Summary
Den aktuella studien beskriver decellulariseringsbaserade metoder för att visualisera och kvantifiera intramuskulär fettvävnadsdeponering (IMAT) genom intakt muskelvolym, samt kvantifiera mätvärden för enskilda adipocyter som utgör IMAT.
Abstract
Fettinfiltration är ansamling av adipocyter mellan myofibrer i skelettmuskulaturen och är ett framträdande inslag i många myopatier, metaboliska störningar och dystrofier. Kliniskt i mänskliga populationer utvärderas fettinfiltration med hjälp av icke-invasiva metoder, inklusive datortomografi (CT), magnetisk resonanstomografi (MRT) och ultraljud (US). Även om vissa studier har använt CT eller MRT för att kvantifiera fettinfiltration i musmuskler, är kostnader och otillräcklig rumslig upplösning fortfarande utmanande. Andra smådjursmetoder använder histologi för att visualisera enskilda adipocyter; Denna metod lider dock av urvalsbias i heterogen patologi. Detta protokoll beskriver metodiken för att kvalitativt se och kvantitativt mäta fettinfiltration heltäckande i intakt musmuskel och på nivån av enskilda adipocyter med hjälp av decellularisering. Protokollet är inte begränsat till specifika muskler eller specifika arter och kan utvidgas till mänsklig biopsi. Dessutom kan kvalitativa och kvantitativa bruttobedömningar göras med standardlaboratorieutrustning till låg kostnad, vilket gör denna procedur mer tillgänglig i forskningslaboratorier.
Introduction
Ackumuleringen av adipocyter mellan myofibrer i skelettmuskulaturen är ett framträdande inslag i olika tillstånd, från typ 2-diabetes till sarkopeni till muskuloskeletal skada 1,2,3,4,5,6,7. Omfattande bedömning av denna intramuskulära fettvävnad (IMAT) är avgörande för att förstå patogenesen av dessa tillstånd, eftersom IMAT-deponering är starkt korrelerad med insulinresistens 3,8,9,10 och dålig skelettmuskelfunktion 11,12,13,14,15 . Även om dessa samband har noterats i årtionden är mekanismerna i samband med och ursprunget till IMAT fortfarande ett område som är föremål för intensiv forskning. Detta beror delvis på att de flesta studier som utvärderar fettinfiltration i skelettmuskulaturen har utförts på människor, där mekanistiska undersökningar är begränsade16,17. Men på senare tid har smådjursmodeller, inklusive möss, använts för att hjälpa till att fastställa cellulär reglering av IMAT-utveckling och signalering18,19,20. Detta arbete syftar till att tillhandahålla ett nytt verktyg för användning med smådjursmodeller för att kvalitativt visualisera och kvantifiera skelettmuskelfettinfiltration.
Kliniskt i mänskliga populationer utvärderas fettinfiltration med hjälp av icke-invasiva metoder, inklusive datortomografi (CT)6,21, magnetisk resonanstomografi (MRT)16,17,22,23 och ultraljud (US)17,24. Dessa avbildningstekniker identifierar vanligtvis ett definierat intresseområde (ROI) i en muskel och samlar in bildskivor inom den regionen, även om omfattande tillvägagångssätt också har använts25,26,27. Dessa bildsegment utsätts för kvalitativ gradering6 och kvantifieras via pixeltrösklar28. Liknande tillvägagångssätt har använts på djur tidigare29,30; De är dock dyra och kräver tillgång till avbildningssystem för smådjur. Rumslig upplösning via CT- och MRT-användning utgör också ett stort problem, eftersom de inte kan avgränsa IMAT-adipocyter från skelettmuskelfibrer i en voxel och istället förlitar sig på subjektiv separation av främst muskelregioner och främst IMAT-regioner31,32. Oförmågan att exakt identifiera fett- eller muskelvävnad innebär också en felaktig kvantifiering av representativa mängder av dessa vävnader.
På grund av dessa begränsningar förlitar sig nuvarande tekniker för att bedöma skelettmuskelfettinfiltration i smådjursmodeller oftast på histologi som ett billigt och tillgängligt alternativ33,34. Standardfärgningsprocedurer, inklusive hematoxylin och eosin (H&E), oljeröd O (ORO) och immunfärgning för adipocytmarkörer såsom perilipin, möjliggör enkel detektion och visualisering av adipocyter som består av fettinfiltration i muskeln. Histologiska metoder är dock sällan heltäckande, och vanligtvis är IMAT:s kvalitativa eller kvantitativa bedömning begränsad till ett enda avsnitt34. Lipidextraktion har också använts för att kvantifiera totala muskellipider35; Denna teknik misslyckas dock med att skilja mellan intramyocellulära lipider (IMCL) och intramuskulär fettvävnad (IMAT)36. Sammanfattningsvis är nuvarande metoder för att visualisera och kvantifiera fett i muskler fortfarande begränsade antingen av ekonomiska kostnader eller den specifika detektionen av IMAT.
Här beskriver vi en detaljerad metod för att bedöma skelettmuskulaturfettinfiltration både genom kvalitativ visualisering och flerskalig kvantifiering. Denna metod använder en enkel decellulariseringsteknik som tar bort myocellulära strukturer, inklusive IMCL, men håller de större IMAT-fettcellshärledda lipiddropparna intakta. Validering av specificiteten hos denna teknik har publicerats37, inklusive användning av lipidextraktion för att visa utarmningen av IMCL med decellularisering, μCT för att visa bibehållandet av IMAT-mönster med decellularisering, och histologi för att visa den liknande storleksfördelningen av IMAT-lipiddroppar jämfört med de som identifierats med decellularisering. När musklerna har decellulariserats kan de färgas med lipidlösliga färgämnen för kvalitativ visualisering av mönstret och omfattningen av fettinfiltration och/eller kvantitativ avbildning av enskilda IMAT-lipiddroppar. Färgämnen kan därefter extraheras med isopropanol, och den optiska densiteten (OD) för den resulterande lösningen kan användas för att uppskatta IMAT-lipidvolymen. Den stränga valideringen av denna teknik har publicerats på annan plats37. Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för att använda den här metoden med musmuskler och ger felsökningstips för att stödja implementeringen av den här metoden i andra tillämpningar, till exempel muskler från andra arter eller andra vävnader.
Protocol
Skötseln och avlivningen av möss utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide for the Use and Care of Laboratory Animals. Allt arbete godkändes av Animal Studies Committee vid Washington University i St. Louis School of Medicine. C57BL/6J-hanmöss i åldern 2-3 månader (se Materialförteckning) användes för att generera exempelbilderna som ingår i detta protokoll. Alla steg som beskrivs nedan utförs vid rumstemperatur.
1. Decellularisering av muskler
- Bered en 1% w/v natriumdodecylsulfat (SDS; se materialtabell) lösning i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Rör om lösningen tills den är helt blandad.
OBS: 1 % säkerhetsdatablad kan beredas i bulk och förvaras i rumstemperatur i 1 månad. - Dissekera muskeln/musklerna av intresse som beskrivits tidigare38,39.
- Exponera de muskler du är intresserad av genom att fukta håret och huden med 70 % etanollösning, gör sedan ett transkutant snitt på cirka 2 cm följt av att ta bort den täckande huden med tång och fjädersax.
OBS: De muskler som är av intresse här inkluderar tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL) och diafragma. Vissa muskler kan ligga djupt i en annan muskulatur, vilket kräver dissektion av andra muskler (t.ex. kräver dissekering av EDL avlägsnande av TA). - Dissekera muskeln/musklerna av intresse med en vass sax eller blad (se materialtabell) för att säkerställa att hela muskelns utsträckning erhålls och att kanterna är släta.
OBS: Detta görs helst under ett dissekerande mikroskop för att förbättra visualiseringen. - Inspektera musklerna för att säkerställa att inga benflisor eller trasiga kanter ingår, klipp sedan bort dessa med en vass sax efter behov.
- Väg muskeln med hjälp av en analysvåg och registrera vikten.
- Exponera de muskler du är intresserad av genom att fukta håret och huden med 70 % etanollösning, gör sedan ett transkutant snitt på cirka 2 cm följt av att ta bort den täckande huden med tång och fjädersax.
- Placera den dissekerade muskeln i minst 0,1 ml 1% SDS per milligram vikt; 6-, 12- eller 24-brunnsplattor fungerar bra för diafragma-, TA- respektive EDL-musmusklerna. Typiska volymer är 6 ml, 3 ml och 1,5 ml för 6-, 12- respektive 24-hålsplattor.
OBS: SDS-lösningen kommer ibland att få musklerna att deformeras, så se till att muskeln är platt/utsträckt vid första nedsänkningen. - Placera brunnsplattan (eller andra kärl) på en gungande shaker inställd på 50-80 Hz.
- Inspektera SDS-lösningen visuellt med jämna mellanrum. När lösningen blir grumlig, ta bort lösningen med en pipett (var noga med att inte aspirera muskeln) och ersätt den med en lika stor volym färsk 1% SDS. När lösningen förblir klar i 24 timmar är decellulariseringen klar.
OBS: Frekvensen som krävs för lösningsbyten varierar beroende på muskelstorlek och den initiala lösningsvolymen. Större muskler som TA behöver nytt SDS inom några timmar, och mindre muskler som EDL kan gå över natten i den ursprungliga lösningen. - Ta bort den slutliga SDS-lösningen från de decellulariserade musklerna med en pipett (var noga med att inte aspirera muskeln) och ersätt den med en lika stor volym PBS.
- Inspektera visuellt de decellulariserade musklerna under ett dissekerande mikroskop och använd pincett och sax för att ta bort hår eller skräp som har fastnat på muskeln.
OBS: Notera också tydligheten i den decellulariserade muskeln i detta steg. Om den decellulariserade muskeln inte är helt transparent och SDS-lösningen inte ökar i grumlighet under 24 timmar, var decellulariseringen inte effektiv. Detta skapar en artefakt i kvalitativa och kvantitativa bedömningar, och därför bör decellularisering alltid optimeras på övningsprover innan man fortsätter med experimentella muskler. - Ta försiktigt bort PBS, ersätt den med en lika stor volym av 3.7 % formaldehyd eller 4 % paraformaldehydlösning och sätt tillbaka plattan i gungshakern i 24 timmar.
OBS: Se till att formaldehydlösningen helt täcker den decellulariserade muskeln, annars blir färgningen ojämn.
2. Visualisering av IMAT med oljeröd O
- Bered en lösning av ORO.
- Lös upp 0,5 g ORO-pulver (se materialförteckning) i 100 ml isopropanol för att generera en stamlösning.
OBS: Tillsätt mild värme till lösningen för att lösa upp den helt. Detta lager kan förvaras i rumstemperatur i 1 månad. - Kombinera ORO-stamlösningen och avjoniserat vatten i förhållandet 60:40 för att erhålla den arbetslösning som behövs för alla muskler med en volym på minst 0,1 ml/mg muskelvikt. Typiska volymer är 6 ml, 3 ml och 1,5 ml för 6-, 12- respektive 24-hålsplattor.
OBS: Inspektera stamlösningen före blandning. Om stamlösningen innehåller betydande partiklar, gör ny stam. - Täck över arbetslösningen i 10 minuter så att partiklarna kan sätta sig.
- Filtrera arbetslösningen genom ett 40 μm nät, följt av ett 0,22 μm sprutfilter.
OBS: Sprutfiltret på 0,22 μm täpps till snabbt och måste bytas ut om arbetslösningen inte trycks igenom lätt.
- Lös upp 0,5 g ORO-pulver (se materialförteckning) i 100 ml isopropanol för att generera en stamlösning.
- Ta bort formaldehyden eller paraformaldehydlösningen och tvätta de decellulariserade musklerna med tre lösningsbyten av en lika stor volym PBS.
- Ersätt PBS med en lika stor volym 60 % isopropanollösning och inkubera på en gungande shaker i 5 minuter.
- Byt ut 60 % isopropanollösningen mot ORO-arbetslösningen och inkubera på gungshakern i 10 minuter.
OBS: Se till att ORO-arbetslösningen helt täcker den decellulariserade muskeln, annars blir färgningen ojämn. - Byt ut ORO-arbetslösningen mot en lika stor volym av 1 % SDS. Inspektera SDS-lösningen visuellt med jämna mellanrum. När lösningen blir märkbart rosa, ta bort lösningen med en pipett (var noga med att inte aspirera muskeln) och ersätt den med färsk 1% SDS.
- När lösningen förblir klar i 24 timmar, byt ut 1 % SDS mot PBS och inspektera den färgade muskeln under ett dissektions-/stereomikroskop vid 4x förstoring. Ta bort allt uppenbart skräp eller partiklar som fastnat på utsidan av muskeln. Om detta är omfattande kan den decellulariserade muskeln rullas försiktigt på en rengöringsduk för att dra bort skräpet/partiklarna.
- Om färgningen är tillfredsställande (ljusröda sfärer som flyter i en transparent matris), ta bilder av färgningen efter önskemål med hjälp av en kamera fäst på stereomikroskopet (se materialförteckning).
OBS: Om dissektionsmikroskopet inte har en ansluten kamera kan en telefonkamera användas för att ta bilder genom okularet.
3. Visualisering av IMAT-lipiddroppar med BODIPY
OBS: Konfokal avbildning är mest effektiv med tunna muskler som EDL eller diafragma (~2 mm tjocklek). Alternativt kan remsor av jämförbar tjocklek på muskler som TA användas.
- Bered en 1:200 lösning av fluorescerande BODIPY 493/503 (se materialtabell) i PBS för att erhålla en arbetslösningsvolym på minst 0.1 ml/mg muskelvikt. Typiska volymer är 6 ml, 3 ml och 1,5 ml för 6-, 12- respektive 24-hålsplattor.
- Ta bort formaldehyd, paraformaldehyd eller 1% SDS och tvätta de decellulariserade musklerna med tre lösningsbyten av en lika stor volym PBS.
- Byt ut PBS mot BODIPY-arbetslösningen och inkubera på gungshakern i 20 minuter.
- Tvätta de decellulariserade musklerna med tre lösningsbyten av en lika stor volym PBS.
- Placera muskeln i ett genomskinligt kärl som är kompatibelt med ett tillgängligt konfokalmikroskop. Helst ska skålen ha en försänkt botten för att placera ett täckglas över muskeln utan att deformera den (se materialtabell).
- Skaffa bildstaplar med ett vanligt konfokalmikroskop (se materialförteckning) med hjälp av 488-lasern. Typiska skivstorlekar för en EDL är 0,5–1 mm med en skivtjocklek på 10 μm, vilket ger 50–100 bilder per stapel.
OBS: För att kvantifiera den totala lipidvolymen, det totala antalet IMAT-lipiddroppar och närmaste grannindex för klustring, avbilda genom hela muskelvolymen, var noga med att lämna en viss överlappning för bildregistrering. För att kvantifiera den genomsnittliga lipiddroppsvolymen kan det räcka med en stapel. - Om så önskas, färga musklerna med ORO, enligt avsnitt 2, för en kompletterande bild av IMAT-distributionen av hela musklerna.
OBS: Eftersom BODIPY är fluorescerande kommer det inte att synas under ljusmikroskopet när bilder av ORO tas.
4. Uppskattning av total lipidvolym genom lipidextraktion
- Efter bildtagning överförs musklerna till 200 μl isopropanol i enskilda brunnar på en 96-hålsplatta, eller anpassa brunnen/volymen om muskeln är för stor för att passa.
- Rör om lösningen genom att knacka på plattan, pipettera lösningen upp och ner och/eller mekaniskt krossa muskeln med en pipettspets tills inga röda/fluorescerande sfärer kan ses i den decellulariserade muskeln under ett mikroskop.
OBS: Behandla alla muskler med samma kombination av knackning, pipettering och krossning för bästa tillförlitlighet. Var också noga med att begränsa den tid som går åt till att tappa, pipettera och krossa, eftersom isopropanolet kommer att avdunsta snabbt. - Blanda lösningen i varje brunn genom att pipettera upp och ner och överför sedan 75 μL till två rena brunnar på plattan.
- Täck över plattan och läs av absorbansen hos de dubbla 75 μl-brunnarna med hjälp av en spektrofotometer eller plattläsare. Om konstruktionen färgades med ORO, läs lösningen vid 500 nm; om den var färgad med BODIPY 493/503, läs av plattan vid 493 nm.
OBS: Om konstruktionen färgades med både BODIPY och ORO, rekommenderas att läsa av plattan vid 500 nm, eftersom 500 nm-avläsningar ger liknande resultat mellan konstruktioner som endast färgats med ORO och ORO plus BODIPY. - Dela absorbansavläsningen med muskelns registrerade vikt om så önskas för att korrigera för storleksskillnader mellan samples.
5. Kvantifiering av IMAT-lipiddroppsmått från konfokala bilder
OBS: Detta avsnitt kräver åtkomst till ImageJ version 1.47 (se Materialförteckning) eller senare och grundläggande ImageJ-kunskaper40.
- Öppna konfokala staplar i ImageJ.
OBS: Olika konfokalmikroskop kan spara konfokala bilder i olika format. ImageJ kan kräva ytterligare ett plugin eller en variant, till exempel Fiji, för att öppna stackarna41. Algoritmerna som används är en del av programvarupaketet ImageJ. - Kör en tröskelalgoritm i ImageJ för att identifiera BODIPY-positiva pixlar. Detta konverterar den aktuella bilden till en binär bild.
- Öppna användargränssnittet för tröskelvärdet genom att välja Bild > Justera > tröskelvärde. I användargränssnittet väljer du Intermodes som tröskeltyp och ser till att mörk bakgrund är markerad. Inga andra alternativ behöver väljas. Klicka sedan på Apply.
- En dialogruta öppnas för att konvertera stacken till binär. Se till att den har följande alternativ valda: Metod: Intermodes; Bakgrund: Mörk. Beräkna tröskelvärdet för varje bild och svart bakgrund (för binära masker). Detta genererar en binär stack, där vitt indikerar BODIPY positiva pixlar och svart indikerar BODIPY negativa pixlar.
OBS: Tröskelalgoritmen för interlägen kanske inte är det bästa valet för alla användare. Subjektiv inspektion av de inbyggda tröskelalternativen i ImageJ hjälper till att välja den optimala algoritmen för att separera BODIPY positiva och negativa pixlar.
- Kör Watershed-algoritmen i ImageJ för att separera vidrörande lipiddroppar. Välj Process > binär > vattendelare. En dialogruta öppnas där du tillfrågas om alla bilder i stapeln ska bearbetas. Välj Ja. Detta lägger till tunna svarta linjer som delar större områden av helvitt.
- Identifiera ROI:er med algoritmen Analysera partiklar i ImageJ.
- Välj Analysera > Analysera partiklar. En dialogruta öppnas där du kan ange urvalsinställningarna.
OBS: Att välja storleksintervall är avgörande för att uppnå den bästa uppskattningen av lipiddropparnas ROI. Den nedre gränsen eliminerar regioner som sannolikt är för små för att vara IMAT-härledda lipiddroppar (bakgrundsartefakt), och den övre gränsen eliminerar regioner som sannolikt är för stora för att vara enstaka IMAT-härledda lipiddroppar (rörande lipiddroppar som inte separerades av Watershed-algoritmen). - Om du vill ställa in dessa värden öppnar du originalbilden och markerar den minsta och största lipiddroppen i vyn med hjälp av ovalverktyget. Lägg sedan till dessa former i ROI-hanteraren genom att skriva "t". Välj Analysera och sedan Ange mått. En dialogruta öppnas för val av inställningar.
- Markera endast område och klicka på OK. Välj sedan Mät från ROI Manager. Använd de två ytmåtten från det här resultatfönstret som storleksintervall i Analysera partiklar.
- Se till att Lägg till i chef är markerat. Inga andra alternativ behövs.
- Välj Analysera > Analysera partiklar. En dialogruta öppnas där du kan ange urvalsinställningarna.
- Lägg över ROI:erna i den konfokala stacken genom att markera Visa alla i ROI-hanteraren. Använd skjutreglaget för att inspektera varje stapelsegment individuellt och lägga till saknade områden för hand med hjälp av ovalverktyget (finns i verktygsfältet ImageJ).
- Mata ut ROI-mätningarna. Välj Analysera > Ställ in mått och välj Area, Centroid, Anpassa ellips och Stapelposition. Klicka på OK. Välj sedan Mät från ROI Manager. Datan i resultattabellen kan väljas ut och kopieras till Matlab eller Excel för vidare analys.
- Förfina ROI:erna i varje stack till en enda ROI med hjälp av Refine.m Matlab-kod37 eller en liknande algoritm.
OBS: Detta steg krävs eftersom steg 5.2-5.4 identifierar samma lipiddroppe i intilliggande skivor som distinkta ROI. ROI:er kan dock alternativt identifieras endast för hand, eller så kan dubbletter av ROI:er elimineras för hand i ImageJ för att undvika behovet av Matlab. - Hämta den sammanfattande statistiken i ROI med hjälp av Matlab eller Excel.
- Uppskatta det totala antalet lipiddroppar som det totala antalet ROI.
- Uppskatta lipiddroppens volym som ellipsens volym som är anpassad till varje 2D ROI, förutsatt att formens djup är medelvärdet av ellipsens större och mindre axlar.
- Uppskatta den totala lipidvolymen, som är summan av individuella uppskattade lipiddroppsvolymer.
Representative Results
Kvalitativ visualisering av fettinfiltration i skelettmuskulaturen
Korrekt decellulariserade muskler är vita och halvgenomskinliga (avsnitt 1; Figur 1). När decellulariserade muskler färgas med ORO för att visualisera IMAT (avsnitt 2), är IMAT-lipiddroppar synliga i de tydliga muskelstrukturerna som röda sfärer (Figur 1). Friska bakbensmuskler hos möss har liten naturlig IMAT, vilket framgår av liten eller ingen röd, ORO-positiv lipid (Figur 1A). Som jämförelse kan nämnas att bakbensmuskler som injiceras med kardiotoxin (CTX; Figur 1B) eller glycerol (GLY; Figur 1C) 14 dagar före decellularisering har en ökad ackumulering av IMAT, med en högre koncentration av IMAT efter CTX jämfört med GLY som tidigare noterats37.
Ofullständig decellularisering kan identifieras omedelbart efter initial SDS-behandling eller efter urtvättning av ORO-färgningen som halvogenomskinliga, ljusrosa fibrer (Figur 2B jämfört med Figur 2A). Ofullständig rensning av ORO kan identifieras efter ORO-tvätt som en rosa eller röd enhetlig bakgrund, snarare än distinkta fiberlinjer (Figur 2C). Figur 2A,B innehåller också epimuskulärt fett (asterisker), en klump av lipiddroppar utanför den decellulariserade muskeln. Figur 2C visar också den muskelveckning som kan uppstå om musklerna inte sprids ut under decellulariseringen. Ofullständig decellularisering, ofullständig ORO-clearance och kvarvarande epimuskulärt fett ökar alla artificiellt (OD) av extraherad lipid, men hindrar inte nödvändigtvis kvalitativ bedömning av fettinfiltration om de erkänns som en artefakt.
Kvantitativ avbildning av fettinfiltration i skelettmuskulaturen
BODIPY fluorescerande märkta lipiddroppar kan avbildas via konfokalmikroskopi för en mer detaljerad bedömning av enskilda lipiddroppars mätvärden och fördelning (Figur 3). Denna process är halvautomatiserad, som tidigare beskrivits, inklusive Matlab-kod37. Bra BODIPY-färgning resulterar i ljusa elliptiska former som avgränsas från närliggande former när de avbildas i plan (figur 3A). Tröskelvärde och formsegmentering ger ett bra första pass för att generera ROI för varje lipiddroppe (figur 3B), men manuella redigeringar krävs för att korrigera fel. Det mest genomgripande felet är lipiddroppar som sitter djupt i vävnaden och därför inte lyser på några skivor (Figur 3B; rosa dubbelpilar). Detta kan åtgärdas genom att lägga till ROI för hand med hjälp av det ovala verktyget i ImageJ (Figur 3C). Den andra är att identifiera en grupp lipiddroppar som en enda ROI (Figur 3B; röd asterisk). Detta kan korrigeras genom att ta bort och ersätta den ursprungliga avkastningen med flera nya avkastningar (figur 3D). Slutligen identifieras en enda lipiddroppe som en unik ROI i flera skivor, så de duplicerade ROI:erna måste konsolideras till en enda ROI (Figur 3E; blå pil). Detta görs enklast med hjälp av ett databehandlingsverktyg som Matlab, men kan också göras för hand genom att identifiera den största ROI och ta bort resten. Medelvärden för varje mätvärde i C57BL6/J- och 129Sv-musen finns i Biltz et al.37.
Figur 1: Exempel på oljeröd O (ORO) färgning av decellulariserade muskler. ORO-färgade muskler 14 dagar efter injektion med koksaltlösning (SAL), kardiotoxin (CTX) eller glycerol (GLY). Muskulaturerna extensor digitorum longus (EDL) och tibialis anterior (TA) har lite IMAT (röda sfärer) vid SAL-behandling (A), men ackumulerar IMAT som svar på CTX (B) och GLY (C) behandling. Det finns en fullständig decellularisering och ORO-tvätt, vilket framgår av distinkta ORO-positiva lipiddroppar i en genomskinlig vit muskelbakgrund. Skalstreck = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på dåliga ORO-färgningsresultat. Ofullständig decellularisering eller ofullständig ORO-rensning leder till en halvogenomskinlig rosa/röd bakgrund. Jämfört med den transparenta vita bakgrunden av helt decellulariserad musmembranmuskel (A), kännetecknas ofullständig decellularisering av ljusrosa/röda fiberspår (B), och ofullständig ORO-clearance kännetecknas av en diffus rosa/röd bakgrund (C). Skalstänger: övre paneler = 1 mm; Nedre paneler = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på identifiering av enskilda lipiddroppar med fluorescerande BODIPY-färgning och konfokalmikroskopi Enskilda BODIPY-färgade lipiddroppar kan identifieras och kvantifieras i decellulariserade muskler med hjälp av konfokalmikroskopi. Enskilda snitt genom en konfokal stapel visar lipiddroppar i plan som ljusgröna ellipser och lipiddroppar utanför plan som svagare former (A; blå pilar). Tröskelvärden i kombination med segmentering av avrinningsområden och ROI-identifiering kan kartlägga BODIPY-färgade ROI (B). Tröskeln kan missa några svagare lipiddroppar (B; rosa dubbelpil), vilket kräver identifiering för hand (C). Segmentering av avrinningsområden kan gruppera flera lipiddroppar tillsammans (B; röd asterisk), vilket kräver att ROI tas bort och omvärderas för hand (D). Samma lipiddroppe identifieras i flera skivor som kräver bildregistrering (E) för att ta bort de duplicerade ROI:erna. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Detta manuskript beskriver metoder för att kvalitativt visualisera och kvantifiera skelettmuskulaturfettinfiltration i smådjursmodeller som kan tillämpas för att ytterligare förstå patogenesen av intramuskulär fettvävsutveckling (IMAT) och patologisk expansion. Användningen av decellularisering av hela muskler och lipidlöslig färgning möjliggör en kostnadseffektiv, reproducerbar och enkel metod för att heltäckande bedöma förekomsten av IMAT i hela muskler.
Grunden för detta protokoll är att decellularisering av muskler med SDS tar bort de cellulära komponenterna i myofibrer, inklusive de små lipiddropparna av IMCL, men skonar de stora lipiddropparna i intramyocellulära adipocyter. SDS har använts i stor utsträckning42 inom vävnadsteknik för att decellularisera matriser. Vävnader som fett- och skelettmuskulatur kräver vanligtvis ytterligare mekanisk dissociation och/eller alkoholextraktion för att avlägsna den kvarvarande fettfettlipiden42,43. Vi har tidigare visat att detta beror på att medan decellularisering med SDS eliminerar IMCL, skonar det den stora lipiddroppen i adipocyter37. Avbildning av osmiumtetroxidfärgade intakta muskler före och efter decellularisering med μCT verifierade att det rumsliga mönstret av IMAT inte stördes av decellularisering. Vidare var intramuskulär triglyceridkvantifiering i en decellulariserad muskel med försumbar IMAT ~5 % av de intakta muskelvärdena, vilket verifierade avlägsnandet av IMCL. Därför behåller denna metod IMAT-lipiddroppar i sin ursprungliga anatomiska fördelning genom en halvtransparent muskelmatris.
Korrekt decellularisering är det mest kritiska steget i detta protokoll. Om decellulariseringen är ofullständig kommer IMAT-lipiddroppar att vara svåra att visualisera och kvarvarande IMCL kommer att orsaka hög bakgrundsfärgning med antingen ORO eller BODIPY (figur 2). Vanliga fel av oerfarna användare är otillräcklig SDS-täckning per muskel (inom varje brunn), så att varje muskel inte är helt täckt av SDS-lösning, att inte använda en vippa för att röra om lösningen under decellularisering och att inte utföra lösningsbyten tillräckligt ofta. I detta manuskript har vi rekommenderat mängden SDS som behövs per muskelenhet, men användaren kommer fortfarande att behöva se till att musklerna är helt täckta av lösningar, eftersom varje muskel har en unik geometri. Användare rekommenderas också att byta lösningar rikligt (så mycket som två gånger per dag) för att säkerställa att decellulariseringen är klar. Färgning av IMAT-lipiddroppar av god kvalitet har uppnåtts efter så många som 4 dagars SDS-behandling. För högkvalitativa ORO-färgningsresultat är det också viktigt med adekvat fixering och förberedelse av ORO-lösning. I likhet med SDS-behandlingen som beskrivs ovan krävs tillräcklig täckning av 3,7 % formaldehydlösning för varje muskelprov. Om muskeln avlägsnas från fixeringsmedlet för tidigt, kommer lipiddroppar endast att svagt färgas med ORO. Totalt 1-2 timmar bör räcka, men fixering över natten rekommenderas för att säkerställa att fixeringsmedlet tränger in i mitten av muskeln och fixerar alla lipiddroppar helt. En ytterligare utmaning med ORO-färgning är att när alkoholkoncentrationen sänks till 60 % börjar det bildas partiklar. Dessa partiklar kan lägga sig på ytan och fastna på gränsen till musklerna. Det bästa sättet att undvika detta är att göra en ny arbetslösning för varje färgning och använda både 40 mesh μm och 0,22 μm filter. Att sedan upprätthålla omrörning med vippan och begränsa färgningstiden till 10 minuter hjälper till att förhindra att partiklar som bildas sätter sig. Om problemet kvarstår kan det hjälpa att göra en ny ORO-lagerlösning. Om någon artefakt förblir fast på den decellulariserade muskelytan kan ett stereomikroskop, pincett och kirurgisk sax användas för att ta bort denna artefakt. Att misslyckas med att eliminera artefakter kommer att påverka musklernas bildkvalitet och överskatta IMAT-innehållet under lipidextraktionsdelen som förberedelse för OD-avläsning.
Sammantaget är denna teknik enkel och erbjuder flera fördelar jämfört med guldstandardmetoder för att visualisera och kvantifiera skelettmuskelfettinfiltration. Icke-invasiva tekniker, såsom CT, MRT och US, som används i stor utsträckning på människor och ibland i djurmodeller, har begränsad rumslig upplösning och kan inte skilja lipiddroppar från muskelfibrer. Således tilldelas en pixel eller voxel med mellanliggande signalintensitet som "muskel" eller "fett", medan det i själva verket sannolikt är en blandning av myofibrer och adipocyter. Vanligare är att fettinfiltration i djurmuskler bedöms genom histologi, oftast med ORO vid muskelkryosektioner. Detta utförs dock vanligtvis bara i en enda representativ sektion och är svår att kvantifiera på grund av lipidspridning över sektionen. Däremot ger ORO-färgning av en hel decellulariserad muskel en omfattande bedömning av IMAT med liknande kostnader och ansträngning som intakt morfologi. Dessutom, förutom att förbättra visualiseringen, möjliggör ORO-färgning av decellularisering kvantifiering av fettinfiltration genom lipidextraktion. För en djupare djupdykning i fettinfiltrationens egenskaper kan en fluorescerande färg, BODIPY, användas tillsammans med konfokalmikroskopi. Detta gör det möjligt att rekonstruera enskilda IMAT-lipiddroppar för att kartlägga 3D-landskapet, vilket inte är möjligt med histologi om inte snitt analyseras över muskelns längd. Även om ett konfokalmikroskop inte är standardutrustning för laboratorier, är det mer sannolikt att det är tillgängligt på ett universitet eller i en industrimiljö än MRT eller CT för små djur. Dessutom kan mycket av denna process automatiseras, vilket minskar tidskostnaden jämfört med sekventiell histologi. Att optimera inställningarna på konfokalmikroskopet är ytterligare ett övervägande för BODIPY-färgning. Dessa är unika för varje mikroskop. Det kritiska värdet är laserintensiteten, som måste vara tillräckligt hög för att detektera lipiddropparna på muskelns avlägsna yta samtidigt som signalen från lipiddropparna på den närmaste sidan inte mättas. På grund av detta föreslås det att användning av BODIPY-färgning med konfokalmikroskopi är bäst lämpad på tunnare muskler, inklusive EDL eller diafragma.
Flera begränsningar i detta tillvägagångssätt förtjänar att diskuteras. För det första, även om det förväntas att denna teknik har bred tillämplighet utöver skademodeller (kardiotoxin och glycerol) hos möss som presenteras här, kan nya tillämpningar (t.ex. mdx-modellen) kräva optimering, eftersom muskelns storlek och sammansättning (t.ex. fibros) kan påverka decellulariseringen, vilket kräver ökad SDS-koncentration eller inkubationstider. Andra sjukdomsmodeller med förändrad muskelmassa skulle också kräva analys av både absoluta och normaliserade (till muskelmassa) mått på fettinfiltration för att bestämma den absoluta mängden lipid eller procentandelen lipid i förhållande till muskelvolymen för att ge ett mer meningsfullt resultatmått. Dessutom förväntas denna teknik vara brett tillämplig på större djurmodeller och humana biopsier, men detta kan kräva optimering för varje ny applikation. För det andra, i denna strategi måste hela muskeln vara dedikerad till denna analys och kan inte användas för att bedöma en annan patologisk egenskap. Studier som syftar till att bedöma longitudinella förändringar i IMAT är bättre betjänta av icke-invasiva avbildningstekniker och studier vars primära syfte kräver muskeln för andra ändamål (histologi, kvantitativ polymeraskedjereaktion, western blotting) är bättre betjänta av histologisk bedömning, eftersom resten av den frysta muskeln kan allokeras till andra analyser. Denna analys är dock väl lämpad att para ihop med in vivo-testning, såsom löpbandslöpning, eller ex vivo kontraktil testning, eftersom dessa åtgärder kan göras före decellularisering44. För det tredje, även om användningen av BODIPY-färgning med konfokalmikroskopi ger högupplöst visualisering och kvantifiering av lipiddroppar, kan den inte slutgiltigt identifiera lipiddroppar som enskilda adipocyter, eftersom cellmembranet avlägsnas och endogena adipocytproteiner går förlorade. Multiloculära adipocyter, som representerar omogna adipocyter eller en "brun/beige" fenotyp, kan identifieras som multipla lipiddroppar. Slutligen fungerar protokollet inte bra på tidigare frusen muskel. Dessa begränsningar är förmodligen mest djupgående för humana biopsier, eftersom även om hela biopsin kan decellulariseras, är den rumsliga fördelningen av IMAT i biopsin sannolikt inte mer representativ för hela muskeln än en histologisk skiva. Men eftersom denna teknik är relativt okänslig för ofrysta biopsihanteringsförhållanden (t.ex. timmar på is i PBS), kan biopsin delas senare för olika analyser, inklusive en del för decellularisering, vilket skulle ge en bättre upplösning av enskilda lipiddroppar.
Sammanfattningsvis har en ny metod för kvalitativ och kvantitativ analys av fettinfiltration av skelettmuskulatur utvecklats genom färgning och avbildning av den kvarhållna lipiden i decellulariserade konstrukt. Denna metodik erbjuder förbättringar jämfört med standardmetoder, genom att den möjliggör omfattande avbildning av tredimensionell fettinfiltration i muskler och snabb, billig kvantifiering med ORO-färgning. För mer detaljerade mätningar ger en andra lipidlöslig BODIPY-fläck en mer detaljerad kvantifiering av lipiddropparnas antal, volym och distributionsmönster, som avbildas med konfokalmikroskopi. Tillsammans ger dessa mätningar forskare ett sätt att exakt mäta infiltration av skelettmuskulaturens fett på nivån av de enskilda lipiddropparna utan provtagning eller dyr icke-invasiv avbildning.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av R01AR075773 till GAM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
| 1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| 12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
| 12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
| 37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
| 40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
| 6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
| Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
| ImageJ | NIH | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
| Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |
References
- Delmonico, M. J., et al. Longitudinal study of muscle strength, quality, and adipose tissue infiltration. The American Journal of Clinical Nutrition. 90 (6), 1579-1585 (2009).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
- Freda, P. U., et al. Lower visceral and subcutaneous but higher intermuscular adipose tissue depots in patients with growth hormone and insulin-like growth factor I excess due to acromegaly. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 93 (6), 2334-2343 (2008).
- Garg, A., Peshock, R. M., Fleckenstein, J. L. Adipose tissue distribution pattern in patients with familial partial lipodystrophy (Dunnigan variety). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84 (1), 170-174 (1999).
- Gorgey, A. S., Dudley, G. A. Skeletal muscle atrophy and increased intramuscular fat after incomplete spinal cord injury. Spinal Cord. 45 (4), 304-309 (2007).
- Goutallier, D., Postel, J. M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre- and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. (304), 78-83 (1994).
- Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
- Elder, C. P., Apple, D. F., Bickel, C. S., Meyer, R. A., Dudley, G. A. Intramuscular fat and glucose tolerance after spinal cord injury-a cross-sectional study. Spinal Cord. 42 (12), 711-716 (2004).
- Albu, J. B., et al. Independent association of insulin resistance with larger amounts of intermuscular adipose tissue and a greater acute insulin response to glucose in African American than in white nondiabetic women. The American Journal of Clinical Nutrition. 82 (6), 1210-1217 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Mueller, M. J. Intermuscular adipose tissue is muscle specific and associated with poor functional performance. Journal of Aging Research. 2012, 172957 (2012).
- Gerber, C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., Meyer, D. C. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16 (6), 691-696 (2007).
- Hilton, T. N., Tuttle, L. J., Bohnert, K. L., Mueller, M. J., Sinacore, D. R. Excessive adipose tissue infiltration in skeletal muscle in individuals with obesity, diabetes mellitus, and peripheral neuropathy: association with performance and function. Physical Therapy. 88 (11), 1336-1344 (2008).
- Gaeta, M., et al. Muscle fat-fraction and mapping in Duchenne muscular dystrophy: evaluation of disease distribution and correlation with clinical assessments. Preliminary experience. Skeletal Radiology. 41 (8), 955-961 (2012).
- Buford, T. W., et al. Age-related differences in lower extremity tissue compartments and associations with physical function in older adults. Experimental Gerontology. 47 (1), 38-44 (2012).
- Addona, J., et al. Estimating 3D supraspinatus intramuscular fatty infiltration in older adults: a pilot study. Acta Radiologica. , 2841851221139597 (2022).
- Crook, J., et al. Comparison of multifidus muscle intramuscular fat by ultrasound echo intensity and fat-water based MR images in individuals with chronic low back pain. Musculoskeletal Science & Practice. 63, 102717 (2023).
- Lee, C., et al. Beige FAPs transplantation improves muscle quality and shoulder function after massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 1159-1166 (2020).
- Lee, C., et al. Beige fibro-adipogenic progenitor transplantation reduces muscle degeneration and improves function in a mouse model of delayed repair of rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 29 (4), 719-727 (2020).
- Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
- Overend, T. J., Cunningham, D. A., Paterson, D. H., Lefcoe, M. S. Thigh composition in young and elderly men determined by computed tomography. Clinical Physiology. 12 (6), 629-640 (1992).
- Li, W., et al. Progression and variation of fatty infiltration of the thigh muscles in Duchenne muscular dystrophy, a muscle magnetic resonance imaging study. Neuromuscular Disorders. 25 (5), 375-380 (2015).
- Davis, D. L., et al. Supraspinatus fatty infiltration on MRI among older adults receiving physical therapy as initial management for clinically suspected rotator cuff tear: A pilot study. Journal of Clinical Imaging Science. 12, 66 (2022).
- Salaffi, F., et al. Ultrasound and magnetic resonance imaging as diagnostic tools for sarcopenia in immune-mediated rheumatic diseases (IMRDs). La Radiologia Medica. 127 (11), 1277-1291 (2022).
- Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: a novel depot similar in size to visceral adipose tissue. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (4), 903-910 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Cade, W. T., Mueller, M. J. Lower physical activity is associated with higher intermuscular adipose tissue in people with type 2 diabetes and peripheral neuropathy. Physical Therapy. 91 (6), 923-930 (2011).
- Matsumura, N., et al. Quantitative assessment of fatty infiltration and muscle volume of the rotator cuff muscles using 3-dimensional 2-point Dixon magnetic resonance imaging. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 26 (10), 309-318 (2017).
- Cheuy, V. A., Hastings, M. K., Commean, P. K., Ward, S. R., Mueller, M. J. Intrinsic foot muscle deterioration is associated with metatarsophalangeal joint angle in people with diabetes and neuropathy. Clinical Biomechanics. 28 (9-10), 1055-1060 (2013).
- Samagh, S. P., et al. MRI quantification of fatty infiltration and muscle atrophy in a mouse model of rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 31 (3), 421-426 (2013).
- Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: an experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
- Goodpaster, B. H., Kelley, D. E., Thaete, F. L., He, J., Ross, R. Skeletal muscle attenuation determined by computed tomography is associated with skeletal muscle lipid content. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 104-110 (2000).
- Torriani, M., et al. Lower leg muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MR imaging and spectroscopy study. Skeletal Radiology. 41 (4), 437-445 (2012).
- Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
- Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (13), 2270-2278 (2010).
- Li, B., et al. Skeletal muscle respiratory uncoupling prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Medicine. 6 (10), 1115-1120 (2000).
- Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
- Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), 1 (2017).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), 50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Ungerleider, J. L., Johnson, T. D., Rao, N., Christman, K. L. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).
- Biltz, N. K., et al. Infiltration of intramuscular adipose tissue impairs skeletal muscle contraction. The Journal of Physiology. 598 (13), 2669-2683 (2020).
