Summary
Med tanke på deras enkla anatomi erbjuder Anopheles testiklar en bra cytologisk modell för att studera spermatogenes. Detta protokoll beskriver helmonterad fluorescens in situ-hybridisering , en teknik som används för att undersöka denna biologiska process, samt fenotypen hos transgena stammar som har mutationer i de gener som är involverade i spermieproduktion.
Abstract
Spermatogenes är en komplex biologisk process under vilken diploida celler genomgår successiv mitotisk och meiotisk delning följt av stora strukturella förändringar för att bilda haploida spermier. Förutom den biologiska aspekten är studier av spermatogenes av största vikt för att förstå och utveckla genetiska tekniker som gendrivare och syntetiska könsfördelningsförvrängare, som genom att ändra mendelsk nedärvning respektive spermiekönskvot skulle kunna användas för att kontrollera skadeinsektspopulationer. Dessa tekniker har visat sig vara mycket lovande i laboratoriemiljöer och skulle potentiellt kunna användas för att kontrollera vilda populationer av Anopheles-myggor , som är vektorer för malaria. På grund av enkelheten i testiklarnas anatomi och deras medicinska betydelse representerar Anopheles gambiae, en viktig malariavektor i Afrika söder om Sahara, en bra cytologisk modell för att studera spermatogenes. Detta protokoll beskriver hur helmonterad fluorescens in situ-hybridisering (WFISH) kan användas för att studera de dramatiska förändringarna i cellkärnans struktur genom spermatogenes med hjälp av fluorescerande sonder som specifikt färgar X- och Y-kromosomerna. FISH kräver vanligtvis störningar i reproduktionsorganen för att exponera mitotiska eller meiotiska kromosomer och möjliggöra färgning av specifika genomiska regioner med fluorescerande sonder. WFISH gör det möjligt att bevara testiklarnas naturliga cytologiska struktur, i kombination med en god nivå av signaldetektion från fluorescerande prober som riktar sig mot repetitiva DNA-sekvenser. Detta gör det möjligt för forskare att följa förändringar i kromosombeteendet hos celler som genomgår meios längs organets struktur, där varje fas i processen tydligt kan urskiljas. Denna teknik kan vara särskilt användbar för att studera kromosomens meiotiska parning och undersöka de cytologiska fenotyper som är associerade med till exempel syntetiska könsfördelningsförvrängare, hybridsterilitet hos män och knock-out av gener som är involverade i spermatogenesen.
Introduction
Malaria utgör en enorm börda för den globala befolkningens hälsa och välbefinnande. År 2021 uppskattade Världshälsoorganisationen (WHO) att malaria orsakade 619 000 dödsfall, varav 96 % inträffade i Afrika söder om Sahara1. Sjukdomen överförs av myggor som tillhör släktet Anopheles, och i Afrika söder om Sahara har tre arter, nämligen Anopheles gambiae (An. gambiae), Anopheles coluzzi (An, coluzzi) och Anopheles arabiensis (An. arabiensis) en oproportionerligt stor roll i spridningen av malaria och står för 95 % av malariafallen globalt. Kontrollprogram som förlitar sig på traditionella metoder som insektsmedel och läkemedel mot malaria har räddat miljontals liv. Under de senaste åren har dock det ökande motståndet mot dessa kontrollmetoder ifrågasatt deras effektivitet 1,2. Dessutom har de restriktioner som införts av covid-19-pandemin påverkat tillgången till viktiga malariakontrollinsatser, vilket enligt WHO:s World Malaria Report 2022 har ökat malariaincidensen1. Under de senaste två decennierna har nya genetiska bekämpningsmetoder utvecklats i laboratoriemiljöer för att rikta in sig på Anopheles-myggor 3,4,5,6,7,8,9,10. Bland dessa strategier verkar de som är baserade på gendrivarsystem (GDS) och syntetiska könsfördelningsförvrängare (SD) lovande. GDS förlitar sig på möjligheten att med mycket hög frekvens överföra en genetisk modifiering som påverkar kvinnlig fertilitet eller försämrar parasitens livscykel i myggan 5,11,12. SD agerar istället genom att snedvrida könsfördelningen hos en myggavkomma till hanar, vilket med tiden leder till att en målpopulation kollapsar på grund av brist på honor 4,6,13. Huvudkomponenterna i dessa genetiska system verkar främst på myggornas fortplantningsorgan, där könsceller, ägg och spermier produceras efter meiotisk delning14.
I detta protokoll används framsteg inom cytogenetiska tekniker för att utforska spermatogenes i An. gambiae med fokus på kromosomernas beteende in situ. Myggtestiklarnas struktur och de biologiska processer som äger rum i den har tidigare undersökts med hjälp av ett antal cytologiska metoder, såsom immunofluorescens, fluorescerande reportertransgener och DNA- och RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH)15,16,17,18,19,20; Organen visar en spindelliknande form, där den nedre stången är fäst vid en deferent kanal ansluten till de manliga tillbehörskörtlarna. I den övre polen förökar sig könsstamcellernas nisch och differentieras till spermatogoniaceller inbäddade i spermatocyster som bildas av somatiska celler. Efter flera omgångar av mitotisk delning differentieras spermatogonierna till spermatocyter, som går in i meios. Vid profas paras autosom- och könskromosomer ihop med sina homologer, och korsning sker. Efter de meiotiska delningarna genereras runda haploida spermatider och går in i spermiogenes, och denna process leder till bildandet av mogna haploida spermier där cytoplasman har avlägsnats, kärnkromatinet kondenseras och flageller framträder vid den basala delen av kärnorna21,22 (Figur 1 och Figur 2).
I allmänhet börjar spermiogenesen runt mitten av puppstadiet, och mogna spermier kan detekteras i det sena puppstadiet i spermiereservoaren23. Spermatocysternas mognadsprocess fortsätter under vuxenlivet23,24,25. I Anopheles testiklar kan varje steg i spermatogenesen lätt identifieras genom att titta på kärnmorfologin hos cellerna i varje spermatocyst (Figur 2). Helmonterad fluorescens in situ-hybridisering (WFISH), som beskrivs i detta protokoll, gör det möjligt för forskare att specifikt märka en kromosomal region och spåra den under spermatogenesen samtidigt som den ursprungliga strukturen hos organ- och cellkärnans position bevaras. Detta är en fördel jämfört med det vanliga DNA-FISH-protokollet där organet vanligtvis kläms, vilket leder till vävnadsskador19. I det nuvarande protokollet används fluorescerande sonder för att färga repetitiva sekvenser på könskromosomerna och på så sätt spåra deras beteende under spermatogenesen, från diploida delningsceller till mogna haploida spermier. WFISH kan vara särskilt användbart för att studera könskromosomens meiotiska parning och undersöka de cytologiska fenotyper som är associerade med till exempel syntetiska könsfördelningsförvrängare, hybridsterilitet hos män och knock-out av gener som är involverade i spermatogenes 4,19,26,27.
Med tanke på deras roll som malariavektorer är Anopheles-myggor målet för ett ökande antal genetiska vektorkontrollstrategier, som ofta verkar i dessa organismers reproduktionsorgan. Flera myggmutanter och cytologiska fenotyper har genererats som kräver att nya cytologiska tekniker undersöks26,27,28,29. Metoden som beskrivs i denna studie belyser förståelsen av spermatogenesen, liksom de cytologiska mekanismerna bakom genetiska strategier som har potential att kontrollera malariaöverförande myggor.
Protocol
1. Märkning av DNA-sond
OBS: Nedan följer de tekniska stegen för att generera fluorescerande DNA-sonder som specifikt märker könskromosomerna hos An. gambiae-myggor.
- Sondmärkning med PCR
- Extrahera genomiskt DNA från puppor eller vuxna hanar för att märka X- eller Y-kromosomerna med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt genomiskt DNA-extraktionskit (se materialförteckning).
- Bered PCR-reaktionsblandningen: 200 ng genomiskt DNA, 0,05 mM omärkt nukleotid (dATP, dCTP, dGTP), 0,015 mM dTTP och 1 μL fluorescerande märkt dUTP (Cy3, Cy5 eller annan fluorokrom), 50 pmol framåt- och bakåtprimer (tabell 1), 5 μL 10x PCR-buffert och 10 U Taq DNA-polymeras (se materialförteckning).
- För att märka 18S rDNA och satellit AgY53B (tabell 1), utför en PCR-reaktion med följande PCR-parametrar: en cykel med 95 °C i 10 minuter; 35 cykler med 95 °C i 30 s, 52 °C i 30 s och 72 °C i 45 s. En cykel på 72 °C i 5 minuter. och ett slutligt grepp vid 4 °C.
OBS: För att få en bra sondkoncentration med PCR-märkningsmetoden (~1 μg i 5 μL), vilket är avgörande för en framgångsrik WFISH, bör PCR-reaktionen vara mycket effektiv. Av denna anledning, innan sonden märks, rekommenderas starkt att testa effektiviteten hos de primers som valts för amplifieringen. Att inkludera en positiv kontroll i PCR-reaktionen (utan den fluorescerande dUTP) kommer dessutom att bidra till att verifiera effekten av märkningsreaktionen. - Förvara sonden vid −20 °C på en mörk plats.
- Erhållande 3' ände fluorescerande oligonukleotidsonder
- Erhåll kommersiellt tillgängliga fluorescerande oligonukleotidsonder som modifierade oligos genom att tillsätta Cy3- eller Cy5-fluorokromer (eller någon annan fluorokrom) till 3'-änden av nukleotidsekvensen (se materialtabell). Se primrar/oligonukleotid i tabell 1 för de referenssekvenser som används för att märka den Y-bundna satelliten AgY477-AgY53B-övergångsregionen och den X-bundna satelliten från Contig_240.
OBS: Det finns inga tekniska hinder relaterade till koncentrationen av 3' ändmärkta oligonukleotider, eftersom användaren vanligtvis kan välja detta före köpet. Vi föreslår att du späder ~800 ng oligosondlösning i hybridiseringsbufferten för effektiv märkning med oligosonden. X- och Y-specifika oligosonder har tidigare använts för WFISH av Liang och Sharakhov19, och referenssekvensen finns i tabell 1.
- Erhåll kommersiellt tillgängliga fluorescerande oligonukleotidsonder som modifierade oligos genom att tillsätta Cy3- eller Cy5-fluorokromer (eller någon annan fluorokrom) till 3'-änden av nukleotidsekvensen (se materialtabell). Se primrar/oligonukleotid i tabell 1 för de referenssekvenser som används för att märka den Y-bundna satelliten AgY477-AgY53B-övergångsregionen och den X-bundna satelliten från Contig_240.
2. Beredning av hybridiseringslösningen
OBS: De fluorescerande sonderna som genereras i steg 1 måste inkorporeras i en kemisk lösning som hybridiserar med målsekvenserna.
- Sondutfällning före fluorescens in situ-hybridisering
- Tillsätt 5 μL märkt DNA-sond (om den erhålls med PCR-märkningsmetoden) eller 2,2 μL 3' modifierad oligosond (~800 ng sond) från steg 1 och 5 μL laxspermie-DNA (se materialförteckning) till ett 1,5 ml rör. Kombinera de prober som är specifika för olika genomiska regioner i samma rör och använd dem som en unik lösning i följande steg.
- Fäll ut DNA-sonden genom att tillsätta 0,1 volym 3 M natriumacetat och 2 volymer 100 % etanol. Förvaras vid −20 °C i minst 2,5 timmar (om inkubationstiden ökas vid −20 °C ökar den slutliga avkastningen). I detta skede kan sonderna också förvaras över natten före centrifugering.
- Centrifugera vid 17 000 x g vid 4 °C i 20 minuter, ta bort etanolen och lufttorka pelleten vid RT i mörker i ~20 minuter.
- Lösning för hybridisering
- Innan du fortsätter med testikeldissektionen (steg 3), förbered hybridiseringsbufferten genom att blanda följande reagenser i ett 1,5-rör: 500 μL formamid, 0,2 g dextransulfat, 100 μL 20x natriumsaltlösningscitrat (SSC) och 200 μL steril H20 (se Materialtabell). Blanda hybridiseringslösningen i 1 minut och låt dextransulfatet lösas upp vid 37 °C i 30 minuter.
- Lös upp pelleten från steg 2.1.3 i 20-30 μL hybridiseringsbuffert (virvla i ca 1 min, gör en snabb centrifugering och förvara rören vid 37 °C i mörker) för att erhålla hybridiseringslösningen.
3. Dissektion och fixering av testiklarna
- Vid rumstemperatur (RT), dissekera21 minst ~20 testiklar från puppor eller 1 dag gamla vuxna i steril 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och överför dem till ett rent mikroskopglas som innehåller en ny droppe 1x PBS-lösning.
- Överför testiklarna med hjälp av en P1 000 bredborrad filtrerad spets eller spetsen på en dissektionsnål från 1x PBS-droppen till en embryoskål som innehåller 3,7 % formaldehyd i 1x PBS med 0,1 % Tween-20 (PBST) och inkubera i 10 minuter vid RT.
- Tvätta testiklarna i 1x PBST i 5 min vid RT. Inkubera testiklarna i 0,1 mg/ml RNAse A (se materialtabell) utspädd i steril 1x PBS i 30 min vid 37 °C.
- Ta bort RNAse-lösningen, tillsätt den penetrerande lösningen (1 % Triton/0,1 M HCl i 1x PBST) och inkubera vid RT i 10 minuter.
OBS: Proteinas K kan användas som penetrerande medel vid en slutlig koncentration på 10 μg/ml i 1x PBST för att öka permeabiliseringen av testiklarna. - Tvätta testiklarna i 1x PBST två gånger i 5 minuter vardera vid RT.
4. Hybridisering
OBS: I detta avsnitt beskrivs de sista stegen för in situ-hybridisering .
- Efter tvättsteget (steg 3.5) överför testiklarna i ett 1,5 ml rör med 20-30 μl hybridiseringslösning som innehåller den tidigare preparerade sonden (steg 2.2.2). Använd spetsen på pipetten för att blanda lösningen försiktigt. Snärta försiktigt till röret fem gånger innan du går vidare till nästa steg.
- Inkubera i 5 minuter vid 75 °C för DNA-denaturering.
- Inkubera över natten vid 37 °C (om möjligt med gungning vid mindre än 100 varv per minut) för DNA-DNA-hybridisering.
- Lägg tillbaka testiklarna i en embryoskål med hjälp av en P1 000 bredborrad filtrerad spets och tvätta dem i 2 x SSC förvärmda till 50 °C i 5 minuter.
OBS: Efter hybridiseringssteget krävs ett sista tvättsteg med 2x SSC; Detta spelar en viktig roll för att ta bort alla bakgrundssignaler som orsakas av närvaron av ohybridiserade sonder inuti organvävnaden. Om det finns en stark bakgrundssignal rekommenderas att du upprepar det sista tvättsteget. - Ta bort 2x SSC och montera testiklarna med ett kommersiellt tillgängligt monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (se materialtabell) på ett frostat glasglas, försegla med täckglas tätningsmedel och inkubera i minst 2 timmar vid RT i mörker.
- Utför konfokal avbildning. Hela testiklarna kan visualiseras med hjälp av 40x eller 63x oljenedsänkningsmål. Om en z-stack utförs föreslår vi att du använder ett z-steg på 1,25 μm.
Representative Results
I detta arbete användes WFISH för att undersöka kromosombeteendet under spermatogenes i An. gambiae. Det första avgörande steget för att tillämpa detta protokoll är att få testiklar som visar en låg nivå av morfologisk förändring efter dissektion. Grundläggande kunskaper om myggans anatomi krävs för att utföra en framgångsrik testikeldissektion, och nedan ges några riktlinjer för denna procedur. I Anopheles-myggan kan mogna testiklar hittas liggande i det sjätte buksegmentet av pupp- och vuxenstadiet21. Som visas i figur 1 förbinder sädesledarna testiklarna med de manliga tillbehörskörtlarna (MAG), som är belägna i det sista segmentet av buken. MAGs är anslutna till en unik ejakulationskanal som levererar spermier och sädesvätskor till kopulatoriskt organ och den yttre delen av den manliga könsorganet. Hela den inre manliga könsapparaten kan dissekeras med olika tillvägagångssätt beroende på myggans livsstadium. Under puppstadiet kan testiklarna lätt identifieras med hjälp av ett stereomikroskop i hela det ljusa nagelbandet genom att titta på den ventrala sidan av buken i närheten av det sjätte segmentet (Figur 1). För att dissekera testiklarna kan den nedre delen av buken, inklusive det sjätte segmentet, isoleras från resten av kroppen med hjälp av ett par nålar och överföras till en ren droppe av 1x PBS. Efter avlägsnandet av det sista segmentet kan hela apparaten pressas ut ur buken genom att applicera ett lätt tryck med dissekeringsnålarna. För att dissekera testiklarna från vuxna hanar innebär det första steget att isolera hela buken i en ny droppe av 1x PBS och sedan dra ut det sista segmentet som bär spännena, som är de manliga kopulatoriska strukturerna (Figur 1). Vid denna tidpunkt bör den nedre delen av MAGs dyka upp och vara lätt att identifiera på grund av sin gula färg. Hela hanapparaten kan sedan långsamt dras ut med hjälp av en nål eller pincett i en droppe av 1x PBS tills testikelparet som är fäst vid sädesledaren är synligt. Innan fixeringen påbörjas är det viktigt att isolera testiklarna från de andra delarna av hanapparaten genom att skära i närheten av den nedre delen av sädesledaren (figur 1).
Åldern på pupporna eller de vuxna hanarna är en viktig faktor att ta hänsyn till beroende på vilket spermatogenesstadium som undersöks. I An. gambiae börjar spermatogenesen i det tidiga/mellersta puppstadiet och fortsätter under hela livet för individen24. Mellan 3 timmar och 10 timmar efter förpuppning är de premeiotiska och meiotiska stadierna mer representerade i testiklarna (meiotisk profas, meiotiska delningar), spermatid-DNA:t är relativt okondenserat och mogna spermier har ännu inte bildats. Sena puppor och 1 dag gamla vuxna erbjuder en bra balans mellan de premeiotiska, meiotiska och postmeiotiska stadierna (Figur 2 och Figur 3). Hos vuxna som är mer än 4 dagar gamla är de premeiotiska stadierna och spermatocysterna mindre representerade, och testiklarna är huvudsakligen upptagna av mogna spermier som finns i spermiereservoaren.
För att undersöka könskromosomernas beteende under olika stadier av spermatogenesen utfördes WFISH på testiklar dissekerade i det sena puppstadiet för att säkerställa en god representation av hela processen. För att följa beteendet hos dessa kromosomer användes fluorescerande sonder som är specifika för repetitiva sekvenser som uteslutande finns på X- eller Y-kromosomen. De fluorescerande sonderna kan genereras med hjälp av PCR eller erhållas kommersiellt som 3' ändmärkta oligonukleotider. Användning av en oligo med en längd på >40 bps rekommenderas för att möjliggöra god signaldetektering från den fluorescerande oligosonden. Enligt vår erfarenhet presterar 3' ändmärkta oligos bättre än PCR-märkta sonder när det gäller signaldetektering. Dessutom är antalet kopior av målsekvensen en faktor som kan påverka effekten av WFISH. Om märkningen misslyckas föreslår vi att du använder PCR-etiketteringsmetoden på ett längre fragment eller utformar flera oligos som är specifika för målregionen.
De nuvarande metoderna, baserade på användning av en penetrerande lösning (1 % Triton/0,1 M HCl i 1x PBST), möjliggör en god nivå av testikelpermeabilisering och penetration av sonderna, vilket resulterar i en framgångsrik hybridiseringsreaktion. Oligosonder som är specifika för könskromosomrepetitiva sekvenser kan designas baserat på den omfattande karakteriseringen av repetitiva element som utförts av Hall et al.20. Dessutom kan konsensussekvenser som är specifika för X- eller Y-länkade repetitiva element erhållas med hjälp av en bioinformatisk plattform som RedKmer pipeline30. Det är viktigt att notera att könskromosomsonder kan rikta in sig på repetitiva element som satelliter och retrotransposoner, och de kan ha en olika grad av hybridisering med X- eller Y-kromosomerna beroende på vilken art som undersöks 20,31,32. Som visas i figur 3 möjliggjorde en god nivå av hybridisering av sonderna och låg bakgrund visualiseringen av de riktade kromosomerna under hela spermatogenesen. Parningen av märkta könskromosomer kunde ses i de premeiotiska och meiotiska stadierna. Detta följdes av att antingen X- eller Y-kromosomerna detekterades i haploida cellkärnkromosomer som är ett resultat av meiotiska delningar. Därefter kunde X- eller Y-bärande spermatider följas genom spermiogenesen, markerad av olika nivåer av DNA-kondensation, till det sista steget av pilformade mogna spermier. I den nuvarande experimentella uppställningen användes konfokala Z-stackar för att samla in information om den 3D-rumsliga organisationen av cellerna under denna process (Video 1).
Figur 1: Testiklar dissekerade från puppor och 1 dag gamla vuxna Anopheles gambiae-hanar. A) En buk dissekerad i det sena puppstadiet som visar testiklarnas läge i närheten av det sjätte buksegmentet. Testiklarna kan identifieras i hela nagelbandet och visas som brunaktiga strukturer på båda sidor av buken (med pilar). (B) Testiklarna dissekerade i puppstadiet, med avseende på mogna testiklar (1), sädesledare (2), mag (3) och ejakulationskanal (4). (C) En buk dissekeras från en 1 dag gammal vuxen hane efter att ha avlägsnat basallåssegmentet. MAGs kan pressas från buken genom att applicera ett lätt tryck (vit pil). (D) Hanens inre reproduktionsapparat dissekerad från en 1 dag gammal vuxen hane. Den vita pilen indikerar positionen för mogna spermier, som uppträder som ett vitt aggregat vid testiklarnas basala pol. Skalstreck: (A,C) 200 μm; (B,D) 100 μm. De romerska siffrorna från I till VIII anger buksegmenten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representation av spermatogenes i Anopheles gambiae. Bilden till vänster visar en An. gambiae sen pupptestikel efter helmonterad DAPI-färgning. Till höger finns en schematisk version för bättre visualisering. Genom att observera kärnans form och kondensationsnivå är det relativt enkelt att följa alla spermatogenesstadier från diploida celler till haploida spermier. Stamcellsnischen är belägen i organets övre pol, där differentieringen till spermatogonier börjar. Spermatogonicellerna ökar i antal efter mitotisk delning (gröna blodkroppar) och spermatocysterna ökar i storlek (gula blodkroppar). Spermatogoniacellerna differentieras till spermatocyter efter flera omgångar av mitotiska delningar (blå celler). Spermatocyterna, som kännetecknas av relativt större kärnor än cellerna i de andra stadierna av processen, är de celler som kommer att genomgå meiotisk delning. Celler som genomgår meios kan detekteras genom att titta på närvaron av kromosomer i olika meiotiska stadier; Chiasmata- och metafaskromosomer kan detekteras även vid låg förstoring. De premeiotiska stadierna är överrepresenterade i testiklar som dissekeras i det tidiga puppstadiet. Efter den första och andra meiotiska delningen produceras spermatider och kan vanligtvis hittas liggande i mitten av testiklarna. Spermatidernas kärnor uppvisar en viss grad av variation i sin form, från en rund till en pilliknande form. Spermatiderna går in i spermiogenesprocessen, under vilken kärnorna börjar kondensera och deras struktur förändras till pilliknande prickar. När myggor mognar sexuellt efter att ha vuxit upp kan spermatocyster som innehåller mogna spermier uppta större delen av testiklarnas volym på bekostnad av spermatocyster i ett annat utvecklingsstadium. Skalstreck: 20 μm. Asterisken (*) anger den apikala delen av testiklarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: WFISH på en An. gambiae testis dissekerad från det sena puppstadiet. WFISH utfördes med hjälp av prober som är specifika för X-kromosomerna (Contig_240) och Y-kromosomerna (oligosondspecifika för AgY53B). (A) WFISH gör det möjligt att följa könskromosomens beteende under spermatogenesen från diploida celler till haploida spermier. I den här bilden är det möjligt att uppskatta de dramatiska förändringar som kärnorna genomgår under spermatogenesen. Märkning av könskromosomerna möjliggör diskriminering mellan diploida och haploida celler. I diploida celler är signalen från könskromosomerna kopplad till samma kärnor. I haploida celler (spermatider och spermier) är signalen från könskromosomerna okopplad på grund av den meiotiska reduktionella delningen. (B,C) En bild av testiklarna med högre förstoring (63x) visas i (A). De förvärvades på olika positioner längs Z-axeln. De vita prickade ramarna indikerar förvärvsområdet. (B) Övergångsstadiet mellan spermatocyter och spermatider, som visar bildandet av haploida celler och separationen av signalerna från könskromosomerna i separata kärnor. C) Övergångsstadiet mellan haploida spermatider och mogna spermier. Detta steg visar förändringarna i kärnkondensationsnivån; Mogna spermier uppvisar en mer förtätad och långsträckt form än spermatider. Skalstaplar: (A), 30 μm; (B,C), 10 μm; Grå: DAPI. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Målsekvens | Primersekvens och Oligo-sondkonsensus | Hänvisning |
| Contig_240 (X) | 5'-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3'-[Fluorokrom] |
19 |
| AgY53B (Y) | 5'AGAAGAATAGAATCAGAATAGTCGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[Fluorokrom] |
Denna studie |
| AgY477- AgY53B knutpunkt region (Y) |
5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT GAAGAAACCGACTATTC-3'-[Fluorochrome] |
19 |
| 18S rDNA (X) | F: AACTGTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA |
19 |
| AgY53B (Y) | F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG |
19 |
Tabell 1: Förteckning över oligosonder som är specifika för X- eller Y-kromosomen i An. gambiae.
Video 1: En 3D-stack på WFISH utförd på en An. gambiae-testiklar dissekerad från det sena puppstadiet. För att få en 3D-representation av spermatogenesprocessen kan en konfokal 3D-stack utföras på testiklar som visar ett lågt antal strukturella förändringar. I denna studie utfördes stackarna med ett intervall på 1,25 μm mellan två optiska sektioner under en 63x eller 40x oljelins för att inte förlora information om cellernas 3D-rumsliga organisation. Grå: DAPI, gul: Contig_240 (X), magenta: AgY53B (Y). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Vanligtvis kräver FISH-protokoll att det organ som är av intresse kläms ihop för att möjliggöra kromosomfärgning. Detta orsakar en förlust av information om det rumsliga arrangemanget av cellerna i det organet33. Detta protokoll beskriver hur biologiska processer, såsom spermatogenes, kan studeras in situ samtidigt som testiklarnas intakta ursprungliga struktur och dess interna cytologiska organisation bibehålls. Sonder som riktar sig mot olika DNA-repetitiva element, som är särskilt anrikade i könskromosomer20, kan samtidigt användas för att avslöja dynamiken i spermiernas mognad. Beroende på tidpunkten för testikeldissektionen erbjuder WFISH möjligheten att studera olika stadier av spermatogenes genom myggutveckling. WFISH är användbart för att studera specifika fenomen som hybridinkompatibilitet, som hos Anopheles-myggor beror på närvaron av meiotiska defekter såsom premeiotiskt fel och icke-disjunktion av könskromosomer 19,34,35. Förutom den biologiska aspekten är spermatogenesen målet för ett antal genetiska strategier som utvecklats för att bekämpa skadeinsekter som Anopheles-myggor. I detta sammanhang har det X-kromosombundna rDNA-lokuset hos An. gambiae använts som ett mål för att utveckla en syntetisk könsfördelningsförvrängare, som genom att skada X-bärande spermier förskjuter avkomman mot hanar 4,8,13.
Denna teknik speglar verkan av naturliga könskvot meiotiska drifter som har identifierats i flera taxa, inklusive myggor, men som fortfarande är dåligt förstådda 28,36,37,38,39,40,41. WFISH erbjuder möjligheten att undersöka detta fenomen och banar väg för att förfina eller förbättra könsförvrängningsbaserade genetiska strategier genom att till exempel ge information om hur cytologin för spermieproduktion påverkas av valet av målställen som används för könskromosomfragmentering. Även om WFISH enligt vår erfarenhet visar stora chanser att lyckas, kan misslyckande fortfarande inträffa. Detta kan bero på en ineffektiv nivå av vävnadspermeabilisering, som kan övervinnas genom att öka inkubationstiden för den penetrerande lösningen. Alternativt kan proteinas K användas under permeabiliseringssteget. I vissa fall märkte vi en ojämn nivå av sondpenetration, med en högre signal i spermatocytkärnor och en lägre eller frånvarande signal i de meiotiska och spermiogenesstadierna. Detta kan bero på en skillnad i permeabiliseringsnivån beroende på cellstadiet. Dessutom visade sig WFISH vara värdefullt när man använde fluorescerande sonder som är utformade för att rikta in sig på DNA-sekvenser som finns i ett stort antal kopior. När man riktar in sig på gener med en kopia kan det hända att signaldetektionen inte är tillräcklig. I detta fall måste metoder för signalförstärkning, såsom tyramidsignalförstärkning (TSA), integreras42.
Detta protokoll skulle kunna kombineras med immunfärgning eller med transgena reporterstammar som innehåller könscellsspecifika fluorescerande markörer16,18, eftersom detta skulle ge information om proteinlokalisering och genuttryck in situ. I detta arbete beskrivs WFISH som en teknik för att undersöka spermatogenes hos Anopheles-myggor; Men med tanke på den gemensamma anatomin hos de manliga reproduktionsorganen kan detta protokoll tillämpas på andra myggarter som spelar en roll i sjukdomsöverföringen. På samma sätt skulle kvinnlig gametogenes kunna undersökas med hjälp av denna teknik. Dessutom skulle cytologiska studier av organ eller vävnader av intresse, såsom myggans mellantarm, som är ett mål för parasitinvasion, eller atypiska genetiska bakgrunder, såsom de hos hybridmyggor, kunna undersökas43. Dessutom kan denna teknik potentiellt överföras till andra organismer inom Diptera-ordningen.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från Bill & Melinda Gates Foundation och Open Philanthropy. Vi tackar Facility for Imaging by Light Microscopy (FILM) vid Imperial College London för mikroskopianalysen. Figur 2 skapades med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP | Cytiva | PA53022 | |
| Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP | Cytiva | PA55022 | |
| ART Wide Bore Filtered Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| CytoBond Removable Coverslip Sealant | SciGene | 2020-00-1 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
| Embryo Dishes | VWR | 70543-30 | |
| Ethanol, molecular grade | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Formamide | ThermoFisher Scientific | 17899 | |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Microscope slides, SuperFrost | VWR | 631-0114 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36941 | |
| RNase A/T1 Mix | ThermoFisher Scientific | EN0551 | |
| Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U1330 | |
| Sodium Acetate Solution | ThermoFisher Scientific | R1181 | |
| SP8 inverted confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA Solution | ThermoFisher Scientific | 15632011 | |
| UltraPure SSC 20x | ThermoFisher Scientific | 15557044 | |
| Primer sequences | |||
| 5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | Contig_240 (X) | |
| 5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT CGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) | |
| 5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA T GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY477- AgY53B junction region (Y) |
|
| F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA |
Eurofins Genomics | 18S rDNA (X) | |
| F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) |
References
- World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2022 (2022).
- Bhatt, S., et al. The effect of malaria control on Plasmodium falciparum in Africa between 2000 and 2015. Nature. 526 (7572), 207-211 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5 (1), 3977 (2014).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Simoni, A., et al. A male-biased sex-distorter gene drive for the human malaria vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 38 (9), 1054-1060 (2020).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), E6736-E6743 (2015).
- Bernardini, F., Kriezis, A., Galizi, R., Nolan, T., Crisanti, A. Introgression of a synthetic sex ratio distortion system from Anopheles gambiae into Anopheles arabiensis. Scientific Reports. 9 (1), 5158 (2019).
- Hammond, A. M., Galizi, R. Gene drives to fight malaria: Current state and future directions. Pathogens and Global Health. 111 (8), 412-423 (2017).
- Garrood, W. T., et al. Driving down malaria transmission with engineered gene drives. Frontiers in Genetics. 13, 891218 (2022).
- Hoermann, A., et al. Gene drive mosquitoes can aid malaria elimination by retarding Plasmodium sporogonic development. Science Advances. 8 (38), (2022).
- Nash, A., et al. Integral gene drives for population replacement. Biology Open. 8 (1), (2019).
- Galizi, R., et al. A CRISPR-Cas9 sex-ratio distortion system for genetic control. Scientific Reports. 6 (1), 31139 (2016).
- Terradas, G., Hermann, A., James, A. A., McGinnis, W., Bier, E. High-resolution in situ analysis of Cas9 germline transcript distributions in gene-drive Anopheles mosquitoes. G3: Genes, Genomes, Genetics. 12 (1), (2022).
- Durant, A. C., Donini, A. Ammonium transporter expression in sperm of the disease vector Aedes aegypti mosquito influences male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (47), 29712-29719 (2020).
- Taxiarchi, C., et al. High-resolution transcriptional profiling of Anopheles gambiae spermatogenesis reveals mechanisms of sex chromosome regulation. Scientific Reports. 9 (1), 14841 (2019).
- Pompon, J., Levashina, E. A. A new role of the mosquito complement-like cascade in male fertility in Anopheles gambiae. PLoS Biology. 13 (9), e1002255 (2015).
- Papathanos, P. A., Windbichler, N., Menichelli, M., Burt, A., Crisanti, A. The vasa regulatory region mediates germline expression and maternal transmission of proteins in the malaria mosquito Anopheles gambiae: A versatile tool for genetic control strategies. BMC Molecular Biology. 10 (1), 13 (2009).
- Liang, J., Sharakhov, I. V. Premeiotic and meiotic failures lead to hybrid male sterility in the Anopheles gambiae complex. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1906), 20191080 (2019).
- Hall, A. B., et al. Radical remodeling of the Y chromosome in a recent radiation of malaria mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), E2114-E2123 (2016).
- Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. , CABI. Wallingford, Oxfordshire. (1992).
- Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L.
- Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G.
- Huho, B. J., et al. A reliable morphological method to assess the age of male Anopheles gambiae. Malaria Journal. 5 (1), 62 (2006).
- Fabian, L., Brill, J. A.
- Li, M., et al. Suppressing mosquito populations with precision guided sterile males. Nature Communications. 12 (1), 5374 (2021).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13677-13681 (2011).
- Haghighat-Khah, R. E., et al. Cellular mechanisms regulating synthetic sex ratio distortion in the Anopheles gambiae germline. Pathogens and Global Health. 114 (7), 370-378 (2020).
- Yamamoto, D. S., et al. A synthetic male-specific sterilization system using the mammalian pro-apoptotic factor in a malaria vector mosquito. Scientific Reports. 9 (1), 8160 (2019).
- Papathanos, P. A., Windbichler, N. Redkmer: An assembly-free pipeline for the identification of abundant and specific X-chromosome target sequences for X-shredding by CRISPR endonucleases. The CRISPR Journal. 1 (1), 88-98 (2018).
- Sharma, A., Kinney, N. A., Timoshevskiy, V. A., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. Structural variation of the X chromosome heterochromatin in the Anopheles gambiae complex. Genes. 11 (3), 327 (2020).
- Krzywinski, J., Sangaré, D., Besansky, N. J. Satellite DNA from the Y chromosome of the malaria vector Anopheles gambiae. Genetics. 169 (1), 185-196 (2005).
- Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (67), e4215 (2012).
- Liang, J., Hodge, J. M., Sharakhov, I. V. Asymmetric phenotypes of sterile hybrid males from reciprocal crosses between species of the Anopheles gambiae complex. Frontiers in Ecology and Evolution. 9, 660207 (2021).
- Slotman, M., Torre, A. D., Powell, J. R. The genetics of inviability and male sterility in hybrids between Anopheles gambiae and An. arabiensis. Genetics. 167 (1), 275-287 (2004).
- Wood, R. J., Newton, M. E. Sex-ratio distortion caused by meiotic drive in mosquitoes. The American Naturalist. 137 (3), 379-391 (1991).
- Cazemajor, M., Joly, D., Montchamp-Moreau, C. Sex-ratio meiotic drive in Drosophila simulans is related to equational nondisjunction of the Y chromosome. Genetics. 154 (1), 229-236 (2000).
- Jaenike, J.
- Courret, C., Chang, C. H., Wei, K. H., Montchamp-Moreau, C., Larracuente, A. M. Meiotic drive mechanisms: Lessons from Drosophila. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1913), 20191430 (2019).
- Zanders, S. E., Unckless, R. L.
- Newton, M. E., Wood, R. J., Southern, D. I. A cytogenetic analysis of meiotic drive in the mosquito, Aedes aegypti (L.). Genetica. 46 (3), 297-318 (1976).
- Carabajal Paladino, L. Z., Nguyen, P., Šíchová, J., Marec, F. Mapping of single-copy genes by TSA-FISH in the codling moth, Cydia pomonella. BMC Genomic Data. 15, S15 (2014).
- Bernardini, F., et al. Cross-species Y chromosome function between malaria vectors of the Anopheles gambiae species complex. Genetics. 207 (2), 729-740 (2017).
