ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Dijital micromirror cihazları (DMD) nöronal eksitabilite kontrol etmek için zaman ve mekan karmaşık desenleri oluşturabilirsiniz. Tasarım, inşaat, ve DMD sistemlerinin işletilmesi ile ilgili konular görüşülüyor. Böyle bir sistem, distal dendritik dallanma noktaları arasında doğrusal olmayan entegrasyon gösteri sağladı.
Abstract
Işık nöronal eksitabilite kontrol etmek için çok yönlü ve hassas bir araçtır. Kanal rodopsin ve kafesli nörotransmitterlerin gibi ışığa duyarlı etkileyiciler son giriş, ışık alan ve deneysel nörobilim için yararlı kalıplarını kontrol etmek için daha iyi anlamına gelir gelişmekte olan çıkarları için yol açmıştır. Konfokal ve 2-foton mikroskopi çalışan geleneksel bir strateji, bir kırınım sınırlı noktaya ışık odaklanma ve daha sonra ilgi bölge üzerinde sırayla o tek nokta tarama. Bu yaklaşım, geniş alanlar kısa bir zaman penceresi içinde, görüntüleme için daha photostimulation daha uygulanabilir bir sorun uyarılmış olması durumunda sorunlu olur. Alternatif bir strateji, bir dijital micromirror cihazı (DMD) yardımı ile hedef tam mekansal desen proje. DMD yaklaşım donanım bileşenleri nispeten ucuz olduğu için cazip ve ticari çıkarları tarafından desteklenmektedir. Böyle bir sistemin dik mikroskoplar için geçerli değildir, çünkü biz böyle bir DMD sisteminin inşaat ve operasyonlarında kritik konular ele alınacaktır. Optogenetic deneyler için çok daha basit görünür ışık sistemi oluşturmak için, öncelikle UV fotoliz sisteminin inşaat açıklayan olacak olsa da, değişiklikler de sağlanacaktır. UV fotoliz sistemi nörobilim temel bir soru çalışma deneyleri carryout için kullanılan mekansal distal dendritik dallanma noktaları arasında entegre girişleri nasıl dağıtılır. Entegrasyon şube noktaları arasında doğrusal olmayan ve supralinearity büyük ölçüde NMDA reseptörleri aracılık öneririz.
Protocol
Genel tasarım konuları
Fotoğraf stimülasyon dalga boyu optogenetic deneyler gibi görünür aralığı ise, sistemin düzenini UV fotoliz deneyler için çok daha basit olacaktır. Bir tek mikroskop şirketlerin tüm kullanılabilir bir çift kamera port modülü satın almak gerekiyor. DMD düzlemde iki kamera limanlarından birini eşlenik görüntü düzlemine yerleştirilmiş olabilir. Ama kamera görüntüleme tüp lens, piyasada bulunan mikroskoplar herhangi bir UV dalgaboyu için düzeltilmiş çünkü UV fotoliz DMD kaynaklanan ışık, epi-aydınlatma yolu (Şekil 3A) aracılığıyla getirilen olmalıdır. 350 nm'de görüntüleme tüp lens küresel aberasyon, dar bir noktaya ışık odaklanmak için yeterli uzaysal çözünürlük oluşturmak için yeteneği engelleyecek kadar şiddetli. Collimated bir lazer ışını aynı optik eksen boyunca getirilen tüp lens kaldırılmış olduğundan, bu sorun konfokal mikroskopi karşılaşılan değildir. Orada tüp lensler, UV dalga boyunda küresel aberasyon kısmen giderilmiştir, çünkü UV aydınlatma sorunu epi-floresan yolu ışık getirmek tarafından çözülebilir. Biz herhangi bir derecede dergi dilek optik mikroskoplar genişletebilirsiniz. Bilimsel topluluk bu konuda genel hızlı ilgi ve iyi öğreten pek çok kaynak var.
Mikroskop değişiklikleri en aza indirmek ve epi-floresan birim sıkı alan kısıtlamaları nedeniyle amacıyla, DMD bir röle lens (DMD ünitesi pozisyonu ile ilgili olarak işaret tarafından oluşturulan yeni oluşturulan eşlenik görüntü düzlemi yer almaktadır mikroskop). Ticari bir UV röle objektif (diyagram ve mikroskop işaret) (Özel Optik) satın alındı düzeltildi.
DMD aydınlatma
Ikili giriş aldıktan sonra micromirror olumlu ve olumsuz bir 12 ° eğim çip düzlemine göre arasında geçiş yapabilirsiniz. Dönme eksenine çapraz köşeleri boyunca her ayna (çip taraf için 45 °). Ayna dönüş yönünü çip ön yüzeyi bir köşesinde altın renkli üçgen ile belirlenir. Micromirror eğim açısı gelen ışık demetinin pitch ve azithmus hizalama belirler. Aydınlatma demetinin adım DMD çipi ve azithmus ihtiyaçlarını ayna dönme eksenine dik dik eksen ile 24 ° olması gerekir. Hassas ışın uyum verimli çalışması için kritik öneme sahiptir. Prototip sistem tasarım ve işleme yetersizliklerini düzeltmek için izin birden fazla manuel tilt ayarlamaları tasarlanmıştır. Bu gereklidir göre çok daha hantal bir sistem sonuçlandı. Işık getirmek için alternatif, daha kompakt bir düzenleme (faydalı gördüğü takdirde alternatif tasarım) mümkündür.
Fotoliz deneyler için bir lazer kaynağı, yüksek ışık yoğunlukta odaklanmış ışın hızlı uncaging için gerekli oluşturmak için gereklidir. Optogenetic deneyler için yüksek yoğunluklu keskin odaklanmış ışık gerekli değildir, tutarlı olmayan bir ışık kaynağı yeterli olacaktır. Fotoliz deneyi burada açıklanan yarı-sürekli bir diyot frekansı NdVO4 lazer (1 W, 355 nm) üçe katı hal (DPSS) pompalanır kullandı. (Fotoliz ışık kaynağı seçenekleri ayrıntılı bir tartışma için bkz. Referansı 2). Nispeten yüksek güçlü lazer DMD bir sistemi kullanarak lazer çıkışı sadece küçük bir bölümünü aslında numune teslim edilir, çünkü burada açıklanan deneyler gereklidir. Miktar numune teslim ışık, lazer ışını ile aydınlatılan bölgenin içinde ON / OFF aynalar sayısının oranına orantılıdır.
Bir lazer ışık kaynağı gerekiyorsa, DMD aydınlatmak için doğru ekseni boyunca kolayca konumunu ve odaklı böylece multimode fiber lazer çıkış başlatmak için en iyisidir. Fiber optik ışık Verici tutarlı aydınlatma doğasında speckle desenler nasıl ortadan kaldırmak için, ikinci bir sorunu çözer. Fiber ~ 40 kHz dolaşacaktır bir piezoelektrik fiber sedye (model 915, Kanada Enstrümantasyon ve Araştırma Ltd) etrafında sarılır. (Teçhizat nokta bu dışarı) fiber uzanan mikroskopik bu nedenle etkili speckling etkisini ortadan kaldırarak, her fotoğraf stimülasyon darbe milisaniye süresince pek çok kez desen speckle hamle için yeterli. Fiber optik çıkış, daha sonra bir UV mikroskop (Olympus DApo20UV) amacı ile collimated. (Bu çıkış noktası), sistemin optik çözünürlük bir kalibrasyon Şekil. 3b. Etkili fizyolojik çözünürlük fotoğraf spot pozisyonun bir fonksiyonu olarak akım genliği ölçülenstimülasyon Şekil. 3C. Şekil farklı yoğunluklarda photostimulation mevcut tepkiler gösterilmiştir. 3D.
Sistemin işleyişi:
DMD aynalar ile birlikte kayıt CCD piksel
Bir in-house yazılım görüntüleme CCD kamera belirli piksel bireysel DMD ayna yazışmalar belirler yazılmıştır. Bu yazılım içinde grafik kullanıcı arayüzü (GUI) sonra kullanıcının fare ile etiketlenen CCD görüntü bölgeye karşılık gelen DMD aynalar atamanıza olanak sağlar. Böylece, fotoğraf uyarılması için yerini sadece bilgisayar ekranında görüntülenen resmin üzerine imleci hareket ve ilgi etiketli bölge tıklayarak etiketlenir. (Dendritik çardak Bir floresan görüntü bilgisayar ekranında görüntülenir. Öğrenci, bilgisayar ekranındaki görüntü üzerinde bir takım yerlerden işareti olacaktır.)
Işık teslimat için desen Programlama
Operatör tarafından bilgisayar ekranında işaretlenmiş desen ayrı bir görüntü bir dizi olarak saklanır. Her mekansal desen için lazer darbeleri zamanlaması sonra, veri toplama programı (pClamp) ile entegre yazılımı içine programlanmıştır. (Bunu göstermek).
DMD desen lazer bakliyat Koordinasyon
Veri toplama programı başlatan ve hedef nöron elektrik sinyali kelepçeli DMD elektronik, lazer yolluk ve yama satın alma zamanlaması koordinatları. (Bilgisayarda bu sıra taklit)
Deneysel veriler:
Distal dendritik dallanma noktaları arasında non-lineer toplamı
Elektrotlar ile Dendritik entegrasyon geleneksel yerine ayrık noktada stimülasyon genliği değişen sabit bir yoğunluğunu korurken stimülasyon alanında genişleyen yapılmıştır. Electrogenesis doygunluğu ve konum bağımlı kanallar alımı ile ilgili Sorunlar ve sonuç sonucu etkileyebilir. Dağıtılmış dendritik stimülasyon DMD tabanlı bir sistem (Şekil 4A) kullanarak kolayca uygulanabilir. Giriş yoğunluğu photostimulation, noktaların sayısını artırarak göre değişmektedir. Biz mekansal toplamı iki kızı dallar üzerinde gelen artan girdi genlikleri ile giderek supra-lineer hale dallanma noktaları arasında non-lineer olabilir görebilirsiniz. Supra-doğrusallık büyük ölçüde NMDA reseptörleri aracılık eder ve kapılı kanalları (Şekil 5) gerilimi
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 DMD micromirrors Operasyonu. (Yandan görünüm) bireysel aynalar yönelik Elektrostatik kuvvetler, iki olası yönelimleri 12 ° yatay bir ayna yatırılabilir neden olur. ON konumunda bir olay ışını çip optik eksen dik boyunca yönetti. KAPALI konumunda olay ışın 48 ° off eksen yönlendirilir. Işık aynalar arasında ince boşluklar vurur 24 ° eksen yönlendirilir. (Üstten görünüm) eğim yönelik 45 ° aynalar ve çip taraf için saygı ile.
Şekil 2 modern floresan mikroskop Temel düzen. Filtre küp, nesnel ve tüp objektif arasındaki "sonsuz alan" bir konuma sahiptir. Kamera yol açar ve örnek ışık getiren bir aydınlatma yolu bir görüntüleme yolu yoktur. Bu iki ışık yolu için tüp lens genellikle tasarım ve odak uzaklığı farklıdır. Aydınlatma, ama görüntüleme, tüp lens UV spektrumu içinde çalışması için tasarlanmıştır.
Şekil 3 UV bazlı DMD sistemi için Düzen. Aydınlatma UV spektrumu ise, o zaman UV düzeltilir tüp lens aracılığıyla getirilen olmalıdır. Görüntüleme yolu tüp lens UV için dizayn edilmemiştir. Bir röle sistemi kolayca erişilebilir bir eşlenik görüntü düzlemi oluşturmak için gerekli. Mikroskop farklı eşlenik görüntü uçakları noktalı kırmızı bir çizgi ile işaretlenir. Parlak bir görüntü düzlemi modellerini diğer konjuge uçakları tahmin edilmektedir. Görüntüleme sırasında örnek düzlemde desen dedektör / kamera yansıtılıyor. Aydınlatma için DMD tarafından oluşturulan desen örnek yansıtılıyor.
Şekil 4, görünür ışık DMD projeksiyon sistemi için Düzen . Aydınlatma ışığı görünür aralığı ise, görüntüleme ışık yolu DMD oluşturulan ışık deseni getirmek mümkündür. Bu commerci ile kolayca uygulanabiliral çift kamera takılabilir ve uygun dikroik ayna.
Şekil 5 sistem Lateral çözünürlük. (A) floresan hedef Optik çözünürlük ~ 2 mm. (B) bir dendrit arasında kafesli glutamat fotoliz tarafından ölçülen Etkin çözünürlük ~ 5 mm. Mesafenin artması glutamat difüzyon ve dendrit sonlu genişlikte bir kombinasyonu kaynaklanmaktadır. (C) Fotoliz kinetiği sinaptik olayların taklit edebilir. Gerilim aile mevcut yanıtları dendrit teslim ışık enerjisi farklılıklar nedeniyle kelepçeli.
Şekil 6 dendritik dallanma noktaları arasında non-lineer toplamı. (A) Dağıtılmış girişleri iki dendritik dalları için ayrı ayrı uygulanır. Kendi gerilim yanıtları aşağıda gösterilmiştir. (B) uyaranlara daha sonra aynı anda verilmiştir. Ölçülen tepki (kırmızı eser) iki ayrı yanıtlar (gri iz) aritmetik toplamından daha farklı.
Şekil 7 Supralinear toplamı NMDA reseptör bağımlı. (A) APV, seçici bir NMDA reseptör antagonisti supralinear toplamı engeller. (B) uyaran yoğunluğu ilişki ve NMDA reseptör antagonisti olan duyarlılığını çizilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DMD tabanlı photostimulation yaklaşımın avantajı en belirgin durumlar için hedef, göreceli olarak büyük bir alanı kaplar. Ilgi hedef birkaç dendritik dikenler gibi, çok küçük ise, sıralı tarama konfokal ve 2-foton sistemleri daha iyi bir yaklaşım olması muhtemeldir. DMD yaklaşım önemli zayıflık mevcut ışık verimsiz kullanımı. Mevcut ışık toplu mutlaka OFF aynalar ve kullanılmaz.
DMD tabanlı sistem, en iyi görünür aralığında işlem için uygundur. Biz optogenetics deneyler ile istihdam DMD tabanlı photostimulation sistemleri önemli bir etkisi yapacak tahmin ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, C. VA Araştırma Servisi-MT NIH ve Başarı bir RO1 tarafından desteklenen ve CWL bireysel bir NRSA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modern upright fluorescent microscope | |||
| CCD camera and image acquisition software | |||
| Computer and data acquisition/interface system | |||
| DLP Discovery Developer Kit | |||
| ALP3 USB interface | |||
| S2 + Optics w/LED | |||
| Dual camera port unit | |||
| 355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W) | DPSS Laser Inc. | ||
| Laser shutter Model LS6 | Uniblitz | ||
| Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915 | Canadian Instrument and Research, Ltd | 100 um core multimode fiber | |
| Multimode Fiber launcher | Oz Optics | ||
| Signal generator | up to 50 kHz | ||
| Beam collimator | Olympus Corporation | DApo20UV340 | |
| UV relay lens | Special Optics | #: 54-25-60-355 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Tang, C. Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery. Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).
- Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated. Nature. 456, 826-827 (2008).
- Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V.
- Hornbeck, L. J. Digital Light Processing and MEMs: An overview. , Texas Instrument White Papers. Forthcoming.
Tags
Biyomühendislik Sayı 49 DMD fotoliz dendrit photostimulation DLP optogeneticsErratum
Formal Correction: Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points
Posted by JoVE Editors on 03/24/2011.
Citeable Link.
A correction was made to Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. There was an error with an author's name. The author's middle name had a typo, this corrected to:
M. Daniel Santos
instead of:
M. Danial Santos.
