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Immunology and Infection

एनोफिलीज मच्छर में शुक्राणुजनन का अध्ययन करने के लिए सीटू संकरण में पूरे-माउंट फ्लोरेसेंस

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65356
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1
1Department of Life Sciences, Sir Alexander Fleming Building, Imperial College London, 2Department of Entomology, Virginia Tech
* These authors contributed equally

Summary

उनकी सरल शारीरिक रचना को देखते हुए, एनोफिलीज वृषण शुक्राणुजनन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा साइटोलॉजिकल मॉडल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल सीटू संकरण में पूरे-माउंट प्रतिदीप्ति का वर्णन करता है, इस जैविक प्रक्रिया की जांच करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक तकनीक, साथ ही शुक्राणु उत्पादन में शामिल जीन में उत्परिवर्तन को परेशान करने वाले ट्रांसजेनिक उपभेदों के फेनोटाइप।

Abstract

शुक्राणुजनन एक जटिल जैविक प्रक्रिया है जिसके दौरान द्विगुणित कोशिकाएं क्रमिक माइटोटिक और मियोटिक विभाजन से गुजरती हैं, जिसके बाद अगुणित शुक्राणु बनाने के लिए बड़े संरचनात्मक परिवर्तन होते हैं। जैविक पहलू के अलावा, जीन ड्राइव और सिंथेटिक लिंग अनुपात विकृतियों जैसी आनुवंशिक प्रौद्योगिकियों को समझने और विकसित करने के लिए शुक्राणुजनन का अध्ययन करना सबसे महत्वपूर्ण है, जो क्रमशः मेंडेलियन वंशानुक्रम और शुक्राणु लिंग अनुपात को बदलकर, कीट कीट आबादी को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। ये प्रौद्योगिकियां प्रयोगशाला सेटिंग्स में बहुत आशाजनक साबित हुई हैं और संभावित रूप से एनोफिलीज मच्छरों की जंगली आबादी को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो मलेरिया के वैक्टर हैं। वृषण शरीर रचना विज्ञान की सादगी और उनके चिकित्सा महत्व के कारण, उप-सहारा अफ्रीका में एक प्रमुख मलेरिया वेक्टर एनोफिलीज गैम्बिया, शुक्राणुजनन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा साइटोलॉजिकल मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे पूरे माउंट फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (डब्ल्यूफिश) का उपयोग फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके शुक्राणुजनन के माध्यम से सेल परमाणु संरचना में नाटकीय परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो विशेष रूप से एक्स और वाई क्रोमोसोम को दाग देते हैं। फिश को आमतौर पर माइटोटिक या मियोटिक क्रोमोसोम को उजागर करने के लिए प्रजनन अंगों के विघटन की आवश्यकता होती है और फ्लोरोसेंट जांच के साथ विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों के धुंधला होने की अनुमति मिलती है। डब्ल्यूफिश टेस्टिस की मूल साइटोलॉजिकल संरचना के संरक्षण को सक्षम बनाता है, जो दोहराए जाने वाले डीएनए अनुक्रमों को लक्षित करने वाले फ्लोरोसेंट जांच से सिग्नल का पता लगाने के अच्छे स्तर के साथ युग्मित होता है। यह शोधकर्ताओं को अंग की संरचना के साथ अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरने वाली कोशिकाओं के क्रोमोसोमल व्यवहार में परिवर्तन का पालन करने की अनुमति देता है, जहां प्रक्रिया के प्रत्येक चरण को स्पष्ट रूप से अलग किया जा सकता है। यह तकनीक विशेष रूप से क्रोमोसोम मियोटिक पेयरिंग का अध्ययन करने और साइटोलॉजिकल फेनोटाइप्स की जांच करने के लिए उपयोगी हो सकती है, उदाहरण के लिए, सिंथेटिक लिंग अनुपात विकृत, संकर पुरुष बाँझपन, और शुक्राणुजनन में शामिल जीन के नॉक-आउट।

Introduction

मलेरिया वैश्विक मानव आबादी के स्वास्थ्य और कल्याण पर एक बड़ा बोझ डालता है। 2021 में, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ने अनुमान लगाया कि मलेरिया के कारण 619,000 मौतें हुईं, जिनमें से 96% उप-सहारा अफ्रीका1 में हुईं। यह रोग एनोफिलीज जीनस से संबंधित मच्छरों द्वारा फैलता है, और उप-सहारा अफ्रीका में, तीन प्रजातियां, अर्थात् एनोफिलीज गैम्बिया (एन गैम्बिया), एनोफिलीज कोलुज़ी (एन, कोलुज़ी) और एनोफिलीज अरेबिएन्सिस (एन. अरेबिएन्सिस) की मलेरिया संचरण में असमान रूप से बड़ी भूमिका है, जो विश्व स्तर पर मलेरिया के 95% मामलों के लिए जिम्मेदार है। कीटनाशकों और एंटीमलेरियल दवाओं जैसे पारंपरिक तरीकों पर निर्भर नियंत्रण कार्यक्रमों ने लाखों लोगों की जान बचाई है; हालांकि, हाल के वर्षों में, इन नियंत्रण विधियों के बढ़ते प्रतिरोध ने उनकी प्रभावकारिता 1,2 को चुनौती दी है। इसके अलावा, कोविड-19 महामारी द्वारा लगाए गए प्रतिबंधों ने प्रमुख मलेरिया नियंत्रण हस्तक्षेपों की उपलब्धता को प्रभावित किया है, जो 2022 डब्ल्यूएचओ विश्व मलेरिया रिपोर्ट के अनुसार, मलेरिया की घटनाओं में वृद्धि हुईहै। पिछले दो दशकों में, एनोफिलीज मच्छरों 3,4,5,6,7,8,9,10 को लक्षित करने के लिए प्रयोगशाला सेटिंग्स में नवीन आनुवंशिक नियंत्रण विधियों को विकसित किया गया है। इन रणनीतियों में, जीन ड्राइव सिस्टम (जीडीएस) और सिंथेटिक लिंग अनुपात विकृतियों (एसडी) पर आधारित जो आशाजनक लगते हैं। जीडीएस बहुत उच्च आवृत्ति पर, एक आनुवंशिक संशोधन प्रसारित करने की संभावना पर भरोसा करते हैं जो महिला प्रजनन क्षमता को प्रभावित करता है या मच्छर 5,11,12 में परजीवी जीवन चक्र को बाधित करता है। एसडी, इसके बजाय, एक मच्छर वंश के लिंग अनुपात को पुरुषों की ओर मोड़कर कार्य करते हैं, जो समय के साथ, महिलाओं की कमी के कारण लक्षित आबादी के पतन की ओर जाता है। इन आनुवंशिक प्रणालियों के मुख्य घटक मुख्य रूप से मच्छरों के प्रजनन अंगों पर कार्य करते हैं, जहां युग्मक, अंडे और शुक्राणु का उत्पादन मीओटिक डिवीजन14 के बाद होता है।

इस प्रोटोकॉल में, साइटोजेनेटिक तकनीकों में प्रगति को एन गाम्बिया में शुक्राणुजनन का पता लगाने के लिए नियोजित किया जाता है, जो सीटू में गुणसूत्रों के व्यवहार पर ध्यान केंद्रित करता है।मच्छर वृषण की संरचना और इसके भीतर होने वाली जैविक प्रक्रियाओं की जांच पहले कई साइटोलॉजिकल विधियों का उपयोग करके की गई है, जैसे कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ट्रांसजेनेस, और डीएनए और आरएनए फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) 15,16,17,18,19,20।; अंग एक स्पिंडल जैसी आकृति दिखाते हैं, जिसमें निचला ध्रुव पुरुष सहायक ग्रंथियों से जुड़े एक डेफरेंट डक्ट से जुड़ा होता है। ऊपरी ध्रुव में, जर्मलाइन स्टेम कोशिकाएं दैहिक कोशिकाओं द्वारा गठित शुक्राणुओं के अंदर एम्बेडेड शुक्राणुकोशिकाओं में प्रसार और अंतर करती हैं। माइटोटिक विभाजन के कई दौर के बाद, शुक्राणुजनन शुक्राणुकोशिकाओं में अंतर करते हैं, जो अर्धसूत्रीविभाजन में प्रवेश करते हैं। प्रोफ़ेज़ में, ऑटोसोम और सेक्स क्रोमोसोम अपने होमोलॉग के साथ जुड़ते हैं, और क्रॉसिंग होती है। मियोटिक विभाजन के बाद, गोल अगुणित शुक्राणु उत्पन्न होते हैं और शुक्राणुजनन में प्रवेश करते हैं, और इस प्रक्रिया से परिपक्व अगुणित शुक्राणुओं का निर्माण होता है जिसमें साइटोप्लाज्म को हटा दिया गया है, परमाणु क्रोमैटिन संघनित हो जाता है, और फ्लैगेला नाभिक21,22 के बेसल भाग में उभरता है (चित्रा 1 और चित्रा 2)।

सामान्य तौर पर, शुक्राणुजनन मध्य-प्यूपल चरण के आसपास शुरू होता है, और शुक्राणु जलाशय23 में देर से प्यूपल चरण में परिपक्व शुक्राणुजनन का पता लगाया जा सकता है। शुक्राणुओं की परिपक्वता प्रक्रिया वयस्क जीवन23,24,25 के दौरान जारी रहती है। एनोफिलीज वृषण में, शुक्राणुजनन के प्रत्येक चरण को प्रत्येक शुक्राणुजनन में कोशिकाओं की परमाणु आकृति विज्ञान को देखकर आसानी से पहचाना जा सकता है (चित्रा 2)। इस प्रोटोकॉल में वर्णित होल-माउंट फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (डब्ल्यूफिश), शोधकर्ताओं को विशेष रूप से एक क्रोमोसोमल क्षेत्र को लेबल करने और अंग और कोशिका नाभिक की स्थिति की मूल संरचना को संरक्षित करते हुए शुक्राणुजनन के दौरान इसे ट्रैक करने की अनुमति देता है; यह मानक डीएनए फिश प्रोटोकॉल की तुलना में एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें अंग को आमतौर पर स्क्वैश किया जाता है, जिससे ऊतक क्षतिहोती है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग सेक्स क्रोमोसोम पर दोहराए जाने वाले अनुक्रमों को दागने के लिए किया जाता है और इस प्रकार, शुक्राणुजनन के दौरान उनके व्यवहार को ट्रैक किया जाता है, द्विगुणित विभाजित कोशिकाओं से परिपक्व अगुणित शुक्राणुओं तक। डब्ल्यूफिश विशेष रूप से सेक्स क्रोमोसोम मियोटिक पेयरिंग का अध्ययन करने और साइटोलॉजिकल फेनोटाइप्स की जांच करने के लिए उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए, सिंथेटिक लिंग अनुपात विकृत, संकर पुरुष बाँझपन, और शुक्राणुजनन में शामिल जीन के नॉक-आउट 4,19,26,27।

मलेरिया वैक्टर के रूप में उनकी भूमिका को देखते हुए, एनोफिलीज मच्छर आनुवंशिक वेक्टर नियंत्रण रणनीतियों की बढ़ती संख्या का लक्ष्य हैं, जो अक्सर इन जीवों के प्रजनन अंगों में कार्य करते हैं। कई मच्छर उत्परिवर्ती और साइटोलॉजिकल फेनोटाइप उत्पन्न किए गए हैं जिनके लिए 26,27,28,29 की जांच करने के लिए नवीन साइटोलॉजिकल तकनीकों की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन में वर्णित विधि शुक्राणुजनन की समझ पर प्रकाश डालती है, साथ ही आनुवंशिक रणनीतियों के पीछे साइटोलॉजिकल तंत्र जो मलेरिया-संचारित मच्छरों को नियंत्रित करने की क्षमता रखते हैं।

Protocol

1. डीएनए जांच लेबलिंग

नोट: फ्लोरोसेंट डीएनए जांच उत्पन्न करने के लिए नीचे तकनीकी कदम दिए गए हैं जो विशेष रूप से एन गैम्बिया मच्छरों के सेक्स क्रोमोसोम को लेबल करते हैं।

  1. पीसीआर का उपयोग करके जांच लेबलिंग
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके एक्स या वाई क्रोमोसोम को लेबल करने के लिए प्यूपे या वयस्क पुरुषों से जीनोमिक डीएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें: जीनोमिक डीएनए का 200 एनजी, 0.05 एमएम अनलेबल न्यूक्लियोटाइड (डीएटीपी, डीसीटीपी, डीजीटीपी), 0.015 एमएम डीटीटीपी, और फ्लोरोसेंटली लेबल डीयूटीपी का 1 यूएल (Cy3, Cy5, या एक और फ्लोरोक्रोम), फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर का 50 pmol (तालिका 1), 10x पीसीआर-बफर का 5 μL, और टैक डीएनए पोलीमरेज़ का 10 U ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. 18S rDNA और उपग्रह AgY53B (तालिका 1) को लेबल करने के लिए, निम्नलिखित पीसीआर मापदंडों का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रिया करें: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस का एक चक्र; 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 सेकंड के लिए 52 डिग्री सेल्सियस और 45 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस का एक चक्र; और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम पकड़।
      नोट: पीसीआर लेबलिंग विधि (~ 1 μg in 5 μL) के साथ एक अच्छी जांच एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, जो एक सफल WFISH के लिए महत्वपूर्ण है, पीसीआर प्रतिक्रिया अत्यधिक कुशल होनी चाहिए। इस कारण से, जांच को लेबल करने से पहले, प्रवर्धन के लिए चुने गए प्राइमरों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने का दृढ़ता से सुझाव दिया जाता है। इसके अलावा, पीसीआर प्रतिक्रिया में एक सकारात्मक नियंत्रण (फ्लोरोसेंट डीयूटीपी के बिना) को शामिल करने से लेबलिंग प्रतिक्रिया की प्रभावकारिता को सत्यापित करने में मदद मिलेगी।
    4. एक अंधेरी जगह में -20 डिग्री सेल्सियस पर जांच स्टोर करें।
  2. 3 'एंड फ्लोरोसेंट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच प्राप्त करना।
    1. न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के 3 'अंत में Cy3 या Cy5 फ्लोरोक्रोम (या किसी अन्य फ्लोरोक्रोम) को जोड़कर संशोधित ऑलिगोस के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)। वाई-लिंक्ड उपग्रह AgY477-AgY53B जंक्शन क्षेत्र और Contig_240 से एक्स-लिंक्ड उपग्रह को लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले संदर्भ अनुक्रमों के लिए तालिका 1 में प्राइमर / ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड देखें।
      नोट: 3 'एंड-लेबल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की एकाग्रता से संबंधित कोई तकनीकी बाधाएं नहीं हैं, क्योंकि उपयोगकर्ता आमतौर पर खरीद से पहले इसे चुन सकता है। हम ऑलिगो जांच का उपयोग करके कुशल लेबलिंग के लिए संकरण बफर में ~ 800 एनजी ऑलिगो जांच समाधान को पतला करने का सुझाव देते हैं। एक्स- और वाई-विशिष्ट ऑलिगो-प्रोब का उपयोग पहले लियांग और शाराखोव19 द्वारा डब्ल्यूफिश के लिए किया गया है, और संदर्भ अनुक्रम तालिका 1 में पाया जा सकता है।

2. संकरण समाधान की तैयारी

नोट: चरण 1 में उत्पन्न फ्लोरोसेंट जांच को एक रासायनिक समाधान में शामिल किया जाना चाहिए जो लक्ष्य अनुक्रमों के साथ संकरण करता है।

  1. सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति से पहले जांच वर्षा।
    1. 1.5 एमएल ट्यूब में, सैल्मन शुक्राणु डीएनए के चरण 1 और 5 μL से लेबल डीएनए जांच (यदि पीसीआर-लेबलिंग विधि द्वारा प्राप्त किया जाता है) या 3' संशोधित ऑलिगो जांच (~ 800 एनजी जांच का ~ 800 एनजी) का 2.2 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक ही ट्यूब में विभिन्न जीनोमिक क्षेत्रों के लिए विशिष्ट जांच को मिलाएं, और उन्हें निम्नलिखित चरणों में एक अद्वितीय समाधान के रूप में उपयोग करें।
    2. 3 एम सोडियम एसीटेट की 0.1 मात्रा और 100% इथेनॉल के 2 वॉल्यूम जोड़कर डीएनए जांच को अवक्षेपित करें। कम से कम 2.5 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें (-20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन का समय बढ़ाने से अंतिम उपज में वृद्धि होगी)। इस स्तर पर, सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले जांच को रात भर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 17,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज, इथेनॉल को हटा दें, और ~ 20 मिनट के लिए अंधेरे में आरटी पर गोली को हवा में सुखाएं।
  2. हाइब्रिडाइजेशन समाधान
    1. वृषण विच्छेदन (चरण 3) के साथ आगे बढ़ने से पहले, 1.5 ट्यूब में निम्नलिखित अभिकर्मकों को मिलाकर संकरण बफर तैयार करें: 500 μL फॉर्मामाइड, 0.2 ग्राम डेक्सट्रान सल्फेट, 100 μL 20x सोडियम खारा साइट्रेट (एसएससी), और 200 μL बाँझ H20 ( सामग्री की तालिका देखें)। 1 मिनट के लिए संकरण समाधान को भंवर करें, और डेक्सट्रान सल्फेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर घुलने दें।
    2. संकरण समाधान प्राप्त करने के लिए संकरण बफर के 20-30 μL में चरण 2.1.3 से गोली को घोलें (लगभग 1 मिनट के लिए भंवर, एक त्वरित स्पिन करें, और ट्यूबों को अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें)।

3. वृषण विच्छेदन और निर्धारण

  1. कमरे के तापमान (आरटी) पर, बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) घोल में प्यूपे या 1 दिन के वयस्कों से कम से कम ~ 20 वृषण विच्छेदन करें, और उन्हें 1x PBS समाधान की एक ताजा बूंद युक्त एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करें।
  2. पी 1,000 वाइड-बोर फ़िल्टर ्ड टिप या 1x पीबीएस से विच्छेदन सुई की नोक का उपयोग करके वृषण को एक भ्रूण डिश में स्थानांतरित करें, जिसमें 0.1% ट्वीन -20 (पीबीएसटी) के साथ 1x पीबीएस में 3.7% फॉर्मलाडेहाइड होता है, और आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. वृषण को 1x PBST में 5 मिनट के लिए RT पर धो लें। वृषण को 0.1 mg/mL RNAse A (सामग्री की तालिका देखें) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए बाँझ 1x PBS में पतला करें।
  4. आरएनएस समाधान को निकालें, मर्मज्ञ समाधान जोड़ें (1x PBST में 1% ट्राइटन / 0.1 M HCl), और 10 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रोटीनेस के का उपयोग वृषण के परमेबिलाइजेशन को बढ़ाने के लिए 1x PBST में 10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता पर एक मर्मज्ञ एजेंट के रूप में किया जा सकता है।
  5. 1x PBST में वृषण को दो बार आरटी पर 5 मिनट के लिए धोएं।

4. संकरण

नोट: यह खंड सीटू संकरण के लिए अंतिम चरणों का वर्णन करता है।

  1. धोने के चरण (चरण 3.5) के बाद, वृषण को 1.5 एमएल ट्यूब में 20-30 μL संकरण समाधान के साथ स्थानांतरित करें जिसमें पहले से तैयार जांच (चरण 2.2.2) शामिल है। घोल को धीरे से मिलाने के लिए पिपेट की नोक का उपयोग करें। अगले चरणों में जाने से पहले धीरे से ट्यूब को पांच बार फ्लिक करें।
  2. डीएनए विकृतीकरण के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. डीएनए-डीएनए संकरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (यदि संभव हो, 100 आरपीएम से कम पर रॉकिंग के साथ) पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. वृषण को पी 1,000 वाइड-बोर फ़िल्टर ्ड टिप का उपयोग करके भ्रूण डिश में वापस स्थानांतरित करें, और उन्हें 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके 2x एसएससी में धो लें।
    नोट: संकरण चरण के बाद, 2x SSC का उपयोग करके एक अंतिम धोने का चरण आवश्यक है; यह अंग ऊतक के अंदर असंकरित जांच की उपस्थिति के कारण किसी भी पृष्ठभूमि संकेत को हटाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यदि एक मजबूत पृष्ठभूमि संकेत मौजूद है, तो अंतिम धोने के चरण को दोहराने की सिफारिश की जाती है।
  5. 2x SSC को निकालें, और एक फ्रॉस्टेड ग्लास स्लाइड पर 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (DAPI) (सामग्री की तालिका देखें) के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउंटिंग माध्यम का उपयोग करके वृषण को माउंट करें, कवरस्लिप सीलेंट के साथ सील करें, और अंधेरे में आरटी पर कम से कम 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. कॉन्फोकल इमेजिंग करें। पूरे वृषण को 40x या 63x तेल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। यदि एक जेड-स्टैक किया जाता है, तो हम 1.25 μm के z-step का उपयोग करने का सुझाव देते हैं।

Representative Results

इस काम में, डब्ल्यूफिश का उपयोग एन गाम्बिया में शुक्राणुजनन के दौरान गुणसूत्र व्यवहार की जांच करने के लिए किया गया था। इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम वृषण प्राप्त करना है जो विच्छेदन के बाद रूपात्मक परिवर्तन का निम्न स्तर दिखाता है। एक सफल वृषण विच्छेदन करने के लिए मच्छर शरीर रचना विज्ञान का बुनियादी ज्ञान आवश्यक है, और नीचे, इस प्रक्रिया के लिए कुछ मार्गदर्शन दिए गए हैं। एनोफिलीज मच्छर में, परिपक्व वृषण प्यूपल और वयस्क चरण21 के छठे पेट खंड में पड़े हुए पाए जा सकते हैं। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, वास डेफरेंस वृषण को पुरुष सहायक ग्रंथियों (एमएजी) से जोड़ता है, जो पेट के अंतिम खंड में स्थित होते हैं। एमएजी एक अद्वितीय स्खलन वाहिनी से जुड़े होते हैं जो शुक्राणुओं और सेमिनल तरल पदार्थों को संभोग अंग और पुरुष जननांग तंत्र के बाहरी हिस्से में पहुंचाताहै। मच्छर के जीवन चरण के आधार पर विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके पूरे आंतरिक पुरुष जननांग तंत्र को विच्छेदित किया जा सकता है। प्यूपल चरण के दौरान, छठे खंड की निकटता में पेट के उदर पक्ष को देखकर प्रकाश छल्ली में स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके वृषण को आसानी से पहचाना जा सकता है (चित्र 1)। वृषण को विच्छेदित करने के लिए, छठे खंड सहित पेट के निचले हिस्से को सुइयों की एक जोड़ी का उपयोग करके शरीर के बाकी हिस्सों से अलग किया जा सकता है और 1x पीबीएस की एक साफ बूंद में स्थानांतरित किया जा सकता है। अंतिम खंड को हटाने के बाद, विच्छेदन सुइयों के साथ कोमल दबाव लागू करके पूरे तंत्र को पेट से बाहर निकाला जा सकता है। वयस्क पुरुषों से वृषण को विच्छेदित करने के लिए, पहले चरण में पूरे पेट को 1x PBS की एक ताजा बूंद में अलग करना और फिर बाहों को ले जाने वाले अंतिम खंड को बाहर निकालना शामिल है, जो पुरुष संभोग संरचनाएं हैं (चित्रा 1)। इस बिंदु पर, एमएजी का निचला हिस्सा उभरना चाहिए और उनके पीले रंग के कारण आसानी से पहचाना जाना चाहिए। पूरे पुरुष तंत्र को धीरे-धीरे 1x पीबीएस की एक बूंद में सुई या बल की मदद से बाहर निकाला जा सकता है जब तक कि वास डेफरेंस से जुड़े वृषण की जोड़ी दिखाई न दे। निर्धारण के साथ आगे बढ़ने से पहले, वास डेफरेंस के निचले हिस्से की निकटता में कटौती करके पुरुष तंत्र के अन्य भागों से वृषण को अलग करना महत्वपूर्ण है (चित्र 1)।

जांच के तहत शुक्राणुजनन चरण के आधार पर विचार करने के लिए प्यूपे या वयस्क पुरुषों की उम्र एक महत्वपूर्ण कारक है। गैम्बिया में, शुक्राणुजनन प्रारंभिक / मध्य-प्यूपल चरण में शुरू होता है, औरयह व्यक्ति के पूरे जीवन में जारी रहता है। प्यूपेशन के 3 घंटे से 10 घंटे के बीच, प्रीमियोटिक और मियोटिक चरणों को वृषण (मियोटिक प्रोफेज, मियोटिक डिवीजन) में अधिक दर्शाया जाता है, शुक्राणुडीएनए अपेक्षाकृत संघनित होता है, और परिपक्व शुक्राणु अभी तक नहीं बने हैं। देर से प्यूपे और 1 दिन के वयस्क प्रीमियोटिक, मियोटिक और पोस्ट-मियोटिक चरणों (चित्रा 2 और चित्रा 3) के बीच एक अच्छा संतुलन प्रदान करते हैं। 4 दिनों से अधिक उम्र के वयस्कों में, प्रीमियोटिक चरणों और शुक्राणुओं का कम प्रतिनिधित्व किया जाता है, और वृषण मुख्य रूप से शुक्राणु जलाशय में निहित परिपक्व शुक्राणुओं द्वारा कब्जा कर लिया जाता है।

शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों के दौरान सेक्स क्रोमोसोम के व्यवहार की जांच करने के लिए, पूरी प्रक्रिया का अच्छा प्रतिनिधित्व सुनिश्चित करने के लिए देर से प्यूपल चरण में विच्छेदित वृषण पर डब्ल्यूफिश किया गया था। इन गुणसूत्रों के व्यवहार का पालन करने के लिए, एक्स या वाई क्रोमोसोम पर विशेष रूप से स्थित दोहराए जाने वाले अनुक्रमों के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग किया गया था। फ्लोरोसेंट जांच पीसीआर का उपयोग करके उत्पन्न की जा सकती है या व्यावसायिक रूप से 3 'एंड-लेबल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रूप में प्राप्त की जा सकती है। फ्लोरोसेंट ऑलिगो जांच से अच्छे सिग्नल का पता लगाने की अनुमति देने के लिए >40 बीपीएस की लंबाई के साथ एक ऑलिगो का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। हमारे अनुभव में, सिग्नल डिटेक्शन के मामले में पीसीआर-लेबल वाले प्रोब की तुलना में 3 'एंड-लेबल ऑलिगोबेहतर प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, लक्ष्य अनुक्रम की प्रतिलिपि संख्या एक कारक है जो WFISH की प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकती है। यदि लेबलिंग असफल है, तो एक लंबे टुकड़े पर पीसीआर लेबलिंग विधि का उपयोग करना या लक्ष्य क्षेत्र के लिए विशिष्ट कई ऑलिगोडिज़ाइन करने का सुझाव दिया जाता है।

एक मर्मज्ञ समाधान (1x PBST में 1% Triton/ 0.1 M HCl) का उपयोग करने के आधार पर वर्तमान विधियां, जांच के टेस्टिस परमेबिलाइजेशन और प्रवेश के अच्छे स्तर की अनुमति देती हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक सफल संकरण प्रतिक्रिया होती है। सेक्स क्रोमोसोम दोहराव वाले अनुक्रमों के लिए विशिष्ट ओलिगो जांच को हॉल एट अल .20 द्वारा किए गए दोहराए जाने वाले तत्वों के व्यापक लक्षण वर्णन के आधार पर डिज़ाइन किया जा सकता है। इसके अलावा, एक्स- या वाई-लिंक्ड दोहराए जाने वाले तत्वों के लिए विशिष्ट आम सहमति अनुक्रम ों को रेडकेमर पाइपलाइन30 जैसे जैव सूचना विज्ञान मंच का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सेक्स क्रोमोसोम जांच उपग्रहों और रेट्रोट्रांसपोसन जैसे दोहराए जाने वाले तत्वों को लक्षित कर सकती है, और उनके पास परीक्षण20,31,32 के तहत प्रजातियों के आधार पर एक्स या वाई क्रोमोसोम के साथ संकरण का एक अलग स्तर हो सकता है। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, जांच के संकरण का एक अच्छा स्तर और कम पृष्ठभूमि ने शुक्राणुजनन के दौरान लक्षित गुणसूत्रों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति दी। लेबल किए गए सेक्स क्रोमोसोम की जोड़ी को प्रीमियोटिक और मियोटिक चरणों में देखा जा सकता है। इसके बाद मीओटिक विभाजन ों के परिणामस्वरूप अगुणित कोशिका नाभिक गुणसूत्रों में एक्स या वाई गुणसूत्रों का पता लगाया गया। इसके बाद, एक्स- या वाई-असर वाले शुक्राणुओं का पालन शुक्राणुजनन के दौरान किया जा सकता है, जो डीएनए संघनन के विभिन्न स्तरों द्वारा चिह्नित होता है, तीर के आकार के परिपक्व शुक्राणु के अंतिम चरण तक। वर्तमान प्रयोगात्मक सेटअप में, इस प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं के 3 डी स्थानिक संगठन के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल जेड-स्टैक्स का उपयोग किया गया था (वीडियो 1)।

Figure 1
चित्र 1: प्यूपे और 1 दिन के वयस्क एनोफिलीज गैम्बिया पुरुषों से विच्छेदित वृषण। (ए) पेट के अंतिम चरण में विच्छेदित एक पेट जो छठे उदर खंड की निकटता में वृषण की स्थिति को दर्शाता है। वृषण को पूरे छल्ली में पहचाना जा सकता है और पेट के दोनों किनारों (तीर ों के साथ) पर भूरे रंग की संरचनाओं के रूप में दिखाई देता है। (बी) प्यूपल चरण में विच्छेदित वृषण, परिपक्व वृषण (1), वास डेफेरेंस (2), एमएजी (3), और स्खलन वाहिनी (4) दिखाते हैं। (सी) बेसल कैक्स सेगमेंट को हटाने के बाद 1 दिन के वयस्क पुरुष से एक पेट विच्छेदित किया गया। एमएजी को कोमल दबाव (सफेद तीर) लगाकर पेट से निकाला जा सकता है। (डी) पुरुष आंतरिक प्रजनन तंत्र 1 दिन के वयस्क पुरुष से विच्छेदित होता है। सफेद तीर परिपक्व शुक्राणुओं द्वारा कब्जा की गई स्थिति को इंगित करता है, जो वृषण के बेसल ध्रुव पर एक सफेद समुच्चय के रूप में दिखाई देते हैं। स्केल बार: (ए, सी) 200 μm; (बी, डी) 100 μm. I से VIII तक के रोमन अंक पेट के खंडों को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एनोफिलीज गैम्बिया में शुक्राणुजनन का प्रतिनिधित्व।बाईं ओर की छवि में पूरे माउंट डीएपीआई धुंधला होने के बाद एन गाम्बिया लेट प्यूपा टेस्टिस दिखाई दे रहा है। दाईं ओर बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक योजनाबद्ध संस्करण है। परमाणु आकार और संक्षेपण स्तर का अवलोकन करके, द्विगुणित कोशिकाओं से अगुणित शुक्राणुओं तक सभी शुक्राणुजनन चरणों का पालन करना अपेक्षाकृत आसान है। स्टेम सेल आला अंग के ऊपरी ध्रुव में स्थित है, जहां शुक्राणुओं में भेदभाव शुरू होता है। माइटोटिक विभाजन (हरी कोशिकाओं) के बाद शुक्राणुकोशिकाओं की संख्या में वृद्धि होती है, और शुक्राणुओं के आकार (पीली कोशिकाओं) में वृद्धि होती है। शुक्राणुकोशिकाएं माइटोटिक विभाजन (नीली कोशिकाओं) के कई दौर के बाद शुक्राणुकोशिकाओं में अंतर करती हैं। शुक्राणुकोशिकाएं, जो प्रक्रिया के अन्य चरणों की कोशिकाओं की तुलना में अपेक्षाकृत बड़े नाभिक की विशेषता हैं, कोशिकाएं हैं जो मियोटिक विभाजन से गुजरेंगी। अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरने वाली कोशिकाओं को विभिन्न मियोटिक चरणों में गुणसूत्रों की उपस्थिति को देखकर पता लगाया जा सकता है; कम आवर्धन पर भी चियास्माटा और मेटाफ़ेज़ क्रोमोसोम का पता लगाया जा सकता है। प्रारंभिक प्यूपल चरण में विच्छेदित वृषण में प्रीमियोटिक चरणों को अधिक दर्शाया जाता है। पहले और दूसरे मियोटिक विभाजन के बाद, शुक्राणुओं का उत्पादन होता है और आमतौर पर वृषण के बीच में पड़े हुए पाया जा सकता है। शुक्राणुओं के नाभिक अपने आकार में एक निश्चित डिग्री की भिन्नता दिखाते हैं, एक गोल से तीर जैसी आकृति तक। शुक्राणुजनन प्रक्रिया में प्रवेश करते हैं, जिसके दौरान नाभिक संघनित होने लगते हैं, और उनकी संरचना तीर जैसे बिंदुओं में बदल जाती है। जब मच्छर उभरने के बाद यौन रूप से परिपक्व होते हैं, तो परिपक्व शुक्राणुओं वाले शुक्राणु विकास के एक अलग चरण में शुक्राणुओं की कीमत पर वृषण की मात्रा के अधिकांश हिस्से पर कब्जा कर सकते हैं। स्केल बार: 20 μm. तारांकन (*) वृषण के एपिकल भाग को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एन गैम्बिया टेस्टिस पर डब्ल्यूफिश को देर से प्यूपल चरण से विच्छेदित किया जाता है। WFISH को X (Contig_240) और Y (AgY53B के लिए विशिष्ट ऑलिगो प्रोब) गुणसूत्रों के लिए विशिष्ट जांच का उपयोग करके किया गया था। (ए) डब्ल्यूफिश शुक्राणुजनन के दौरान द्विगुणित कोशिकाओं से अगुणित शुक्राणुजनन के दौरान सेक्स क्रोमोसोम के व्यवहार का पालन करने की अनुमति देता है। इस छवि में, शुक्राणुजनन के दौरान नाभिक से गुजरने वाले नाटकीय परिवर्तनों की सराहना करना संभव है। सेक्स क्रोमोसोम को लेबल करना द्विगुणित और अगुणित कोशिकाओं के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। द्विगुणित कोशिकाओं में, सेक्स क्रोमोसोम से संकेत एक ही नाभिक से जुड़ा होता है। अगुणित कोशिकाओं (शुक्राणुओं और शुक्राणुजनों) में, सेक्स क्रोमोसोम का संकेत मियोटिक रिडक्शनल डिवीजन के कारण असंबद्ध होता है। (बी, सी) वृषण की एक उच्च-आवर्धन (63x) छवि (A) में दिखाई गई है। उन्हें जेड-अक्ष के साथ विभिन्न पदों पर अधिग्रहित किया गया था। सफेद बिंदीदार फ्रेम अधिग्रहण के क्षेत्र को इंगित करते हैं। (बी) शुक्राणुकोशिकाओं और शुक्राणुओं के बीच संक्रमण चरण, अगुणित कोशिकाओं के गठन और सेक्स क्रोमोसोम से संकेतों को अलग-अलग नाभिक में अलग करने को दर्शाता है। (सी) अगुणित शुक्राणुओं और परिपक्व शुक्राणुओं के बीच संक्रमण चरण। यह चरण परमाणु संघनन स्तर में परिवर्तन को दर्शाता है; परिपक्व शुक्राणु शुक्राणुओं की तुलना में अधिक संघनित और लम्बी आकृति दिखाते हैं। स्केल सलाखों: (ए), 30 μm; (बी, सी), 10 μm; ग्रे: DAPI. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

लक्ष्य अनुक्रम प्राइमर अनुक्रम और ओलिगो-जांच आम सहमति संदर्भ
Contig_240 (X) 5'-CAATAAATTTTTTTTTTTATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3'-[फ्लोरोक्रोम]		 19
AgY53B (Y) 5'AGAATAGAATCATAGTAGCGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[फ्लोरोक्रोम]		 यह अध्ययन
AgY477-
AgY53B
जंक्शन
क्षेत्र (Y)		 5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT
GAAGAAACCACTATTC-3'-[फ्लोरोक्रोम]		 19
18S rDNA (X) एफ: एएसीटीजीजीजीएएएएजीसीएजीएजीएजीसी
आर: TCCACTTGATCTTTGCAAAA		 19
AgY53B (Y) एफ: सीसीटीटीटीएएएसीएसीएसीएएटीटी
आर: जीटीटीसीटीसीटीसीटीसीसीटीटीएएजीसीसीटैग		 19

तालिका 1: एन गाम्बिया में एक्स या वाई क्रोमोसोम के लिए विशिष्ट ऑलिगो जांच की सूची।

वीडियो 1: डब्ल्यूफिश पर एक 3 डी स्टैक का प्रदर्शन एन गाम्बिया टेस्टिस पर किया गया था, जिसे देर से प्यूपल चरण से विच्छेदित किया गया था। शुक्राणुजनन प्रक्रिया का 3 डी प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए, संरचनात्मक परिवर्तनों की कम संख्या दिखाते हुए वृषण पर एक कॉन्फोकल 3 डी स्टैक किया जा सकता है। इस अध्ययन में, कोशिकाओं के 3 डी स्थानिक संगठन के बारे में जानकारी न खोने के लिए 63x या 40x तेल लेंस के तहत दो ऑप्टिकल वर्गों के बीच 1.25 μm के अंतराल के साथ ढेर का प्रदर्शन किया गया था। ग्रे: DAPI, पीला: Contig_240 (X), मैजेंटा: AgY53B (Y)। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

आमतौर पर, फिश प्रोटोकॉल को क्रोमोसोम धुंधला करने की अनुमति देने के लिए रुचि के अंग के स्क्वैश की आवश्यकता होती है। यह उस अंग के भीतर कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्था के बारे में जानकारी के नुकसान का कारण बनताहै। यह प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे जैविक प्रक्रियाओं, जैसे शुक्राणुजनन, वृषण की बरकरार मूल संरचना और इसके आंतरिक साइटोलॉजिकल संगठन को बनाए रखते हुए सीटू में अध्ययन किया जा सकता है। विभिन्न डीएनए दोहराव वाले तत्वों को लक्षित करने वाली जांच, जो विशेष रूप से सेक्स क्रोमोसोम20 में समृद्ध होती है, का उपयोग शुक्राणु परिपक्वता की गतिशीलता को प्रकट करने के लिए एक साथ किया जा सकता है। वृषण विच्छेदन के समय के आधार पर, डब्ल्यूफिश मच्छर के विकास के माध्यम से शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। डब्ल्यूफिश हाइब्रिड असंगति जैसी विशिष्ट घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, जो एनोफिलीज मच्छरों में, मियोटिक दोषों की उपस्थिति के कारण होता है जैसे कि प्रीमियोटिक विफलता और सेक्स क्रोमोसोम नॉन-डिसजंक्शन 19,34,35। जैविक पहलू के अलावा, शुक्राणुजनन कई आनुवंशिक रणनीतियों का लक्ष्य है जो कीट कीड़ों जैसे एनोफिलीज मच्छरों को नियंत्रित करने के लिए विकसित किया गया है। इस संदर्भ में, एन गाम्बिया के एक्स-लिंक्ड आरडीएनए लोकस का उपयोग सिंथेटिक लिंग अनुपात विकृत करने वाले को विकसित करने के लिए एक लक्ष्य के रूप में किया गया है, जो एक्स-असर शुक्राणुओं को नुकसान पहुंचाकर, संतान को पुरुषों 4,8,13 के प्रति पूर्वाग्रह करता है।

यह तकनीक प्राकृतिक लिंग अनुपात मिओटिक ड्राइव की कार्रवाई को प्रतिबिंबित करती है जिसे मच्छरों सहित कई टैक्सों में पहचाना गया है, लेकिन यह अभी भी खराब समझा जाता है 28,36,37,38,39,40,41। WFISH इस घटना की जांच करने का अवसर प्रदान करता है और उदाहरण के लिए, सेक्स विरूपण-आधारित आनुवंशिक रणनीतियों को परिष्कृत या सुधारने का मार्ग प्रशस्त करता है, उदाहरण के लिए, सेक्स क्रोमोसोम श्रेडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले लक्ष्य साइटों की पसंद से शुक्राणु उत्पादन की कोशिका विज्ञान कैसे प्रभावित होता है। हालांकि, हमारे अनुभव में, WFISH सफलता की उच्च संभावना दिखाता है, विफलता अभी भी हो सकती है। यह ऊतक परमेबिलाइजेशन के एक अक्षम स्तर के कारण हो सकता है, जिसे मर्मज्ञ समाधान के इनक्यूबेशन समय को बढ़ाकर दूर किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रोटीनेस के का उपयोग परमेबिलाइजेशन चरण के दौरान किया जा सकता है। कुछ मामलों में, हमने जांच प्रवेश का एक गैर-समान स्तर देखा, जिसमें शुक्राणुकोशिकाओं के नाभिक में उच्च संकेत और मियोटिक और शुक्राणुजनन चरणों में कम या अनुपस्थित संकेत थे। यह सेल चरण के आधार पर परमेबिलाइजेशन स्तर में अंतर के कारण हो सकता है। इसके अलावा, उच्च प्रतिलिपि संख्या में मौजूद डीएनए अनुक्रमों को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए फ्लोरोसेंट प्रोब का उपयोग करते समय डब्ल्यूफिश मूल्यवान साबित हुआ। एकल-प्रतिलिपि जीन को लक्षित करते समय, सिग्नल का पता लगाना पर्याप्त नहीं हो सकता है। इस मामले में, सिग्नल प्रवर्धन के तरीके, जैसे टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए), को एकीकृत किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल को इम्यूनोस्टेनिंग या ट्रांसजेनिक रिपोर्टर उपभेदों के साथ जोड़ा जा सकता है जो जर्मलाइन-विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर16,18 को परेशान करते हैं, क्योंकि यह प्रोटीन स्थानीयकरण और सीटू में जीन अभिव्यक्ति के बारे में जानकारी जोड़ देगा।इस काम में, डब्ल्यूफिश को एनोफिलीज मच्छरों में शुक्राणुजनन की जांच करने के लिए एक तकनीक के रूप में वर्णित किया गया है; हालांकि, पुरुष प्रजनन अंगों की साझा शारीरिक रचना को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल को अन्य मच्छर प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है जो रोग संचरण में भूमिका निभाते हैं। इसी तरह, इस तकनीक का उपयोग करके महिला गैमेटोजेनेसिस की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, अंगों या रुचि के ऊतकों में साइटोलॉजिकल अध्ययन, जैसे कि मच्छर मिडगट, जो परजीवी आक्रमण के लिए एक लक्ष्य है, या एटिपिकल आनुवंशिक पृष्ठभूमि, जैसे कि हाइब्रिड मच्छरों में, का पता लगाया जा सकताहै। इसके अलावा, इस तकनीक को संभावित रूप से डिप्टेरा क्रम के भीतर अन्य जीवों में स्थानांतरित किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन और ओपन फिलैनथ्रॉपी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए इंपीरियल कॉलेज लंदन में लाइट माइक्रोस्कोपी (फिल्म) द्वारा इमेजिंग की सुविधा को धन्यवाद देते हैं। चित्र 2 Biorender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP Cytiva PA53022
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP Cytiva PA55022
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips ThermoFisher Scientific 2079GPK
CytoBond Removable Coverslip Sealant SciGene 2020-00-1
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich D8906-5G
DNeasy Blood & Tissue Kits  Qiagen 69504
Embryo Dishes VWR 70543-30
Ethanol, molecular grade Sigma-Aldrich 51976
Formamide ThermoFisher Scientific 17899
GoTaq G2 DNA Polymerase Promega M7841
Hydrochloric acid, 37% Sigma-Aldrich 320331
Microscope slides, SuperFrost VWR  631-0114
PBS (10x), pH 7.4 ThermoFisher Scientific 70011044
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free ThermoFisher Scientific 28906
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36941
RNase A/T1 Mix ThermoFisher Scientific EN0551
Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U1330
Sodium Acetate Solution ThermoFisher Scientific R1181
SP8 inverted confocal microscope Leica
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379
UltraPure Salmon Sperm DNA Solution ThermoFisher Scientific 15632011
UltraPure SSC 20x ThermoFisher Scientific 15557044
Primer sequences
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics Contig_240 (X)
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT
CGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics AgY53B (Y)
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA
T
GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics AgY477-
AgY53B
junction
region (Y)
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		 Eurofins Genomics 18S rDNA (X)
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		 Eurofins Genomics AgY53B (Y)

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References

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