Mönstrade Photostimulation med Digital Micromirror enheter för att undersöka Dendritiska integrationen över Branch poäng

Summary

Digital Micromirror enheter (DMD) kan generera komplexa mönster i tid och rum som man kan styra neuronala retbarhet. Frågor av betydelse för utformning, byggande och drift av DMD system diskuteras. Ett sådant system gjorde det möjligt för demonstration av icke-linjära integration mellan distala dendritiska gren poäng.

Abstract

Ljus är en mångsidig och exakt sätt att kontrollera neuronala retbarhet. Införandet nyligen av ljuskänsliga effektenheter som kanal-rhodopsin och bur signalsubstanser har lett till intressen i att utveckla bättre sätt att kontrollera mönster av ljus i tid och rum som är användbara för experimentell neurovetenskap. En vanlig strategi som används i konfokala och 2-fotonen mikroskopi, är att fokusera ljus till en diffraktion begränsad plats och sedan skanna den enda platsen sekventiellt över regionen av intresse. Detta förhållningssätt blir problematiskt om stora områden skall stimuleras inom en kort tidsintervall, ett problem som mer gäller för photostimulation än för avbildning. En alternativ strategi är att projicera hela geografiska mönster på målet med hjälp av en digital micromirror device (DMD). Det DMD tillvägagångssätt är tilltalande eftersom maskinvarukomponenter är relativt billiga och stöds av kommersiella intressen. Eftersom ett sådant system inte är tillgängligt för upprätt mikroskop, kommer vi att diskutera viktiga frågor i byggandet och driften av ett sådant DMD system. Även om vi främst kommer att beskriva uppbyggnaden av systemet för UV fotolys, kommer de ändringar för att bygga mycket enklare synligt ljus för optogenetic experiment också tillhandahållas. UV fotolys systemet användes för att carryout experiment för att studera en grundläggande fråga inom neurovetenskap, hur rumsligt fördelad ingångar samordnas mellan distala dendritiska gren poäng. Resultaten tyder på att integration kan vara icke-linjär i grenen poäng och supralinearity är till stor del medieras av NMDA-receptorer.

Protocol

Allmän konstruktion överväganden

Om våglängden av foto stimulering är i det synliga området, till exempel för optogenetic experiment, kommer utformningen av systemet betydligt enklare än för UV fotolys experiment. Man behöver bara köpa en dual-modul kamera port som är tillgänglig från alla mikroskop företag. Den DMD planet kan placeras på konjugat bildplanet av antingen en av de två kamerans portar. Men i UV-fotolys ljuset kommer från DMD måste föras in genom epi-belysning vägen (Fig. 3A), eftersom imaging röret lins vilket leder till att kameran inte är korrigerad för UV-våglängdsområdet i någon av de kommersiellt tillgängliga mikroskop. Den sfäriska aberrationen i bildhantering röret objektiv vid 350 nm är allvarlig nog för att förhindra att förmågan att fokusera ljus till en knipa och för att generera tillräckligt med rumslig upplösning. Detta problem är inte stött på konfokalmikroskopi eftersom röret linsen tas bort när en kollimerad laserstråle väcks i längs samma optiska axeln. Problemet med UV-belysning kan lösas genom att ta in ljus genom epi-fluorescerande vägen eftersom röret linser finns alla delvis korrigerade för sfärisk aberration på UV-våglängdsområdet. Vi kan expandera på optiken i mikroskop för att någon grad tidskriften önskemål. Det vetenskapliga samfundet är i allmänhet snabbt intresserad av detta ämne och det finns inte många källor som lär den väl.

För att minimera ändringar i mikroskop och på grund av trånga utrymmesbrist vid epi-fluorescens enhet, är DMD placeras på en nyskapad konjugat bildplanet som skapats av ett relä lins (påpeka position DMD enhet i förhållande till mikroskop). En kommersiell UV korrigeras relä objektiv köptes (Specialiserade Optics) (punkt ut i diagrammet och på mikroskop).

Belysning av DMD

Vid mottagande av sin digitala in en micromirror kan växla mellan en positiv och en negativ 12 ° lutning i förhållande till planet av chipet. Den rotationsaxeln längs diagonalen hörnen av varje spegel (45 ° åt sidorna av chipet). Inriktningen av spegeln rotation utsetts av en guldfärgad triangel i ena hörnet på främre ytan av chipet. Den vinkel i micromirror dikterar anpassningen av planen och azithmus av inkommande ljus strålen. Tonhöjden belysningen balken behöver 24 ° från normalen axel DMD chip och behöver azithmus vara vinkelrätt mot axeln av spegeln rotation. Exakt ljushöjden är avgörande för effektiv drift. I den prototyp vi designat flera manuella luta justeringar som tillät oss att korrigera för design och bearbetning brister. Detta resulterade i ett system som är betydligt mer skrymmande än nödvändigt. Alternativa, mer kompakt arrangemang för att föra in ljuset är möjligt (visa alternativ design om anses nyttigt).

För fotolys experiment en laserkälla krävs för att generera hög ljusintensitet fokuserad ljusstråle som krävs för snabb uncaging. För optogenetic experiment där hög intensitet skarpt fokuserat ljus inte krävs, skulle ett icke-koherent ljuskälla vara tillräcklig. I fotolys experiment som beskrivs här har vi anställt en kvasi-kontinuerligt diod pumpas solid state (DPSS) frekvens tredubblats NdVO4 laser (1 W, 355 nm). (För en detaljerad diskussion om val av ljuskällor för fotolys se referens 2). En relativt hög effekt laser krävs i de experiment som beskrivs här eftersom endast en liten del av laser utgången är faktiskt levereras med förebilden när man använder en DMD-system. Mängden ljus som levereras till provet är proportionell mot förhållandet mellan antalet ON / OFF speglar inom regionen belyses av laserstrålen.

Om en laser ljuskälla behövs, är det bäst att starta produktionen av lasern i en multimodfiber så att den lätt kan position och orienterade längs korrekta axeln för att belysa DMD. Överföring av ljus genom optiska fibrer löser ett annat problem, hur man eliminera speckle mönster inneboende enhetlig belysning. Fibern är lindad runt en piezoelektrisk fiber bår (modell 915, kanadensisk Instrumentation & Research Ltd), som oscillerar vid ~ 40 kHz. (Punkt redovisats i riggen) Den mikroskopiska sträckning av fiber är tillräcklig för att flyttas speckle mönster många gånger under millisekunder länge varje foto stimulering puls, vilket effektivt eliminerar effekten av fläckar. Resultatet av den optiska fibern är då parallellt med en UV-mikroskop mål (Olympus DApo20UV). (Påpekar detta) En kalibrering av den optiska upplösningen av systemet visas i figur. 3B. Den effektiva fysiologiska upplösningen mätt som amplituden på strömmen som funktion av positionen för platsen av fotostimulering visas i figur. 3C. Dagens svar på photostimulation av olika intensitet illustreras i figur. 3D.

Driften av systemet:

Co-registrering av CCD pixlar med DMD speglar

En in-house mjukvara skriven som bestämmer korrespondens enskilda DMD-speglar till specifika pixlar för bildbehandling CCD-kamera. Grafiken användargränssnitt (GUI) i denna programvaran kan sedan användaren att tilldela DMD speglar som motsvarar den region på CCD taggade med musen. Därmed kan platsen för fotot stimulering märkas genom att helt enkelt flytta markören över bilden visas på datorskärmen och klicka på taggade regionen av intresse. (En fluorescerande bild av en dendritiska berså kommer att visas på datorskärmen. Student kommer att markera ett antal platser över bilden på datorskärmen.)

Programmering av mönster för lätta leverans

Mönstret markerade på datorskärmen av operatören lagras som en rad separata bilder. Tidpunkten för laserpulser för varje rumslig mönster sedan programmeras in i mjukvaran som är integrerat med datainsamling programmet (pClamp). (Visa detta).

Samordna laserpulser till DMD mönster

Den datainsamling programmet initierar och samordnar tidpunkten för DMD elektronik, i gaten av lasern, och förvärvet av plåstret fastspänd elektrisk signal från målet neuron. (Simulera denna sekvens på datorn)

Experimentella data:

Icke-linjär summering över distala dendritiska gren poäng

Dendritiska integration med elektroder har traditionellt utförts genom att variera amplituden av stimulering på diskreta platser snarare än att utvidga det område av stimulering samtidigt som en konstant intensitet. Frågor om mättnad electrogenesis och rekrytering av plats beroende kanaler kan påverka resultatet och slutsatsen. Distribuerad dendritiska stimulering lätt kan genomföras med hjälp av en DMD-baserat system (Fig. 4A). Ingång intensitet varierades genom att öka antalet fläckar av photostimulation. Vi kan se att spatial summation kan vara icke-linjär i branschen pekar allt mer överstatlig linjärt med ökande ingång amplituder som anländer till två dotter grenarna. Den supra-linjäritet är till stor del medieras NMDA-receptorer och inte spänningsstyrda kanaler (bild 5)

Representativa resultat

Figur 1. Driften av mikrospeglar i DMD. (Från sidan) Elektrostatiska krafter riktade till enskilda speglar orsaka spegeln lutas i en av två möjliga inriktningar 12 ° från horisontalplanet. I läge ON en infallande strålen är riktad längs den optiska axeln vinkelrät av chipet. I läge OFF infallande strålen riktas 48 ° från axeln. Ljus som träffar den tunna klyftor mellan speglarna är riktad 24 ° från axeln. (Uppifrån) lutningen är orienterad 45 ° i förhållande till sidorna av speglar och chip.

Figur 2. Grundläggande layouten av den moderna fluorescerande mikroskop. Filtret kuben är placerad i "oändligheten utrymme" mellan målet och röret linsen. Det finns en avbildning stig som leder till kameran och det finns en ljus väg som leder ljuset till provet. Röret glas för dessa två lätta vägen är oftast olika i design och i brännvidd. Belysningen, men inte avbildning, är röret lins konstruerade för drift i UV-spektrumet.

Figur 3. Layout för UV-baserade DMD-systemet. Om belysningen är i UV-spektrumet, då måste det föras genom röret lins som är korrigerad för UV. Röret linsen i avbildning väg är inte utformad för UV. Ett relä system behövs för att skapa en lättillgänglig plan konjugat bild. De olika konjugat Bilden plan i mikroskop är markerad med streckade röda linjer. Bright mönster i ett bildplan projiceras på andra konjugat plan. Under avbildning mönstret i provet planet projiceras på detektor / kamera. För belysning mönstret som genereras av DMD projiceras på prov.

Figur 4. Layout för synligt ljus DMD projektionssystem. Om belysning ljus i det synliga området, är det möjligt att föra DMD genereras ljusmönstret genom avbildning ljusstrålen. Detta kan enkelt genomföras med commercial dubbla kameraport bilagor och lämplig dikroiskt spegeln.

Figur 5. Lateral upplösning av system. (A) Optisk upplösning på fluorescerande mål är ~ 2 ìm. (B) Effektiv upplösning mätt genom fotolys av bur glutamat över en Dendrite är ~ 5 ìm. Den ökade avståndet beror på en kombination av spridning av glutamat och finita bredd Dendrite. (C) Fotolys kan härma kinetiken av synaptiska händelser. Familjen av spänning fastklämd Dagens svar beror på variationer i ljuset energi som levereras till Dendrite.

Figur 6. Icke-linjär summering över dendritiska gren poäng. (A) Distributed ingångar tillämpas på två dendritiska grenar sig. Deras respektive spänning svar visas nedan. (B) stimuli får sedan samtidigt. Den uppmätta svar (rött spår) är annorlunda än den aritmetiska summan av de två individuella svar (grå spår).

Figur 7. Supralinear summering är NMDA-receptorn beroende. (A) APV, blockerar en selektiv NMDA-receptorantagonist de supralinear summering. (B) stimulusintensitet relationen och dess känslighet för NMDA-receptorantagonist ritas.

Discussion

Fördelen med DMD-baserade photostimulation strategi är mest uppenbara för situationer där målet upptar ett relativt stort område. Om målet av intresse är mycket litet, till exempel ett par Dendritutskotten, sekventiell skanning konfokala och 2-photon system kommer sannolikt att vara det bättre tillvägagångssätt. En betydande svaghet i DMD metoden är dess ineffektivt utnyttjande av tillgängligt ljus. Huvuddelen av tillgängligt ljus nödvändigtvis riktat till OFF speglar och inte används.

Det DMD-baserat system som är bäst lämpad för drift i det synliga området. Vi räknar med DMD baserade photostimulation system kommer att göra en betydande inverkan när de används med optogenetics experiment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355