ROI を特定します。
- [解析]>[パーティクルを解析]を選択します。選択設定を行うためのダイアログボックスが開きます。
注:脂質滴 ROI の最適な推定値を得るためには、サイズ範囲の選択が重要です。下限は、IMAT由来の脂質滴(バックグラウンドアーチファクト)としては小さすぎる可能性が高い領域を除外し、上限は、単一のIMAT由来の脂質滴(Watershedアルゴリズムによって分離されなかった接触脂質滴)には大きすぎる可能性が高い領域を除外します。 - これらの値を設定するには、元の画像を開き、楕円ツールを使用して、ビュー内の最小および最大の脂質滴の輪郭を描きます。次に、これらの図形を "t" と入力して ROI マネージャーに追加します。 [分析] を選択し、 次に [測定値の設定] を選択します。設定を選択するためのダイアログボックスが開きます。
- [Area only] をオンにして [OK] をクリックします。次に、ROIマネージャーから[測定]を選択します。この結果ウィンドウの 2 つの面積メジャーを、パーティクルの解析(Analyze Particles)のサイズ範囲として使用します。
- [ マネージャに追加(Add to Manager )] がオンになっていることを確認します。他のオプションは必要ありません。
- [解析]>[パーティクルを解析]を選択します。選択設定を行うためのダイアログボックスが開きます。
- ROI マネージャーで [ すべて表示 ] をオンにして、共焦点スタックに ROI をオーバーレイします。スライダーバーを使用して各スタックスライスを個別に検査し、楕円ツール(ImageJツールバーにあります)を使用して欠落している領域を手作業で追加します。
- ROI 測定値を出力します。 「分析」>「測定値を設定 」を選択し、「 面積」、「重心」、「楕円のフィット 」、および 「スタック位置」を選択します。[ OK]をクリックします。次に、ROIマネージャーから [測定 ]を選択します。結果テーブルのデータを選択し、MatlabまたはExcelにコピーしてさらに分析することができます。
- Refine.m Matlab コード37 または同様のアルゴリズムを使用して、各スタックの ROI を 1 つの ROI に調整します。
注:このステップは、ステップ5.2〜5.4が隣接するスライス内の同じ脂質滴を異なるROIとして識別するために必要です。ただし、ROIを手作業のみで識別したり、ImageJで重複するROIを手作業で削除したりして、Matlabの必要性を回避することもできます。 - MATLAB または Excel を使用して ROI の要約統計量を取得します。
- 脂質液滴の総数を ROI の総数として推定します。
- 形状の深さが楕円の長軸と短軸の平均であると仮定して、各 2D ROI に適合した楕円の体積として脂質液滴の体積を推定します。
- 個々の推定脂質滴量の合計である総脂質量を推定します。
Representative Results
骨格筋脂肪浸潤の定性可視化
適切に脱細胞化された筋肉は白く、半透明です(セクション1; 図1)。脱細胞化した筋肉をOROで染色してIMATを可視化すると(セクション2)、透明な筋肉構造内にIMAT脂質滴が赤い球体として現れます(図1)。健康なマウスの後肢の筋肉には天然のIMATがほとんどなく、赤色のORO陽性脂質がほとんどまたはまったくないことが証明されています(図1A)。比較すると、後肢の筋肉に心電毒(CTX; 図1B)またはグリセロール(GLY; 図1C)脱細胞化の14日前には、IMATの蓄積が増加し、前述のようにGLYと比較してCTX後のIMATの濃度が高くなります37。
不完全な脱細胞化は、最初のSDS処理の直後、またはORO染色のウォッシュアウト後に半透明の淡いピンク色の繊維として識別できます(図2Bと図2Aの比較)。OROの不完全なクリアランスは、OROウォッシュアウト後に、明確なファイバーラインではなく、ピンクまたは赤の均一な背景として識別できます(図2C)。図2A、Bには、脱細胞化筋肉の外側にある脂質滴の塊である上筋脂肪(アスタリスク)も含まれています。図2Cは、脱細胞化中に筋肉が広がっていない場合に起こりうる筋肉の折り畳みも示しています。不完全な脱細胞化、不完全なOROクリアランス、および残留筋肉上脂肪はすべて、抽出された脂質の(OD)を人為的に増加させますが、それらがアーチファクトとして認識されている場合、必ずしも脂肪浸潤の定性的評価を妨げるわけではありません。
骨格筋脂肪浸潤の定量的イメージング
BODIPY蛍光標識された脂質滴は、共焦点顕微鏡 で 画像化して、個々の脂質滴の指標と分布をより詳細に評価できます(図3)。このプロセスは、前述のように、Matlabコード37を含めて半自動化されています。良好なBODIPY染色により、平面でイメージングすると、隣接する形状から線引きされた明るい楕円形が得られます(図3A)。閾値処理と形状セグメンテーションは、各脂質滴の ROI を生成するための最初のパスとして適していますが(図 3B)、エラーを修正するには手動で編集する必要があります。最も蔓延しているエラーは、組織の奥深くにある脂質滴で、どのスライスでも明るくありません(図3B、ピンク色の二重矢印)。これは、ImageJの楕円形ツールを使用してROIを手作業で追加することで改善できます(図3C)。2つ目は、脂質滴のグループを単一のROIとして識別することです(図3B、赤いアスタリスク)。これは、元のROIを削除し、複数の新しいROIに置き換えることで修正できます(図3D)。最後に、1 つの脂質滴が複数のスライスで一意の ROI として識別されるため、重複する ROI を 1 つの ROI に統合する必要があります(図 3E、青い矢印)。これは、Matlabなどのデータ処理ツールを使用して最も簡単に行うことができますが、最大のROIを特定し、残りを削除することで手動で行うこともできます。C57BL6/Jおよび129Svマウスにおける各測定基準の平均値は、Biltz et al.37に見出すことができる。
図1:脱細胞化筋肉のオイルレッドO(ORO)染色例。 生理食塩水 (SAL)、カルディオトキシン (CTX)、またはグリセロール (GLY) による注射の 14 日後に ORO 染色された筋肉。マウスの長指伸筋(EDL)と前脛骨筋(TA)は、SAL治療(A)ではIMAT(赤い球)がほとんどありませんが、CTX(B)とGLY(C)治療に応答してIMATが蓄積します。完全な脱細胞化とOROウォッシュアウトがあり、透明な白い筋肉の背景に明確なORO陽性の脂質滴によって証明されます。スケールバー = 500 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ORO染色結果が不十分な例。 不完全な脱細胞化または不完全なOROクリアランスは、半透明のピンク/赤の背景につながります。完全に脱細胞化されたマウス横隔膜筋の透明な白色背景(A)と比較して、不完全な脱細胞化は淡いピンク/赤色の繊維トラック(B)を特徴とし、不完全なOROクリアランスはびまん性ピンク/赤の背景(C)によって特徴付けられます。スケールバー:上部パネル= 1 mm;下部パネル = 500 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:蛍光BODIPY染色と共焦点顕微鏡による個々の脂質滴の同定例 個々のBODIPY染色された脂質滴は、共焦点顕微鏡を使用して脱細胞化筋肉で識別および定量化できます。共焦点スタックを通る個々のスライスでは、面内の脂質滴が明るい緑色の楕円として表示され、面外にある脂質滴が薄い形状として表示されます(A;青い矢印)。流域オブジェクトのセグメンテーションとROIの同定を組み合わせた閾値処理により、BODIPYで染色されたROIをマッピングできます(B)。閾値処理では、一部のかすかな脂質滴(B;ピンク色の二重矢印)を見逃す場合があり、手作業による識別が必要です(C)。流域のセグメンテーションでは、複数の脂質滴をグループ化することがあり(B、赤いアスタリスク)、ROIの削除と手作業による再推定が必要です(D)。同じ脂質液滴が複数のスライスで同定され、重複するROIを削除するために画像レジストレーション(E)が必要です。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Discussion
この原稿では、筋肉内脂肪組織(IMAT)の発生と病理学的拡大の病因をさらに理解するために適用できる、小動物モデルにおける骨格筋脂肪浸潤を定性的に視覚化および定量化する方法について説明します。全筋肉の脱細胞化と脂溶性染色の使用により、筋肉全体のIMATの存在を包括的に評価するための費用対効果が高く、再現性が高く、シンプルな方法論が可能になります。
このプロトコルの基礎はSDSの筋肉のdecellularizationがIMCLの小さい脂質の点滴を含むmyofibersの細胞部品を、取除くが、intramyocellular脂肪細胞の大きい脂質の点滴を倹約することである。SDSは、マトリックスを脱細胞化するために組織工学で広く使用されてきました42。脂肪や骨格筋などの組織は、典型的には、残存脂肪細胞脂質を除去するために、追加の機械的解離および/またはアルコール抽出を必要とする42,43。これは、SDSによる脱細胞化がIMCLを除去する一方で、脂肪細胞の大きな脂質滴を温存するためであることを以前に示しました37。脱細胞化前および脱細胞化後の四酸化オスミウム染色された無傷の筋肉をμCTでイメージングしたところ、IMATの空間パターンが脱細胞化によって破壊されないことが確認されました。さらに、IMATが無視できる脱細胞化筋肉における筋肉内トリグリセリドの定量は、無傷の筋肉値の~5%であり、IMCLの除去が確認されました。したがって、この方法論は、半透明の筋肉マトリックスを介して元の解剖学的分布でIMAT脂質滴を保持します。
適切な脱細胞化は、このプロトコルの最も重要なステップです。脱細胞化が不完全な場合、IMAT脂質滴の可視化が困難になり、残存IMCLによりOROまたはBODIPYのいずれかで高いバックグラウンド染色が発生します(図2)。経験の浅いユーザーによる一般的なエラーは、各筋肉がSDS溶液で完全に覆われていない、脱細胞化中に溶液を攪拌するためにロッカーを使用しない、溶液交換を十分に頻繁に行わないなど、筋肉あたり(各ウェル内)のSDSカバレッジが不十分であることです。この原稿では、単位筋肉量あたりに必要なSDSの量を推奨していますが、各筋肉には固有の形状があるため、ユーザーは筋肉が溶液で完全に覆われていることを確認する必要があります。また、脱細胞化を確実に完了させるために、溶液を自由に(1日2回も)交換することをお勧めします。IMAT脂質滴の良質な染色は、4日間ものSDS処理後に達成されています。高品質のORO染色結果を得るには、適切な固定とORO溶液の調製も重要です。上記のSDS治療と同様に、各筋肉サンプルに3.7%ホルムアルデヒド溶液の適切なカバレッジが必要です。筋肉を固定液から取り除くのが早すぎると、脂質滴はOROで弱く染色されるだけです。合計1〜2時間で十分ですが、固定剤が筋肉の中心に浸透し、すべての脂質滴を完全に固定するために、一晩固定することをお勧めします。ORO染色のさらなる課題は、アルコール濃度が60%に低下すると、微粒子が形成され始めることです。この微粒子は表面に沈殿し、筋肉の境界に詰まる可能性があります。これを回避する最善の方法は、染色ごとに新しいワーキング溶液を作成し、40メッシュμmと0.22μmの両方のフィルターを使用することです。次に、ロッカーによる攪拌を維持し、染色時間を10分に制限することで、形成された微粒子が沈降するのを防ぐことができます。問題が解決しない場合は、新しいOROストックソリューションを作成すると役立つ場合があります。脱細胞化した筋肉表面に何らかのアーチファクトが付着したままの場合は、実体顕微鏡、鉗子、および外科用ハサミを使用して、このアーチファクトを除去することができます。アーチファクトを除去できないと、筋肉の画質に影響を与え、OD読み取りに備えた脂質抽出部分のIMAT含有量を過大評価します。
全体として、この手法は単純であり、骨格筋脂肪浸潤を視覚化および定量化するためのゴールドスタンダードの方法よりもいくつかの利点があります。CT、MRI、USなどの非侵襲的技術は、ヒトや時には動物モデルで広く使用されていますが、空間分解能が限られており、脂質滴と筋線維を区別することができません。したがって、中間信号強度のピクセルまたはボクセルは「筋肉」または「脂肪」として割り当てられますが、実際には筋線維と脂肪細胞の混合物である可能性があります。より一般的には、動物の筋肉への脂肪浸潤は組織学によって評価され、最も頻繁には筋肉凍結切剖のOROによって評価されます。ただし、これは通常、単一の代表的な切片でのみ実行され、切片全体に脂質が散乱するため定量化が困難です。対照的に、脱細胞化筋肉全体のORO染色は、無傷の形態と同様のコストと労力でIMATの包括的な評価を提供します。さらに、脱細胞化のORO染色は、可視化を強化するだけでなく、脂質抽出による脂肪浸潤の定量化を可能にします。脂肪浸潤の特徴をより深く掘り下げるには、蛍光染色剤であるBODIPYを共焦点顕微鏡と組み合わせて使用できます。これにより、個々のIMAT脂質滴を再構築して3Dランドスケープをマッピングすることができますが、これは筋肉の長さにわたって切片を分析しない限り、組織学では不可能です。共焦点顕微鏡は標準的な実験装置ではありませんが、小動物MRIやCTよりも大学や産業界で利用しやすい可能性が高くなります。さらに、このプロセスの多くは自動化できるため、シーケンシャル組織学と比較して時間コストが削減されます。共焦点顕微鏡の設定を最適化することは、BODIPY染色のための追加の考慮事項です。これらは各顕微鏡に固有です。臨界値はレーザー強度であり、これは筋肉の遠方表面の脂質滴を検出するのに十分な高さであると同時に、手前の脂質滴からの信号を飽和させないようにする必要があります。このため、共焦点顕微鏡によるBODIPY染色の使用は、EDLや横隔膜などの薄い筋肉に最も適していることが示唆されています。
このアプローチにはいくつかの制限があります。第一に、この技術は、ここで紹介したマウスの傷害モデル(心電毒素とグリセロール)を超えて幅広い適用性を持つと予想されますが、筋肉のサイズと組成(線維化など)が脱細胞化に影響を与える可能性があり、SDS濃度またはインキュベーション時間の増加が必要になるため、新しいアプリケーション(mdxモデルなど)には最適化が必要になる可能性があります。筋肉量が変化した他の疾患モデルでは、脂肪浸潤の絶対値と正規化された(筋肉量に対する)指標の両方を分析して、脂質の絶対量または筋肉体積に対する脂質の割合を決定し、より意味のある結果指標を提供する必要があります。さらに、この技術は、より大きな動物モデルやヒト生検に広く適用できると予想されますが、これには新しいアプリケーションごとに最適化が必要な場合があります。第二に、この戦略では、筋肉全体をこのアッセイ専用にする必要があり、別の病理学的特徴を評価するために使用することはできません。IMATの経時的変化を評価することを目的とした研究は、非侵襲的イメージング技術により適しており、他の目的(組織学、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ウェスタンブロッティング)のために筋肉を必要とする研究は、凍結した筋肉の残りの部分を他のアッセイに割り当てることができるため、組織学的評価によってより適切に提供されます。しかし、このアッセイは、トレッドミルランニングやex vivo収縮試験などのin vivo試験と組み合わせるのに適しているが、これは脱細胞化の前にこれらの測定を行うことができるからである44。第三に、共焦点顕微鏡でBODIPY染色を用いると、脂質滴の高分解能の可視化と定量が可能になりますが、細胞膜が除去され、内因性脂肪細胞タンパク質が失われるため、脂質滴を個々の脂肪細胞として決定的に識別することはできません。未熟な脂肪細胞または「茶色/ベージュ」の表現型を表す多房状脂肪細胞は、複数の脂質滴として識別できます。最後に、このプロトコルは、以前に凍結した筋肉ではうまく機能しません。生検全体は脱細胞化できますが、生検におけるIMATの空間分布は組織学的スライスよりも筋肉全体を代表している可能性は低いため、これらの制限はおそらくヒト生検で最も深刻です。しかし、この技術は凍結されていない生検の取り扱い条件(例えば、PBSの氷上での数時間)に比較的影響を受けにくいため、生検を後でさまざまなアッセイに分割することができ、脱細胞化のための部分を含む、個々の脂質滴のより良い分離を提供することができます。
結論として、骨格筋脂肪浸潤の定性的および定量的分析のための新しい方法が、脱細胞化構築物の保持脂質を染色およびイメージングすることによって開発されました。この方法論は、筋肉内の3次元脂肪浸潤の包括的なイメージングと、ORO染色による迅速で安価な定量を可能にするという点で、ゴールドスタンダードのアプローチよりも優れています。より詳細な測定については、2つ目の脂溶性BODIPY染色剤により、共焦点顕微鏡で画像化された脂質滴の数、体積、および分布パターンをより詳細に定量できます。これらの測定を組み合わせることで、研究者は、サンプリングや高価な非侵襲的イメージングを行うことなく、個々の脂質滴のレベルで骨格筋脂肪浸潤を正確に測定する方法を得ることができます。
Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、R01AR075773 to GAMの支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
| 1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| 12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
| 12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
| 37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
| 40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
| 6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
| Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
| ImageJ | NIH | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
| Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |
References
- Delmonico, M. J., et al. Longitudinal study of muscle strength, quality, and adipose tissue infiltration. The American Journal of Clinical Nutrition. 90 (6), 1579-1585 (2009).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
- Freda, P. U., et al. Lower visceral and subcutaneous but higher intermuscular adipose tissue depots in patients with growth hormone and insulin-like growth factor I excess due to acromegaly. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 93 (6), 2334-2343 (2008).
- Garg, A., Peshock, R. M., Fleckenstein, J. L. Adipose tissue distribution pattern in patients with familial partial lipodystrophy (Dunnigan variety). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84 (1), 170-174 (1999).
- Gorgey, A. S., Dudley, G. A. Skeletal muscle atrophy and increased intramuscular fat after incomplete spinal cord injury. Spinal Cord. 45 (4), 304-309 (2007).
- Goutallier, D., Postel, J. M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre- and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. (304), 78-83 (1994).
- Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
- Elder, C. P., Apple, D. F., Bickel, C. S., Meyer, R. A., Dudley, G. A. Intramuscular fat and glucose tolerance after spinal cord injury-a cross-sectional study. Spinal Cord. 42 (12), 711-716 (2004).
- Albu, J. B., et al. Independent association of insulin resistance with larger amounts of intermuscular adipose tissue and a greater acute insulin response to glucose in African American than in white nondiabetic women. The American Journal of Clinical Nutrition. 82 (6), 1210-1217 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Mueller, M. J. Intermuscular adipose tissue is muscle specific and associated with poor functional performance. Journal of Aging Research. 2012, 172957 (2012).
- Gerber, C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., Meyer, D. C. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16 (6), 691-696 (2007).
- Hilton, T. N., Tuttle, L. J., Bohnert, K. L., Mueller, M. J., Sinacore, D. R. Excessive adipose tissue infiltration in skeletal muscle in individuals with obesity, diabetes mellitus, and peripheral neuropathy: association with performance and function. Physical Therapy. 88 (11), 1336-1344 (2008).
- Gaeta, M., et al. Muscle fat-fraction and mapping in Duchenne muscular dystrophy: evaluation of disease distribution and correlation with clinical assessments. Preliminary experience. Skeletal Radiology. 41 (8), 955-961 (2012).
- Buford, T. W., et al. Age-related differences in lower extremity tissue compartments and associations with physical function in older adults. Experimental Gerontology. 47 (1), 38-44 (2012).
- Addona, J., et al. Estimating 3D supraspinatus intramuscular fatty infiltration in older adults: a pilot study. Acta Radiologica. , 2841851221139597 (2022).
- Crook, J., et al. Comparison of multifidus muscle intramuscular fat by ultrasound echo intensity and fat-water based MR images in individuals with chronic low back pain. Musculoskeletal Science & Practice. 63, 102717 (2023).
- Lee, C., et al. Beige FAPs transplantation improves muscle quality and shoulder function after massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 1159-1166 (2020).
- Lee, C., et al. Beige fibro-adipogenic progenitor transplantation reduces muscle degeneration and improves function in a mouse model of delayed repair of rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 29 (4), 719-727 (2020).
- Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
- Overend, T. J., Cunningham, D. A., Paterson, D. H., Lefcoe, M. S. Thigh composition in young and elderly men determined by computed tomography. Clinical Physiology. 12 (6), 629-640 (1992).
- Li, W., et al. Progression and variation of fatty infiltration of the thigh muscles in Duchenne muscular dystrophy, a muscle magnetic resonance imaging study. Neuromuscular Disorders. 25 (5), 375-380 (2015).
- Davis, D. L., et al. Supraspinatus fatty infiltration on MRI among older adults receiving physical therapy as initial management for clinically suspected rotator cuff tear: A pilot study. Journal of Clinical Imaging Science. 12, 66 (2022).
- Salaffi, F., et al. Ultrasound and magnetic resonance imaging as diagnostic tools for sarcopenia in immune-mediated rheumatic diseases (IMRDs). La Radiologia Medica. 127 (11), 1277-1291 (2022).
- Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: a novel depot similar in size to visceral adipose tissue. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (4), 903-910 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Cade, W. T., Mueller, M. J. Lower physical activity is associated with higher intermuscular adipose tissue in people with type 2 diabetes and peripheral neuropathy. Physical Therapy. 91 (6), 923-930 (2011).
- Matsumura, N., et al. Quantitative assessment of fatty infiltration and muscle volume of the rotator cuff muscles using 3-dimensional 2-point Dixon magnetic resonance imaging. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 26 (10), 309-318 (2017).
- Cheuy, V. A., Hastings, M. K., Commean, P. K., Ward, S. R., Mueller, M. J. Intrinsic foot muscle deterioration is associated with metatarsophalangeal joint angle in people with diabetes and neuropathy. Clinical Biomechanics. 28 (9-10), 1055-1060 (2013).
- Samagh, S. P., et al. MRI quantification of fatty infiltration and muscle atrophy in a mouse model of rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 31 (3), 421-426 (2013).
- Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: an experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
- Goodpaster, B. H., Kelley, D. E., Thaete, F. L., He, J., Ross, R. Skeletal muscle attenuation determined by computed tomography is associated with skeletal muscle lipid content. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 104-110 (2000).
- Torriani, M., et al. Lower leg muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MR imaging and spectroscopy study. Skeletal Radiology. 41 (4), 437-445 (2012).
- Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
- Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (13), 2270-2278 (2010).
- Li, B., et al. Skeletal muscle respiratory uncoupling prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Medicine. 6 (10), 1115-1120 (2000).
- Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
- Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), 1 (2017).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), 50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Ungerleider, J. L., Johnson, T. D., Rao, N., Christman, K. L. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).
- Biltz, N. K., et al. Infiltration of intramuscular adipose tissue impairs skeletal muscle contraction. The Journal of Physiology. 598 (13), 2669-2683 (2020).
