Gemusterte Photostimulation mit Digital Micromirror Devices auf Dendritische Integration über Verzweigungspunkte Untersuchen

Summary

Digitale Mikrospiegel-Geräte (DMD) generieren können komplexe Muster in Raum und Zeit, mit der neuronalen Erregbarkeit zu steuern. Fragen, die für die Planung, den Bau und Betrieb von DMD Systeme diskutiert. Ein solches System ermöglicht den Nachweis von nicht-linearen Integration in distalen dendritischen Verzweigungen.

Abstract

Licht ist eine vielseitige und präzise Mittel, um die neuronale Erregbarkeit zu steuern. Die kürzlich erfolgte Einführung von lichtempfindlichen Effektoren wie Kanal-Rhodopsin und eingesperrt Neurotransmitter haben Interesse an der Entwicklung besseres Mittel, um Muster von Licht in Raum und Zeit, die nützlich für experimentelle Neurowissenschaften geführt hat. Eine herkömmliche Strategie, in der konfokalen und 2-Photonen-Mikroskopie verwendet wird, ist, um Licht zu einem beugungsbegrenzten Spot-Fokus und scannen Sie dann, dass einzelne Fleck nacheinander über die Region von Interesse. Dieser Ansatz wird problematisch, wenn große Flächen in kurzer Zeitfenster, ein Problem mehr für Photostimulation als für die Bildgebung stimuliert werden müssen. Eine alternative Strategie besteht darin, die komplette räumliche Muster auf das Ziel mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel (DMD)-Projekt. Die DMD-Ansatz ist attraktiv, weil die Hardware-Komponenten relativ günstig sind und von kommerziellen Interessen unterstützt. Da ein solches System ist nicht für aufrechte Mikroskope zur Verfügung, werden wir die kritischen Fragen in den Bau und Betrieb eines solchen DMD-System. Obwohl wir in erster Linie beschreibt den Aufbau des Systems für die UV-Photolyse, werden die Änderungen für den Bau der viel einfachere sichtbares Licht für optogenetische Experimente vorgesehen sein. Die UV-Photolyse-System verwendet wurde, um Experimente carryout um eine grundsätzliche Frage in den Neurowissenschaften studieren, sind, wie räumlich-Eingänge über distalen dendritischen Verzweigungen integriert verteilt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Integration kann nicht linear Verzweigungspunkte und der supralinearity wird weitgehend durch NMDA-Rezeptoren vermittelt.

Protocol

Allgemeine Überlegungen zum Entwurf

Wenn die Wellenlänge des Foto Stimulation ist im sichtbaren Bereich, wie zum optogenetische Experimente, wird das Layout des Systems wesentlich einfacher als für UV-Photolyse-Experimenten. Man braucht nur ein Dual-Kamera-Anschluss-Modul, das zur Verfügung von allen Mikroskop Unternehmen zu erwerben. Die DMD-Ebene kann die konjugierte Bildebene entweder eine der beiden Kamera-Ports platziert werden. Aber in UV-Photolyse das Licht aus dem DMD muss durch die Auflicht-Pfad (Abb. 3A) gebracht werden, weil die Bildgebung Tubuslinse was zu der Kamera ist nicht für die UV-Wellenlänge in einem der im Handel erhältlichen Mikroskope korrigiert. Die sphärische Aberration der Bildgebung Tubuslinse bei 350 nm ist stark genug, um die Fähigkeit, Licht zu einem festen Punkt zu konzentrieren und ausreichende räumliche Auflösung zu erzeugen verhindern. Dieses Problem ist nicht in der konfokalen Mikroskopie gestoßen, weil das Rohr Linse entfernt wird, wenn einem kollimierten Laserstrahl wird in auf der gleichen optischen Achse gebracht. Das Problem der UV-Beleuchtung kann durch zu bringen in das Licht durch die epi-Fluoreszenz-Weg gelöst werden, weil die Tubuslinsen es alle sind teilweise für die sphärische Aberration bei einer UV-Wellenlänge korrigiert. Wir können uns auf die Optik des Mikroskops zu irgendeinem Grad der Zeitschrift Wünschen zu erweitern. Die wissenschaftliche Gemeinschaft ist in der Regel schnell Interesse an diesem Thema und es gibt nicht viele Quellen, die sie lehrt gut.

Um Änderungen des Mikroskops zu minimieren und wegen der engen Platzverhältnisse an der Epi-Fluoreszenz-Einheit, wird die DMD bei einem neu erstellten Konjugat Bildebene durch eine Relais-Linse (Punkt die Position des DMD-Einheit in Bezug auf die erstellte platziert Mikroskop). Eine kommerzielle UV korrigiert Relais-Linse gekauft wurde (Specialty Optics) (Stelle in der Grafik und am Mikroskop).

Illumination des DMD

Nach Erhalt ihrer Binäreingang Mikrospiegel können zwischen einer positiven und einer negativen 12 ° Neigung relativ zur Ebene des Chips wechseln. Die Drehachse ist entlang der diagonalen Ecken jedes Spiegels (45 ° zu den Seiten des Chips). Die Ausrichtung der Spiegel Rotation wird durch eine goldfarbene Dreieck an einer Ecke auf der Vorderseite des Chips bezeichnet. Der Neigungswinkel der Mikrospiegel bestimmt die Ausrichtung der Tonhöhe und azithmus der eingehenden Beleuchtungsstrahlengang. Die Tonhöhe des Beleuchtungsstrahlengang Bedürfnisse zu 24 ° von der senkrechten Achse des DMD-Chip und azithmus muss senkrecht zur Achse der Spiegel Rotation sein. Präzise Strahlausrichtung ist von entscheidender Bedeutung für einen effizienten Betrieb. In der Prototyp-System entwickelten wir mehrfache manuelle Neigung Anpassungen, die wir für die Konstruktion und Bearbeitung Unzulänglichkeiten zu korrigieren erlaubt. Dies führte zu einem System, das wesentlich sperriger als nötig ist. Alternate, kompaktere Anordnung für die Erhebung in das Licht möglich ist (zeigen alternative Design, wenn als nützlich erachtet werden).

Für Photolyse-Experimenten eine Laserquelle ist erforderlich, um zu erzeugen die hohe Lichtintensität fokussierten Strahl, die für eine schnelle Uncaging. Für optogenetische Experimente, in denen mit hoher Intensität scharf fokussiertem Licht nicht erforderlich ist, würde ein nicht-kohärenten Lichtquelle ausreichend sein. In der Photolyse hier beschriebenen Experiment verwendeten wir eine quasi-kontinuierliche diodengepumpten Festkörper (DPSS) Frequenz verdreifacht NdVO4 Laser (1 W, 355 nm). (Für eine ausführliche Diskussion über die Wahl von Lichtquellen für die Photolyse siehe Referenz 2). Ein relativ hoher Power-Laser ist in den hier beschriebenen Experimenten erforderlich, da nur ein kleiner Bruchteil der Laserleistung ist eigentlich auf die Probe abgegeben, wenn mit einem DMD-System. Die Menge des Lichts geliefert, die Probe ist proportional zum Verhältnis der Anzahl der ON / OFF Spiegel innerhalb der Region durch den Laserstrahl beleuchtet.

Wenn ein Laser-Lichtquelle benötigt wird, ist es am besten auf den Ausgang des Lasers in eine Multimode-Faser zu starten, so dass es leicht Position und orientiert an der richtigen Achse zur Beleuchtung des DMD kann. Die Übertragung des Lichts durch die Glasfaser löst ein zweites Problem, wie die Speckle-Muster inhärent kohärenten Beleuchtung zu beseitigen. Die Faser ist um einen piezoelektrischen Fasern Keilrahmen (Modell 915, Canadian Instrumentation & Research, Ltd), die bei ~ 40 kHz schwingt Wunde. (Punkt dieser in das Rigg) Die mikroskopische Dehnung der Faser ist ausreichend, um bewegt sich der Speckle-Muster viele Male während der Millisekunden für jedes Foto Stimulationsimpulses, so wirkungsvoll eliminiert die Wirkung von Bildrauschen. Der Ausgang der optischen Faser wird anschließend mit einer UV-Mikroskop-Objektiv (Olympus DApo20UV) kollimiert. (Punkt dieser out) Eine Kalibrierung des optischen Auflösung des Systems ist in Abb.. 3B. Die effektive physiologische Auflösung durch die Amplitude des Stromflusses in Abhängigkeit von der Position des Flecks von Foto gemessenStimulation ist in Abb.. 3C. Aktuelle Antworten auf Photostimulation verschiedener Intensitäten sind in Abb. dargestellt. 3D.

Der Betrieb des Systems:

Co-Registrierung der CCD-Pixel mit der DMD-Spiegel

Eine Inhouse-Software geschrieben wurde, der bestimmt, die Korrespondenz der einzelnen DMD-Spiegel auf bestimmte Pixel des Imaging-CCD-Kamera. Die grafische Benutzeroberfläche (GUI) innerhalb dieser Software erlaubt es dem Benutzer, die DMD-Spiegel, die in der Region entspricht auf der CCD-Bildsensor mit der Maus markiert zuweisen. So kann die Location für Foto-Stimulation durch einfaches Bewegen Sie den Cursor über das Bild auf dem Computerbildschirm angezeigt und auf den markierten Bereich von Interesse markiert werden. (A Fluoreszenzbild eines dendritischen Dorn wird auf dem Bildschirm angezeigt werden. Studenten werden eine Reihe von Standorten auf das Bild auf dem Bildschirm zu markieren.)

Die Programmierung der Muster für leichte Lieferwagen

Das Muster auf dem Bildschirm durch den Betreiber markiert ist als eine Reihe von einzelnen Bildern gespeichert. Der Zeitpunkt der Laserpulse für jede räumliche Muster wird dann in die Software, die mit der Datenerfassung Programm (pClamp) integriert ist programmiert. (Demonstrieren).

Die Koordination der Laserpulse auf die DMD-Muster

Die Datenerfassung Programm initiiert und koordiniert das Timing der DMD-Elektronik, die Verknüpfung der Laser und der Übernahme der Patch gespannt elektrisches Signal aus dem Ziel-Neuron. (Simulation dieser Reihenfolge auf dem Computer)

Experimentelle Daten:

Non-lineare Summation über distalen dendritischen Verzweigungen

Dendritische Integration mit Elektroden wurde traditionell durch Variation der Amplitude der Stimulation an diskreten Stellen, anstatt den Ausbau im Bereich der Stimulation bei gleichzeitig konstanter Intensität durchgeführt. Fragen in Bezug auf Sättigung electrogenesis und Rekrutierung von ortsabhängigen Kanäle können das Ergebnis beeinflussen und zum Abschluss. Distributed dendritischen Stimulation kann leicht implementiert werden mit einem DMD-basiertes System (Abb. 4A). Eingang Intensität wurde durch die Erhöhung der Anzahl der Punkte von Photostimulation vielfältig. Wir können sehen, dass die räumliche Summation kann nicht linear Verzweigungspunkte zunehmend supra-linear mit zunehmender Eingangsamplituden Ankunft auf die beiden Tochterzellen Filialen. Die supra-Linearität ist weitgehend NMDA-Rezeptoren vermittelt und nicht auf gated-Kanäle (Abb. 5) Spannung

Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Bedienung der Mikrospiegel in die DMD. (Seitenansicht) Elektrostatische Kräfte an einzelnen Spiegel gerichtet sind, verursachen den Spiegel in eine von zwei möglichen Orientierungen 12 ° von der Horizontalen gekippt werden. In der ON-Position einen einfallenden Strahl entlang der optischen Achse senkrecht des Chips geleitet. In der OFF-Position des einfallenden Strahls ist 48 ° off axis gerichtet. Licht, das die dünne Lücken zwischen den Spiegeln Hits 24 ° off axis gerichtet. (Ansicht von oben) die Neigung ist 45 ° in Bezug auf den Seiten des Spiegel und Chip.

Abbildung 2. Grundaufbau des modernen Fluoreszenzmikroskop. Der Filter Würfel ist in der "Unendlichen Raum" zwischen dem Objektiv und der Tubuslinse positioniert. Es ist ein bildgebendes Weg, um die Kamera führt, und es gibt eine Beleuchtung Weg, der das Licht bringt, um die Probe. Die Tubuslinse für diese beiden Lichtweg sind in der Regel verschiedene in Design und in der Brennweite. Die Beleuchtung, nicht aber die Bildgebung ist Tubuslinse für den Betrieb im UV-Spektrum entwickelt.

Abbildung 3. Layout für UV basiert DMD-System. Ist die Beleuchtung in der UV-Spektrum, dann muss es durch das Rohr Objektiv, das für UV korrigiert gebracht werden. Die Tubuslinse in der Imaging-Pfad ist nicht für UV konzipiert. Ein Relais ist erforderlich, um eine leicht zugängliche Konjugat Bildebene erzeugen. Die verschiedenen konjugierten Bildebenen in das Mikroskop ist durch gestrichelte rote Linien markiert. Helle Muster in einer Bildebene sind in anderen konjugierten Ebenen projiziert. Während die Abbildung des Musters in der Probe Flugzeug ist auf dem Detektor / Kamera projiziert. Für die Beleuchtung des Musters von der DMD erzeugt wird auf die Probe projiziert.

Abbildung 4. Layout für sichtbares Licht DMD-Projektionssystem. Wenn die Beleuchtung Licht im sichtbaren Bereich, ist es möglich, die DMD erzeugten Lichtmuster durch die Bildgebung Lichtweg zu bringen. Dies kann leicht mit commerci umgesetzt werdenal Dual Kamera-Port-Anhänge und die entsprechende dichroitische Spiegel.

Abbildung 5. Laterale Auflösung des Systems. (A) Optische Auflösung auf fluoreszierende Ziel ist ~ 2 um. (B) Effektive Auflösung als durch Photolyse von caged Glutamat über eine Dendriten gemessen ~ 5 um. Die erhöhte Abstand wird durch eine Kombination von Diffusion von Glutamat und die endliche Breite des Dendriten. (C) Photolyse imitieren kann die Kinetik der synaptischen Ereignisse. Die Familie der Spannung geklemmt aktuelle Antworten ist aufgrund von Variationen in der Lichtenergie geliefert, die Dendriten.

Abbildung 6. Nichtlineare Summation über dendritischen Verzweigungen. (A) Distributed-Eingänge sind mit zwei dendritischen Verzweigungen gesondert angewandt. Ihre jeweilige Spannung Reaktionen sind unten dargestellt. (B) Die Reize werden dann gleichzeitig gegeben. Die gemessene Reaktionszeit (rote Kurve) ist anders als die arithmetische Summe der beiden einzelnen Reaktionen (graue Kurve).

Abbildung 7. Supralinear Summation NMDA-Rezeptor-abhängige. (A) APV, blockiert eine selektive NMDA-Rezeptor-Antagonist der supralinear Summation. (B) Die Reizintensität Beziehung und ihre Empfindlichkeit gegenüber NMDA-Rezeptor-Antagonist aufgetragen ist.

Discussion

Der Vorteil der DMD basiert Photostimulation Ansatz zeigt sich besonders deutlich in Situationen, wo das Ziel liegt in einem relativ großen Bereich. Wenn das Ziel von Interesse ist sehr klein, wie ein paar dendritische Dornen, sind sequentielle konfokalen und 2-Photonen-Systeme wahrscheinlich der bessere Ansatz sein. Eine wesentliche Schwäche des DMD-Ansatz ist die ineffiziente Nutzung der verfügbaren Licht. Der Großteil der verfügbaren Licht ist unbedingt auf die OFF Spiegel gerichtet und nicht verwendet.

Die DMD basiertes System ist am besten für den Betrieb in den sichtbaren Bereich geeignet. Wir gehen davon aus DMD basiert Photostimulation Systeme werden einen erheblichen Einfluss machen, wenn sie mit Optogenetik Experimenten beschäftigt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355