Summary
Hier presenteren we een affiniteitszuiveringsmethode van een fibrinolytisch enzym van Sipunculus nudus die eenvoudig, goedkoop en efficiënt is.
Abstract
Het fibrinolytische enzym van Sipunculus nudus (sFE) is een nieuw fibrinolytisch middel dat zowel plasminogeen tot plasmine kan activeren als fibrine direct kan afbreken, wat grote voordelen biedt ten opzichte van traditionele trombolytische middelen. Vanwege het gebrek aan structurele informatie zijn alle zuiveringsprogramma's voor sFE echter gebaseerd op meerstapschromatografiezuiveringen, die te ingewikkeld en duur zijn. Hier wordt voor het eerst een affiniteitszuiveringsprotocol van sFE ontwikkeld op basis van een kristalstructuur van sFE; het omvat de bereiding van het ruwe monster en de lysine/arginine-agarose matrix affiniteitschromatografiekolom, affiniteitszuivering en karakterisering van de gezuiverde sFE. Volgens dit protocol kan een partij sFE binnen 1 dag worden gezuiverd. Bovendien neemt de zuiverheid en activiteit van de gezuiverde sFE toe tot respectievelijk 92% en 19.200 U/ml. Dit is dus een eenvoudige, goedkope en efficiënte aanpak voor sFE-zuivering. De ontwikkeling van dit protocol is van groot belang voor het verdere gebruik van sFE en andere soortgelijke middelen.
Introduction
Trombose is een grote bedreiging voor de volksgezondheid, vooral na de Covid-19 wereldwijde pandemie 1,2. Klinisch gezien zijn veel plasminogeenactivatoren (PA's), zoals weefseltype plasminogeenactivator (tPA) en urokinase (VK), op grote schaal gebruikt als trombolytische geneesmiddelen. PA's kunnen plasminogeen van patiënten activeren tot actief plasmine om fibrine af te breken. Hun trombolytische efficiëntie wordt dus sterk beperkt door de plasminogeenstatus van de patiënten 3,4. Fibrinolytische middelen, zoals metalloproteinase plasmine en serine plasmine, zijn een ander type klinisch trombolytisch geneesmiddel dat ook fibrinolytische enzymen (FE) zoals plasmine bevat, die stolsels direct kunnen oplossen, maar snel worden geïnactiveerd door verschillende plasmineremmers5. Vervolgens is een nieuw type fibrinolytisch middel gemeld dat de trombus kan oplossen door niet alleen het plasminogeen in plasmine te activeren, maar ook het fibrine direct af te breken 6-het fibrinolytische enzym van de oude pindamur Sipunculus nudus (sFE)6. Deze bifunctie geeft sFE andere voordelen ten opzichte van traditionele trombolytische geneesmiddelen, vooral in termen van abnormale plasminogeenstatus. In vergelijking met andere bifunctionele fibrinolytische middelen 7,8,9 vertoont sFE verschillende voordelen, waaronder veiligheid, ten opzichte van van non-food afgeleide middelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, met name voor orale geneesmiddelen. Dit komt omdat de bioveiligheid en biocompatibiliteit van Sipunculus nudus goed zijn vastgesteld10.
Net als de andere natuurlijke fibrinolytische middelen geïsoleerd uit micro-organismen, regenwormen en paddenstoelen, is de zuivering van sFE uit S. nudus zeer gecompliceerd en omvat meerdere stadia, zoals weefselhomogenisatie, ammoniumsulfaatprecipitatie, ontzilting, anionenuitwisselingschromatografie, hydrofobe interactiechromatografie en moleculair zeven10,11,12. Een dergelijk zuiveringssysteem is niet alleen afhankelijk van bekwame vaardigheden en dure materialen, maar vereist ook enkele dagen om de hele procedure te voltooien. Daarom is een eenvoudig zuiveringsprogramma van sFE van groot belang voor de verdere ontwikkeling van sFE. Gelukkig zijn er twee kristallen van sFE (PDB: 8HZP; VOB: 8HZO) met succes zijn verkregen (zie aanvullend dossier 1 en aanvullend dossier 2). Door middel van structurele analyse en moleculaire dockingexperimenten ontdekten we dat de katalytische kern van sFE specifiek kon binden aan doelen die arginine of lysineresiduen bevatten.
Hierin werd voor het eerst een affiniteitszuiveringssysteem voorgesteld, gebaseerd op de kristalstructuur van sFE. Door dit protocol te volgen, kon zeer zuivere en zeer actieve sFE worden gezuiverd uit de ruwe extracten in een enkele affiniteitszuiveringsfase. Het hier ontwikkelde protocol is niet alleen belangrijk voor de grootschalige bereiding van sFE, maar kan ook worden toegepast voor de zuivering van andere fibrinolytische middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding
- Monsterbehandeling
- Ontleed voorzichtig verse S. nudus (100 g) en verzamel de darm en zijn binnenvocht.
- Voeg 300 ml Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 7,4) toe voor homogenisatie (1.000 tpm, 60 s).
- Bevries-ontdooi het homogenaat 3x.
- Centrifugeer het monster (10,956 × g, 0,5 uur, 4 °C) en verzamel het supernatant. Bewaar het monster bij 4 °C tot verder gebruik.
- Neerslag van eiwitten
- Meng het supernatant met de verzadigde ammoniumsulfaatoplossing (negen volumes) en laat het mengsel 12 uur bij 4 °C staan.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en later worden voortgezet. - Centrifugeer (10,956 × g, 0,5 uur, 4 °C) om het eiwitprecipitaat te verkrijgen; bewaren bij 4 °C voor later gebruik.
- Meng het supernatant met de verzadigde ammoniumsulfaatoplossing (negen volumes) en laat het mengsel 12 uur bij 4 °C staan.
- Eiwitresuspensie
- Resuspendeer het eiwitprecipitaat met 30 ml Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 7,4). Bewaar deze ruwe eiwitoplossing bij 4 °C voor later gebruik.
2. Affiniteitschromatografie
- Filtratie van oplossingen
- Filtreer de ruwe eiwitoplossing door een filtermembraan van 0,22 μm. Bewaar dit monster bij 4 °C voor later gebruik.
- Kolom verpakking
- Verpak de arginine-agarose matrix affiniteitschromatografie kolom en lysine-agarose matrix affiniteitschromatografie kolom door een geschikte hoeveelheid lysine-agarose matrix medium en arginine-agarose matrix medium in 5 ml lege chromatografie kolommen te laden.
OPMERKING: De kolom kan worden bewaard bij 2-8 °C, waarbij de matrix wordt ondergedompeld in de opslagbuffer (20% ethanol).
- Verpak de arginine-agarose matrix affiniteitschromatografie kolom en lysine-agarose matrix affiniteitschromatografie kolom door een geschikte hoeveelheid lysine-agarose matrix medium en arginine-agarose matrix medium in 5 ml lege chromatografie kolommen te laden.
- Affiniteitszuivering
- Breng de affiniteitschromatografiekolom eerst in evenwicht met ddH2O (1 ml/min, 10 kolomvolumes), gevolgd door Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 8,0, 1 ml/min, 5 kolomvolumes).
- Laad het eiwitoplossingsmonster op de vooraf gebalanceerde kolom (1 ml/min, 1/3 kolomvolume).
OPMERKING: Het volume van de monsterbelasting is afhankelijk van de concentratie van sFE. - Was de kolom met Tris-HCl buffer (0,02 M, pH 8,0, vijf kolomvolumes).
- Elueer de kolom met achtereenvolgens 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M en 0,65 M NaCl (1 ml/min, vijf kolomvolumes).
- Zoek naar de elutiepiek die zou moeten verschijnen in de 0,15 M NaCl-elutie en verzamel vervolgens de fracties in buisjes van 5 ml.
- Concentreer het elutiemonster met een ultracentrifugaalfilter van 3 kD (3,944 × g, 1,5 uur, 4 °C). Bewaar dit monster bij -80 °C voor later gebruik.
3. Zuiverheidsbeoordeling
- Natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gel preparaat
- Bereid de SDS-PAGE gel volgens de methode van Laemmli met 5% geconcentreerde gel en 12% scheidingsgel13.
- Elektroforese
- Meng het monster (15 μL) met 5x SDS-PAGE eiwitlaadbuffer (1/4 volume), verwarm gedurende 5 minuten in kokend water, laad op de SDS-PAGE-gel en laat de gel gedurende 1,5 uur op 80 V, 60 mA lopen.
- Analyse
- Na elektroforese kleurt u de gel met een Silver Stain Kit, volgens het protocol van de fabrikant, en observeert u de gekleurde gel met behulp van een chemiluminescent beeldvormingssysteem.
- Analyseer de zuiverheid van het doeleiwit met behulp van de volgende formule: zuiverheid van doeleiwit = intensiteitswaarde van doeleiwit/intensiteitswaarde van totaal eiwit.
4. Fibrinolytische activiteitsevaluatie
- Fibrine plaat voorbereiding
- Bereid de fibrinogeenoplossing door 25 mg fibrinogeen te mengen met 1,25 ml fysiologische zoutoplossing.
- Bereid de trombine-oplossing door 100 U trombine volledig te mengen met 1,05 ml fysiologische zoutoplossing.
- Bereid de agarose-oplossing door 0,5 g agarose toe te voegen aan 22,5 ml Tris-HCl-buffer (0,02 mol/l, pH 7,4). Meng en verwarm de agarose-oplossing op 100 °C totdat deze volledig is opgelost.
- Koel de agarose-oplossing af tot ongeveer 50 °C en voeg fibrinogeenoplossing toe. Voeg vervolgens onmiddellijk de trombine-oplossing toe, meng ze snel en giet ze in een kweekschaal van 60 mm.
- Laden
- Pons met een steriele boor kuilen van 3 mm op de bereide fibrineplaten en vul de putjes met 10 μL-monsters.
- Analyse
- Meet na 18 uur incubatie bij 37 °C de fibrinolytische activiteit door de grootte van hun afbraakzones te berekenen. Fibrinolytische activiteit = (zonegrootte van het monster/zonegrootte van urokinase) x 100 U. Zonegrootte = diameter x diameter.
OPMERKING: Fysiologische zoutoplossingbuffer, ruw eiwit (monster verkregen in protocolstap 1.3.1) en urokinase werden gebruikt voor respectievelijk de blanco, negatieve controle en positieve controle. In vergelijking met urokinase vonden we dat de fibrinolytische activiteit van de gezuiverde sFE ~ 19.200 U / ml was.
- Meet na 18 uur incubatie bij 37 °C de fibrinolytische activiteit door de grootte van hun afbraakzones te berekenen. Fibrinolytische activiteit = (zonegrootte van het monster/zonegrootte van urokinase) x 100 U. Zonegrootte = diameter x diameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens dit protocol werden ruwe weefsellysaten geëxtraheerd, arginine-agarose matrix en lysine-agarose matrix affiniteitschromatografiekolommen gebouwd, gezuiverde sFE verkregen en de zuiverheid en fibrinolytische activiteit van de gezuiverde sFE werden gemeten door respectievelijk SDS-PAGE en fibrineplaten.
Na centrifugatie was het verzamelde supernatant een transparante bruine viskeuze vloeistof. Precipitatie begon toen dit supernatant werd gemengd met verzadigde ammoniumsulfaatoplossing (negen volumes). Na 12 uur staan werd een zwaar neerslag gevormd op de bodem van de buis. Toen het werd geresuspendeerd met Tris-HCl-buffer, verdween het eiwitneerslag snel en loste het op in de buffer, waardoor het verscheen als een transparante lichtgele vloeistof.
Toen de eiwitoplossing op de arginine-agarose matrixaffiniteitskolom werd geladen, verscheen een duidelijke piek (piek 1, doorstroompiek) op ~ 40 min en stopte met eluteren bij ~ 66 min. In de gradiëntre-elutiefase, wanneer geëlueerd met 0,15 M NaCl, verscheen een duidelijke piek (piek 2, elutiepiek) op ~ 94 min en stopte met eluteren bij ~ 110 min. Er verschenen geen duidelijke elutiepieken in de resterende elutiestadia (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M en 0,65 M NaCl) (figuur 1A). In deze studie hergebruikten we de arginine-agarose matrix affiniteitskolom tot 10 keer en ontdekten dat de prestaties van de kolom niet significant veranderden.
Wanneer de eiwitoplossing werd geladen in de lysine-agarose matrixaffiniteitskolom, verscheen een duidelijke piek (piek 1, doorstroompiek) op ~ 38 minuten en stopte met elueren bij ~ 60 minuten. In de gradiëntre-elutiefase, wanneer geëlueerd met 0,15 M NaCl, verscheen een duidelijke piek (piek 2, elutiepiek) op ~ 80 min en stopte met eluteren bij ~ 86 min. Er verschenen geen duidelijke elutiepieken in de resterende elutiestadia (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M en 0,65 M NaCl (figuur 1B). De elutieprofielen van de arginine-agarose matrix affiniteitskolom en de lysine-agarose matrix affiniteitskolom waren vergelijkbaar. Zoals eerder vermeld, heeft het hergebruik van de arginine-agarose matrix affiniteitskolom tot 10 keer de prestaties van deze kolom niet veranderd.
Gezuiverd sFE (10 μL, elutiepiekmonster, piek 2) werd toegevoegd aan de bereide fibrineplaat. Daarnaast werden 10 μL urokinase (100 U), 10 μL fysiologische zoutbuffer en 10 μL ruw eiwit (monster verkregen in protocolstap 1.3.1) gebruikt voor respectievelijk de positieve controle, blanco en negatieve controle. Na 18 uur incubatie vertoonden twee fibrineplaten vergelijkbare resultaten: een lysingszone (1,3 cm diameter) verscheen in de urokinasecontrole; er werd geen lysingszone waargenomen in de fysiologische zoutoplossingbuffer; een lysingzone (2,1 cm diameter) verscheen in de ruwe eiwitput; en een lysingszone (diameter 1,8 cm) verscheen in de gezuiverde sFE-put (figuur 2). In vergelijking met urokinase vonden we dat de fibrinolytische activiteit van de gezuiverde sFE ~ 19.200 U / ml was. Aangezien het elutiepiekmonster is aangepast aan hetzelfde volume als dat van het monster dat op de affiniteitskolom is geladen, wordt de herstelsnelheid van de affiniteitskolom aangegeven door de grootte (diameter x diameter) van de lyseringszone op de fibrineplaat. Het herstelpercentage van de affiniteitskolom was ~73,5%.
Het ruwe eiwit (monster verkregen in protocolstap 1.3.1) en het gezuiverde sFE (elutiepiekmonster, piek 2) werden gebruikt voor zuiverheidsanalyse. Na SDS-PAGE en kleuring werden drie belangrijke eiwitbanden (25, 26 en 27 kD) en zes kleine banden (20, 24, 28, 35, 40 en 45 kD) gepresenteerd in het ruwe eiwit. Eén majeurband (27 kD) en twee mineurbanden (26 en 28 kD) werden gepresenteerd in de gezuiverde sFE (figuur 3). Door de grijswaardeanalyse ontdekten we dat de zuiverheid van gezuiverde sFE zo hoog was als ~ 92%.
Figuur 1: Het profiel van affiniteitszuivering. (A) Het ruwe sFE-monster werd gezuiverd door arginine-agarosematrix-affiniteitszuivering. Een duidelijke doorstroompiek verscheen op ~ 40 min en stopte met elueren bij ~ 66 min. Een duidelijke elutiepiek verscheen op ~ 94 min en stopte met eluteren bij ~ 110 min. (B) Het ruwe sFE-monster werd gezuiverd door lysine-agarose matrixaffiniteitszuivering. Een duidelijke doorstroompiek verscheen op ~ 38 minuten en stopte met elueren bij ~ 60 minuten. Een duidelijke elutiepiek verscheen op ~ 80 min en stopte met eluteren bij ~ 86 min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fibrinolytische activiteitsevaluatie. Monsters werden toegevoegd aan de fibrineplaat en hun fibrinolytische activiteit werd gemeten en geëvalueerd door hun afbrekende zones op de plaat na 18 uur. Verschillend behandelde monsters worden aangegeven met rode Arabische cijfers. (A) De fibrinolytische activiteit van sFE gezuiverd door arginine-agarose matrix affiniteitskolom. # 1, 100 U urokinase; #2, fysiologische zoutbuffer; #3, ruw eiwit (monster verkregen in protocolstap 1.3.1); #4, gezuiverd sFE (elutiepiekmonster, piek 2). (B) De fibrinolytische activiteit van sFE gezuiverd door de lysine-agarose matrix affiniteitskolom. # 1, 100 U urokinase; #2, fysiologische zoutbuffer; #3, ruw eiwit (monster verkregen in protocolstap 1.3.1); #4, gezuiverd sFE (elutiepiekmonster, piek 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Zuiverheidsanalyse. De zuiverheid van gezuiverde sFE werd geanalyseerd door SDS-PAGE. (A) De zuiverheid van sFE gezuiverd door de arginine-agarose matrix affiniteitskolom. M: eiwitmarker; baan 1: ruw eiwit (monster verkregen in protocolstap 1.3.1); baan 2: gezuiverd sFE (elutiepiekmonster, piek 2). (B) De zuiverheid van sFE gezuiverd door de lysine-agarose matrix affiniteitskolom. M: eiwitmarker; baan 1: ruw eiwit (monster verkregen in protocolstap 1.3.1); baan 2: gezuiverd sFE (elutiepiekmonster, piek 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: 8ZHP: Kristalstructuur van snFPITE-n1. Een PDB X-ray structurele validatie rapport. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: 8ZHO: Kristalstructuur van snFPITE-n2. Een PDB X-ray structurele validatie rapport. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege de onbeschikbaarheid van de exacte gensequentie van sFE, werd de momenteel gebruikte sFE geëxtraheerd uit verse S. nudus14. Bovendien waren de zuiveringsprocedures van sFE die in de literatuur werden gerapporteerd gecompliceerd en kostbaar, omdat ze gebaseerd waren op enkele algemene kenmerken van sFE, zoals molecuulgewicht, iso-elektrisch punt, ionische sterkte en polariteit15,16. Tot op heden is er geen affiniteitszuiveringsprotocol van sFE gemeld. In deze studie werd met succes een affiniteitszuiveringsprotocol van sFE ontwikkeld op basis van de kennis van de kristalstructuur. Vergeleken met de gerapporteerde zuiveringsmethoden was deze affiniteitszuiveringsmethode eenvoudig te bedienen, goedkoop en gebruiksvriendelijk. Bovendien werd met behulp van deze methode een aanzienlijk hogere herstelsnelheid van de actieve sFE waargenomen.
Hoewel veel affiniteitszuiveringsmethoden van fibrinolytische enzymen zijn gemeld, waren ze gebaseerd op antilichamen17, remmers 18, liganden en receptoren16. De bereiding van deze antilichamen, remmers, liganden en receptoren is technisch uitdagend en bewerkelijk. Bovendien zijn er extra inspanningen nodig om deze moleculen aan de matrix te conjugeren. Arginine-agarose matrix en lysine-agarose matrix zijn daarentegen commerciële materialen, gebruiksklaar, zeer stabiel en gemakkelijk op te schalen19. Onlangs is lysine-agarose matrix gebruikt voor de affiniteitszuivering van plasminogeen20,21; Plasminogeen is echter het pro-enzym van het plasmine, niet een actieve vorm15. Het blijft onzeker of lysine-agarose matrix geschikt is voor affiniteitszuivering van plasmine. Theoretisch is de sFE gezuiverd met behulp van arginine-agarose matrix en lysine-agarose matrix in deze studie alleen de actieve vorm, omdat het kristalmodel heeft aangegeven dat alleen de katalytische triades van sFE kunnen interageren met arginine en lysineresiduen. Daarom kan dit protocol worden toegepast bij de zuivering van andere serine plasmine, waardoor de ontwikkeling van andere serine plasmine geneesmiddelen wordt versneld.
Omdat de binding tussen sFE en de affiniteitskolom niet erg sterk is, zijn het handhaven van een exacte NaCl-concentratie en de juiste elutiesnelheid zeer kritisch voor een succesvolle zuivering. Een andere belangrijke factor is de pH van het systeem, die de zuivering ernstig beïnvloedt. Deze drie parameters zijn door ons geoptimaliseerd. Toegegeven, de herstelsnelheid van actieve sFE in deze studie was relatief laag en kan beperkt zijn door het lage aantal beschikbare arginineresiduen of lysineresiduen op het oppervlak van de agarosematrix. Daarom moet de link tussen lysine / arginine en agarosematrix worden verlengd om de herstelsnelheid te verbeteren. Ondertussen konden we niet uitsluiten dat andere serine-eiwitten met een vergelijkbare katalytische triade als sFE onder dit systeem zullen worden geëlueerd. Het is dus beter om een op molecuulgewicht gebaseerde zuiveringstechnologie toe te voegen, zoals ultrafiltratie, om de andere serine-eiwitten van sFE te scheiden. Evenzo moeten veel andere problemen, zoals het verbeteren van het bindingsvermogen, het verlengen van de levensduur en het verder vereenvoudigen van de procedure, in toekomstige werkzaamheden worden aangepakt door middel van strategieën (bijvoorbeeld het vervangen van arginine / lysine door polyarginine / lysine en wijziging van de linker).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Science and Technology Bureau van Xiamen City (3502Z20227197) en het Science and Technology Bureau van de provincie Fujian (nr. 2019J01070, nr. 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B.
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
