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Biochemistry

Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소의 친화성 정제

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Medicine School, Huaqiao University, 2Engineering Research Centre of Molecular Medicine of Ministry of Education

Summary

여기에서는 간단하고 저렴하며 효율적인 Sipunculus nudus 의 섬유소 용해 효소의 친화성 정제 방법을 제시합니다.

Abstract

Sipunculus nudus(sFE)의 섬유소 용해 효소는 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화하고 피브린을 직접 분해할 수 있는 새로운 혈전용해제로 기존 혈전용해제에 비해 큰 이점을 보여줍니다. 그러나 구조 정보가 부족하기 때문에 sFE의 모든 정제 프로그램은 너무 복잡하고 비용이 많이 드는 다단계 크로마토그래피 정제를 기반으로 합니다. 여기서, sFE의 친화성 정제 프로토콜은 sFE의 결정 구조를 기반으로 최초로 개발되었습니다. 여기에는 미정제 시료 및 라이신/아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼의 준비, 친화성 정제 및 정제된 sFE의 특성 분석이 포함됩니다. 이 프로토콜에 따라 sFE 배치를 1일 이내에 정제할 수 있습니다. 또한 정제된 sFE의 순도와 활성은 각각 92% 및 19,200U/mL로 증가합니다. 따라서 이것은 sFE 정제를 위한 간단하고 저렴하며 효율적인 접근 방식입니다. 이 프로토콜의 개발은 sFE 및 기타 유사한 제제의 추가 활용에 매우 중요합니다.

Introduction

혈전증은 특히 Covid-19 세계적 대유행 이후 공중 보건에 대한 주요 위협입니다 1,2. 임상적으로, 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA) 및 유로키나제(UK)와 같은 많은 플라스미노겐 활성제(PA)가 혈전용해제로서 널리 사용되어 왔다. PA는 환자의 플라스미노겐을 활성 플라스민으로 활성화하여 피브린을 분해할 수 있습니다. 따라서, 이들의 혈전용해 효율은 환자의 플라스미노겐 상태에 의해 크게 제한된다 3,4. 메탈로프로테이나제 플라스민(metalloproteinase plasmin) 및 세린 플라스민(serine plasmin)과 같은 섬유소용해제는 혈전을 직접 용해시킬 수 있지만 다양한 플라스민 억제제에 의해 빠르게 비활성화되는 플라스민과 같은 섬유소용해효소(FE)를 포함하는 또 다른 유형의 임상 혈전용해제이다5. 그 후, 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시킬 뿐만 아니라 고대 땅콩 벌레 Sipunculus nudus(sFE)6의 섬유소 용해 효소인 피브린을 직접 분해하여 혈전을 용해시킬 수 있는 새로운 유형의 섬유소 용해제가 보고되었습니다.6. 이 이중기능은 특히 비정상적인 플라스미노겐 상태 측면에서 전통적인 혈전용해제에 비해 sFE에 다른 이점을 부여합니다. 다른 이관능성 혈전용해제7,8,9와 비교하여, sFE는 약물 개발, 특히 경구 약물에 대한 비식품 유래 제제에 비해 안전성을 포함한 몇 가지 이점을 나타낸다. 이는 Sipunculus nudus의 생체 안전성과 생체 적합성이 잘 확립되어 있기 때문입니다10.

미생물, 지렁이 및 버섯으로부터 분리된 다른 천연 섬유소용해제와 유사하게, S. nudus로부터의 sFE의 정제는 매우 복잡하며, 조직 균질화, 황산암모늄 침전, 담수화, 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 분자체10,11,12와 같은 여러 단계를 포함한다. 이러한 정화 시스템은 숙련 된 기술과 값 비싼 재료에 의존 할뿐만 아니라 전체 절차를 완료하는 데 며칠이 걸립니다. 따라서 sFE의 간단한 정화 프로그램은 sFE의 추가 개발에 매우 중요합니다. 다행히 sFE의 두 결정(PDB: 8HZP; PDB: 8HZO)를 성공적으로 획득했습니다(보충 파일 1 및 보충 파일 2 참조). 구조 분석 및 분자 도킹 실험을 통해 sFE의 촉매 코어가 아르기닌 또는 라이신 잔기를 포함하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있음을 발견했습니다.

여기서, sFE의 결정구조에 기초한 친화성 정제 시스템이 최초로 제안되었다. 이 프로토콜을 따르면, 단일 친화성 정제 단계에서 미정제 추출물로부터 고순도 및 고활성 sFE를 정제할 수 있습니다. 여기에서 개발된 프로토콜은 sFE의 대규모 제조에 중요할 뿐만 아니라 다른 혈전용해제의 정제에도 적용될 수 있습니다.

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Protocol

1. 준비

  1. 시료 처리
    1. 신선한 S. nudus (100g)를 조심스럽게 해부하고 장과 그 내부 액체를 수집하십시오.
    2. 균질화(1,000rpm, 60초)를 위해 300mL의 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 7.4)을 추가합니다.
    3. 균질액을 3x 동결-해동합니다.
    4. 시료를 원심분리(10,956 × g, 0.5 h, 4°C)하고 상층액을 수집한다. 추가 사용이 있을 때까지 샘플을 4°C에서 보관하십시오.
  2. 단백질 침전
    1. 상청액을 포화 황산암모늄 용액(9 부피)과 혼합하고 혼합물을 4°C에서 12시간 동안 방치한다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지하고 나중에 계속할 수 있습니다.
    2. 원심분리(10,956 × g, 0.5 h, 4°C)하여 단백질 침전물을 얻는 단계; 나중에 사용할 수 있도록 4 °C에 보관하십시오.
  3. 단백질 재현탁
    1. 단백질 침전물을 30mL의 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 7.4)으로 재현탁합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 조단백질 용액을 4°C에서 보관하십시오.

2. 친화성 크로마토그래피

  1. 용액 여과
    1. 조단백질 용액을 0.22μm 필터 멤브레인을 통해 여과합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 샘플을 4°C에서 보관하십시오.
  2. 컬럼 패킹
    1. 아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼 및 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 매트릭스 크로마토그래피 컬럼을 5 mL 빈 크로마토그래피 컬럼에 적정량의 라이신-아가로스 매트릭스 배지와 아르기닌-아가로스 매트릭스 배지를 로딩하여 압축한다.
      참고: 컬럼은 2-8°C에서 보관할 수 있으며 매트릭스는 저장 완충액(20% 에탄올)에 담글 수 있습니다.
  3. 친화성 정제
    1. 친화성 크로마토그래피 컬럼을 먼저 ddH2O(1mL/분, 10컬럼 부피)로 평형화한 다음 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 8.0, 1mL/분, 5컬럼 부피)으로 평형을 이룹니다.
    2. 단백질 용액 샘플을 사전 평형화된 컬럼(1mL/분, 1/3컬럼 부피)에 로드합니다.
      참고: 샘플 로딩의 부피는 sFE의 농도에 따라 다릅니다.
    3. 컬럼을 Tris-HCl 완충액(0.02 M, pH 8.0, 5컬럼 부피)으로 세척합니다.
    4. 0.15 M, 0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M 및 0.65 M NaCl(1 mL/min, 5 컬럼 부피)로 컬럼을 순차적으로 용리합니다.
    5. 0.15M NaCl 용출에 나타나야 하는 용출 피크를 찾은 다음 5mL 튜브에서 분획을 수집합니다.
    6. 용출 시료를 3 kD 초원심 필터(3,944 × g, 1.5 h, 4°C)를 사용하여 농축한다. 나중에 사용할 수 있도록 이 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.

3. 순도 평가

  1. 소듐 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔 제조
    1. 5% 농축 겔 및 12% 분리 겔을 사용하여 Laemmli's 방법에 따라 SDS-PAGE 겔을 제조하였다13.
  2. 전기영동
    1. 샘플(15μL)을 5x SDS-PAGE 단백질 로딩 버퍼(1/4 부피)와 혼합하고, 끓는 물에서 5분 동안 가열하고, SDS-PAGE 젤에 로드하고, 80V, 60mA에서 1.5시간 동안 겔을 실행합니다.
  3. 분석
    1. 전기영동 후 제조사의 프로토콜에 따라 Silver Stain Kit로 겔을 염색하고 화학발광 이미징 시스템을 이용하여 염색된 겔을 관찰합니다.
    2. 다음 공식을 사용하여 표적 단백질의 순도를 분석합니다: 표적 단백질의 순도 = 표적 단백질의 강도 값/총 단백질의 강도 값.

4. 혈전용해 활성 평가

  1. 피브린 플레이트 준비
    1. 피브리노겐 25mg과 생리식염수 1.25mL를 혼합하여 피브리노겐 용액을 준비합니다.
    2. 트롬빈 100U와 생리식염수 1.05mL를 완전히 혼합하여 트롬빈 용액을 준비한다.
    3. 22.5mL의 Tris-HCl 완충액(0.02mol/L, pH 7.4)에 0.5g의 아가로스를 첨가하여 아가로스 용액을 준비합니다. 완전히 용해될 때까지 100°C에서 아가로스 용액을 혼합하고 가열한다.
    4. 아가로스 용액을 약 50°C로 냉각하고 피브리노겐 용액을 첨가한다. 그런 다음 즉시 트롬빈 용액을 넣고 빠르게 혼합한 다음 60mm 배양 접시에 붓습니다.
  2. 로드
    1. 멸균 천공을 사용하여 준비된 피브린 플레이트에 3mm 웰을 펀칭하고 웰에 10μL 샘플을 채웁니다.
  3. 분석
    1. 37°C에서 18시간 배양한 후, 이들의 분해 구역의 크기를 계산하여 혈전용해 활성을 측정한다. 섬유소 용해 활성 = (샘플의 구역 크기/유로키나아제의 구역 크기) x 100U. 구역 크기 = 직경 x 직경.
      참고: 생리 식염수 완충액, 조단백질(프로토콜 단계 1.3.1에서 얻은 샘플) 및 유로키나아제를 각각 블랭크, 음성 대조군 및 양성 대조군에 사용했습니다. 유로키나아제와 비교하여 정제된 sFE의 섬유소 용해 활성이 ~19,200U/mL임을 발견했습니다.

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Representative Results

이 프로토콜에 따라, 조조직 용해물을 추출하고, 아르기닌-아가로스 매트릭스 및 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼을 구축하고, 정제된 sFE를 얻고, 정제된 sFE의 순도 및 섬유소 용해 활성을 각각 SDS-PAGE 및 피브린 플레이트에 의해 측정하였다.

원심분리 후, 수집된 상층액은 투명한 황갈색 점성 액체였다. 침전은 이 상청액을 포화 황산암모늄 용액(9 부피)과 혼합했을 때 시작되었다. 12시간 동안 방치한 후, 튜브의 바닥에 무거운 침전물이 형성되었다. Tris-HCl 완충액으로 재현탁하면 단백질 침전물이 빠르게 사라지고 완충액에 용해되어 투명한 옅은 노란색 액체로 나타납니다.

단백질 용액을 아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼에 로딩했을 때, ~40분에 명백한 피크(피크 1, 플로우스루 피크)가 나타났고 ~66분에 용리가 멈췄습니다. 그래디언트 용출 단계에서 0.15M NaCl로 용리하면 ~94분에 명백한 피크(피크 2, 용출 피크)가 나타나고 ~110분에 용리가 중지되었습니다. 나머지 용출 단계(0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M 및 0.65 M NaCl)에서는 뚜렷한 용출 피크가 나타나지 않았습니다(그림 1A). 본 연구에서는 아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼을 최대 10회까지 재사용하였고 컬럼의 성능이 크게 변하지 않았음을 발견하였다.

단백질 용액을 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼에 로딩했을 때, ~38분에 명백한 피크(피크 1, 플로우스루 피크)가 나타났고, ~60분에 용리가 멈췄다. 그래디언트 용출 단계에서 0.15M NaCl로 용리하면 ~80분에 명백한 피크(피크 2, 용출 피크)가 나타나고 ~86분에 용리가 중지되었습니다. 나머지 용출 단계(0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M 및 0.65 M NaCl)에서는 뚜렷한 용출 피크가 나타나지 않았습니다(그림 1B). 아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼 및 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼의 용출 프로파일은 유사하였다. 앞서 언급했듯이 아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼을 최대 10회까지 재사용해도 이 컬럼의 성능은 변경되지 않았습니다.

정제된 sFE(10 μL, 용출 피크 샘플, 피크 2)를 제조된 피브린 플레이트에 첨가하였다. 또한, 10 μL의 유로키나제(100 U), 10 μL의 생리 식염수 완충액 및 10 μL의 조단백질(프로토콜 단계 1.3.1에서 얻은 샘플)을 각각 양성 대조군, 블랭크 및 음성 대조군에 사용했습니다. 18 시간의 배양 후, 2 개의 피브린 플레이트가 유사한 결과를 나타냈다 : 용해 영역 (직경 1.3cm)이 유로 키나아제 대조군에 나타났다; 생리 식염수 완충액에서 용해 영역이 관찰되지 않았습니다. 용해 구역 (직경 2.1cm)이 조단백질 웰에 나타났다. 정제된 sFE 웰에 용해 영역(직경 1.8cm)이 나타났다(그림 2). 유로키나아제와 비교하여 정제된 sFE의 섬유소 용해 활성이 ~19,200U/mL임을 발견했습니다. 용출 피크 시료는 친화성 컬럼 상에 로딩된 시료의 부피와 동일한 부피로 조정됨에 따라, 친화성 컬럼의 회수율은 피브린 플레이트 상의 용해 영역의 크기(직경 x 직경)로 표시된다. 친화성 컬럼의 회수율은 ~73.5%였다.

조단백질(프로토콜 단계 1.3.1에서 얻은 샘플)과 정제된 sFE(용출 피크 샘플, 피크 2)를 순도 분석에 사용했습니다. SDS-PAGE 및 염색 후, 3개의 주요 단백질 밴드(25, 26 및 27 kD)와 6개의 마이너 밴드(20, 24, 28, 35, 40 및 45 kD)가 조단백질에 제시되었습니다. 정제된 sFE에서 1개의 주요 밴드(27kD)와 2개의 마이너 밴드(26 및 28kD)가 제시되었습니다(그림 3). 회색 값 분석을 통해 정제 된 sFE의 순도가 ~ 92 %로 높음을 발견했습니다.

Figure 1
그림 1: 친화성 정제의 프로파일. (A) 조 sFE 샘플을 아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 정제에 의해 정제하였다. 명백한 유동 피크는 ~40분에 나타났고 ~66분에 용리를 멈췄습니다. 명백한 용출 피크는 ~94분에 나타났고 ~110분에 용리를 멈췄습니다. (B) 조 sFE 샘플을 리신-아가로스 매트릭스 친화성 정제에 의해 정제하였다. ~38분에 명백한 유동 피크가 나타났고 ~60분에 용리가 멈췄습니다. ~80분에 명백한 용출 피크가 나타났고 ~86분에 용리가 멈췄습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 섬유소 용해 활성 평가. 샘플을 피브린 플레이트에 첨가하고, 이들의 섬유소용해 활성을 측정하고, 18시간 후에 플레이트 상의 이들의 분해 구역에 의해 평가하였다. 다르게 처리 된 샘플은 빨간색 아라비아 숫자로 표시됩니다. (a) 아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼에 의해 정제된 sFE의 혈전용해 활성. #1, 100U의 유로키나제; #2, 생리 식염수 완충액; #3, 조단백질(프로토콜 단계 1.3.1에서 얻은 샘플); #4, 정제된 sFE(용출 피크 샘플, 피크 2). (b) sFE의 혈전용해 활성을 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼에 의해 정제한다. #1, 100U의 유로키나제; #2, 생리 식염수 완충액; #3, 조단백질(프로토콜 단계 1.3.1에서 얻은 샘플); #4, 정제된 sFE(용출 피크 샘플, 피크 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 순도 분석. 정제된 sFE의 순도는 SDS-PAGE로 분석하였다. (a) 아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼에 의해 정제된 sFE의 순도. M: 단백질 마커; 레인 1: 조단백질(프로토콜 단계 1.3.1에서 얻은 샘플); 레인 2: 정제된 sFE(용출 피크 샘플, 피크 2). (b) 리신-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼에 의해 정제된 sFE의 순도. M: 단백질 마커; 레인 1: 조단백질(프로토콜 단계 1.3.1에서 얻은 샘플); 레인 2: 정제된 sFE(용출 피크 샘플, 피크 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 8ZHP: snFPITE-n1의 결정 구조. PDB X선 구조 검증 보고서. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 8ZHO: snFPITE-n2의 결정 구조. PDB X선 구조 검증 보고서. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

sFE의 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없기 때문에, 현재 사용되는 sFE는 신선한 S. nudus14로부터 추출되었다. 더욱이, 문헌에 보고된 sFE의 정제 절차는 분자량, 등전점, 이온 강도 및 극성과 같은 sFE의 몇 가지 일반적인 특징을 기반으로 하기 때문에 복잡하고 비용이 많이 들었습니다15,16. 현재까지 sFE의 친화성 정제 프로토콜은 보고되지 않았습니다. 본 연구에서는 sFE의 결정구조에 대한 지식을 바탕으로 sFE의 친화성 정제 프로토콜을 성공적으로 개발하였다. 보고된 정제 방법과 비교할 때 이 친화성 정제 방법은 작동하기 쉽고 저렴하며 사용자 친화적이었습니다. 또한, 이 방법을 사용하여 활성 sFE의 상당히 높은 회수율이 관찰되었습니다.

혈전용해효소의 친화성 정제 방법은 많은 것이 보고되었지만, 항체17, 억제제18, 리간드, 수용체16에 기초하고 있다. 이러한 항체, 억제제, 리간드 및 수용체의 준비는 기술적으로 어렵고 힘들다. 또한, 이들 분자를 매트릭스에 접합시키기 위한 추가적인 노력이 필요하다. 대조적으로, 아르기닌-아가로스 매트릭스와 라이신-아가로스 매트릭스는 상용 물질이며, 즉시 사용 가능하고, 매우 안정적이며, 스케일 업이 용이하다19. 최근에, 라이신-아가로스 매트릭스는 플라스미노겐20,21의 친화성 정제를 위해 사용되었다; 그러나, 플라스미노겐은 플라스민의 프로-엔자임이며, 활성형15가 아니다. 라이신-아가로스 매트릭스가 플라스민의 친화성 정제에 적합한지 여부는 불확실하다. 이론적으로, 이 연구에서 아르기닌-아가로스 매트릭스 및 라이신-아가로스 매트릭스를 사용하여 정제된 sFE는 단지 활성 형태일 뿐이며, 결정 모델은 sFE의 촉매 삼합체만이 아르기닌 및 라이신 잔기와 상호작용할 수 있음을 나타내었다. 따라서 이 프로토콜은 다른 세린 플라스민의 정제에 적용되어 다른 세린 플라스민 약물의 개발을 가속화할 수 있습니다.

sFE와 친화성 컬럼 사이의 결합이 그다지 강하지 않기 때문에 정확한 NaCl 농도와 적절한 용출 속도를 유지하는 것이 성공적인 정제를 위해 매우 중요합니다. 또 다른 핵심 요소는 정제에 심각한 영향을 미치는 시스템의 pH입니다. 이 세 가지 매개 변수는 우리에 의해 최적화되었습니다. 틀림없이, 이 연구에서 활성 sFE의 회수율은 상대적으로 낮았으며, 아가로스 매트릭스 표면에 이용 가능한 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기의 수가 적기 때문에 제한되었을 수 있습니다. 그러므로, 라이신/아르기닌과 아가로스 매트릭스 사이의 링커는 그것의 회수율을 향상시키기 위해 길어질 필요가 있습니다. 한편, 우리는 sFE와 유사한 촉매 트라이어드를 가진 다른 세린 단백질이 이 시스템에서 용출될 가능성을 배제할 수 없었습니다. 따라서 한외여과와 같은 분자량 기반 정제 기술을 추가하여 sFE에서 다른 세린 단백질을 분리하는 것이 좋습니다. 유사하게, 결합 능력 향상, 수명 연장 및 절차 단순화와 같은 다른 많은 문제는 전략(예: 아르기닌/라이신을 폴리 아르기닌/라이신으로 대체 및 링커 변형)에 따라 향후 작업에서 해결해야 합니다.

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Disclosures

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 샤먼시 과학기술국(3502Z20227197)과 푸젠성 과학기술국(No. 2019J01070, No.2021Y0027)의 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) Biosharp
2-Mercaptoethanol Solarbio
Agarose G-10 Biowest
Ammonium persulfate SINOPHARM
Ammonium sulfate SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B Solarbio Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB) Solarbio
Fast Silver Stain Kit Beyotime
Fibrinogen Merck
Glycine Solarbio
Hydrochloric acid SINOPHARM
Kinase RHAWN
Lysine-Sepharose 4B Solarbio Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) Beyotime
Sodium chloride SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide SINOPHARM
Thrombin Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 SANYO
Chemiluminescence Imaging System GE
Constant Flow Pump BT-100 QITE
Constant Temperature Incubator JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II SCIENTZ
Electronic Analytical Balance DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker Kylin-Bell
Ice Machine AF 103 Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner ShuMei
Magnetic Stirrer Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W Cence
Microwave Oven Galanz
Milli-Q Reference Millipore
Pipettor Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System Bio-Rad
Consumable Material 
200 µL PCR Tube (200 µL) Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL) Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL) Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL) NEST
Centrifuge Tube (7 mL) Biosharp
Culture Dish (60 mm) NEST
Filter Membrane (0.22 µm) Millex GP
Parafilm Bemis
Pipette Tip (1 mL ) KIRGEN
Pipette Tip (10 µL) Axygene
Pipette Tip (200 µL) Axygene
Special Indicator Paper TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) Millipore
Universal pH Indicator SSS Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>Sipunculus nudus</em>에서 섬유소 용해 효소의 친화성 정제
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Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H.… More

Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus. J. Vis. Exp. (196), e65631, doi:10.3791/65631 (2023).

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