Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Helgenomsekventering til hurtig karakterisering af rabiesvirus ved hjælp af nanoporeteknologi

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65414
Automatic Translation
1,2, 1,3,4,5, 1,6, 1, 1, 1,6, 7,8, 3,9, 1, 1,6
1School of Biodiversity, One Health & Veterinary Medicine, University of Glasgow, 2Research Institute for Tropical Medicine, 3University of Nairobi, Institute of Tropical and Infectious Diseases, 4Tanzania Industrial Research Development Organization, 5Ifakara Health Institute, 6MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, 7Department of Veterinary Public health, Ahmadu Bello University, 8African Centre of Excellence for Neglected Tropical Diseases and Forensic Biotechnology, Ahmadu Bello University, 9University of Nairobi, Kenya and Center for Epidemiological Modelling and Analysis, University of Nairobi

Summary

Her præsenterer vi en hurtig og omkostningseffektiv arbejdsgang til karakterisering af rabiesvirus (RABV) genomer ved hjælp af nanoporeteknologi. Arbejdsprocessen er beregnet til at støtte genomisk informeret overvågning på lokalt plan og give information om cirkulerende RABV-slægter og deres placering inden for regionale fylogenier for at vejlede rabieskontrolforanstaltninger.

Abstract

Genomiske data kan bruges til at spore overførsel og geografisk spredning af infektionssygdomme. Den sekventeringskapacitet, der kræves til genomisk overvågning, er imidlertid fortsat begrænset i mange lav- og mellemindkomstlande (LMIC'er), hvor hundemedieret rabies og / eller rabies, der overføres af vilde dyr som vampyrflagermus, udgør store folkesundhedsmæssige og økonomiske bekymringer. Vi præsenterer her en hurtig og overkommelig prøve-til-sekvens-til-fortolkningsarbejdsgang ved hjælp af nanoporeteknologi. Protokoller til prøveindsamling og diagnosticering af rabies beskrives kort efterfulgt af detaljer om den optimerede arbejdsgang for helgenomsekventering, herunder primerdesign og optimering til multiplexpolymerasekædereaktion (PCR), en modificeret, billig sekventeringsbiblioteksforberedelse, sekventering med live og offline baseopkald, genetisk afstamningsbetegnelse og fylogenetisk analyse. Implementering af arbejdsgangen demonstreres, og kritiske trin fremhæves for lokal implementering, såsom pipelinevalidering, primeroptimering, inkludering af negative kontroller og brug af offentligt tilgængelige data og genomiske værktøjer (GLUE, MADDOG) til klassificering og placering inden for regionale og globale fylogenier. Behandlingstiden for arbejdsprocessen er 2-3 dage, og omkostningerne varierer fra $ 25 pr. prøve for en prøvekørsel på 96 til $ 80 pr. prøve for en prøvekørsel på 12. Vi konkluderer, at opsætning af genomisk overvågning af rabiesvirus i LMIC'er er mulig og kan understøtte fremskridt mod det globale mål om nul hundemedierede humane rabiesdødsfald inden 2030 samt forbedret overvågning af spredning af rabies i dyrelivet. Desuden kan platformen tilpasses andre patogener, hvilket hjælper med at opbygge en alsidig genomisk kapacitet, der bidrager til epidemisk og pandemisk beredskab.

Introduction

Rabiesvirus (RABV) er et lyssavirus i familien Rhabdoviridae , der forårsager en dødelig neurologisk sygdom hos pattedyr1. Selv om rabies kan forebygges 100 % ved vaccination, er det fortsat et stort folkesundhedsmæssigt og økonomisk problem i endemiske lande. Af de 60.000 menneskelige rabiesdødsfald, der anslås at forekomme hvert år, er over 95% i Afrika og Asien, hvor hunde er det primære reservoir2. I modsætning hertil har hundevaccination ført til eliminering af hundemedieret rabies i hele Vesteuropa, Nordamerika og meget af Latinamerika. I disse regioner er reservoirer af rabies nu begrænset til dyreliv, såsom flagermus, vaskebjørne, stinkdyr og vilde hunde3. På tværs af Latinamerika er den almindelige vampyrflagermus en problematisk kilde til rabies på grund af regelmæssig overførsel af afsmittende virkninger fra flagermus til både mennesker og husdyr under natlig blodfodring4. Den årlige globale økonomiske virkning af rabies anslås at være 8,6 milliarder dollars, hvor tab af husdyr tegner sig for 6%5.

Sekvensdata fra virale patogener kombineret med metadata om tidspunktet for og kilden til infektioner kan give robust epidemiologisk indsigt6. For RABV er sekventering blevet brugt til at undersøge oprindelsen af udbrud7,8, identificere værtsforeninger med vilde dyr eller husdyr 8,9,10,11,12 og spore kilder til humane tilfælde 13,14. Udbrudsundersøgelser ved hjælp af fylogenetisk analyse har vist, at rabies opstod i den tidligere rabiesfrie provins Bali, Indonesien, gennem en enkelt introduktion fra de nærliggende endemiske områder Kalimantan eller Sulawesi15. I mellemtiden viste det sig i Filippinerne, at et udbrud på Tablas Island, Romblon-provinsen blev introduceret fra hovedøen Luzon16. Virale genomdata er også blevet brugt til bedre at forstå patogenoverførselsdynamikken, der er nødvendig for at målrette kontrolforanstaltninger geografisk. For eksempel illustrerer genomisk karakterisering af RABV den geografiske klyngedannelse af klader 17,18,19, co-cirkulation af slægter 20,21,22, menneskemedieret viral bevægelse 17,23,24 og metapopulationsdynamik 25,26.

Sygdomsovervågning er en vigtig funktion af genomisk overvågning, der er blevet forbedret med den globale stigning i sekventeringskapacitet som reaktion på SARS-CoV-2-pandemien. Genomisk overvågning har understøttet realtidssporing af SARS-COV-2-varianter af bekymring27,28 og tilknyttede modforanstaltninger6. Fremskridt inden for tilgængelig sekventeringsteknologi, såsom nanoporeteknologi, har ført til forbedrede og mere overkommelige protokoller til hurtig sekventering af både humane 29,30,31,32 og dyr33,34,35 patogener. I mange rabiesendemiske lande er der imidlertid stadig hindringer for operationalisering af patogengenomisk overvågning, som det fremgår af globale forskelle i SARS-CoV-2-sekventeringskapacitet36. Begrænsninger i laboratorieinfrastruktur, forsyningskæder og teknisk viden gør etablering og rutinisering af genomisk overvågning udfordrende. I dette papir demonstrerer vi, hvordan en optimeret, hurtig og overkommelig helgenomsekventeringsarbejdsgang kan implementeres til RABV-overvågning i ressourcebegrænsede indstillinger.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt af Medical Research Coordination Committee of the National Institute for Medical Research (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), ministeriet for regional forvaltning og lokale myndigheder (AB.81/288/01) og Ifakara Health Institute Institutional Review Board (IHI/IRB/No:22-2014) i Tanzania; University of Nairobi Institute of Tropical and Infectious Diseases (P947/11/2019) og Kenya Medical Research Institute (KEMRI-SERU; protokol nr. 3268) i Kenya; og Research Institute for Tropical Medicine (RITM), Department of Health (2019-023) i Filippinerne. Sekventering af prøver fra Nigeria blev foretaget på arkiveret diagnostisk materiale indsamlet som led i den nationale overvågning.

BEMÆRK: Afsnit 1-4 er forudsætninger. Afsnit 5-16 beskriver prøve-til-sekvens-til-fortolkning-arbejdsgangen for RABV nanoporesekventering (figur 1). For efterfølgende trin i protokollen, der har brug for pulscentrifugering, centrifugeres ved 10-15.000 x g i 5-15 s.

1. Opsætning af beregningsmiljø til sekventering og dataanalyse

  1. Åbn Oxford Nanopore Technology (ONT) hjemmeside37 og opret en konto for at få adgang til nanopore-specifikke ressourcer.
    1. Log ind og installer ONT-sekventerings- og basecalling-softwaren38.
  2. Åbn GitHub39 , og opret en konto.
    1. Gå til artic-rabv40 og MADDOG repositories41 og følg installationsvejledningen.

2. Design eller opdater multiplex-primerskemaet

BEMÆRK: Eksisterende RABV-ordninger er tilgængelige i artic-rabv-depotet40. Når der fokuseres mod et nyt geografisk område, bør der udformes en ny ordning, eller en eksisterende ordning bør ændres for at inkorporere yderligere mangfoldighed.

  1. Vælg et genomreferencesæt til at repræsentere mangfoldigheden i undersøgelsesområdet; Dette er typisk et sæt offentligt tilgængelige sekvenser (f.eks. fra NCBI GenBank) eller foreløbige interne data. Følg trin 2.1.1 for at bruge RABV-GLUE42, en RABV-sekvensdataressource, til at filtrere og downloade NCBI-sekvenser og tilknyttede metadata.
    BEMÆRK: Vælg referencesekvenser med komplette genomer (dvs. uden huller og maskerede baser). Det anbefales at vælge op til 10 sekvenser som referencesæt til primerdesign. Hvis de foreliggende sekvensdata er ufuldstændige eller ikke repræsentative for undersøgelsesområdet, henvises til råd43,44,45 i supplerende fil 1.
    1. Gå til siden NCBI RABV Sequences by Clade fra rullemenuen Sekvensdata i RABV-GLUE. Klik på linket Rabiesvirus (RABV) for at få adgang til alle tilgængelige data, eller vælg en bestemt klade af interesse. Brug filterindstillingen til at tilføje filtre , der passer til de ønskede kriterier (f.eks. oprindelsesland, sekvenslængde). Download sekvenser og metadata.
  2. Generer et primerskema til multiplexpolymerasekædereaktion (PCR) efter instruktionerne fra Primal Scheme46. Et 400 bp-skema med en overlapning på 50 bp anbefales til sekvensering af prøver af lav kvalitet. Download og gem alle output (rediger ikke fil- eller primernavne).
    BEMÆRK: Skemaet indekseres til den første sekvens i inputfastaen, herefter benævnt "indeksreferencen" (figur 2). Se Supplerende fil 1 for muligheder for at optimere primerens ydeevne.

3. Opsæt RAMPART- og ARTIC-bioinformatikrørledninger

  1. Se Supplementary File 2 for at oprette en mappestruktur til styring af input/output-filer til RAMPART og ARTIC-bioinformatikpipelinen.

4. Biosikkerhed og laboratorieopsætning

  1. Håndter potentielt rabies-positive prøver i biosikkerhedsniveau (BSL) 2 eller 3 betingelser.
  2. Sørg for, at laboratoriepersonalet har afsluttet rabiesvaccination før eksponering og gennemgår overvågning af immunitet i henhold til Verdenssundhedsorganisationens (WHO) anbefalinger3.
  3. Sørg for, at der findes særlige standardprocedurer og risikovurderinger for laboratoriet efter nationale eller internationale retningslinjer.
  4. Påkrævet laboratorieopsætning: Minimer kontaminering ved at opretholde fysisk adskillelse mellem områder før og efter PCR. I laboratorier med begrænset plads eller laboratorieindstillinger i marken skal du bruge bærbare handskerum eller provisoriske laboratoriestationer for at minimere kontaminering.
  5. I denne protokol skal du sørge for at udpege separate områder for:
    1. Prøveekstraktion: Opsæt et BSL2/3 kabinet/handskerum til håndtering af biologisk materiale og udfør inaktivering og RNA-ekstraktion.
    2. Skabelonområde: Opsæt et BSL1 kabinet/handskerum til tilføjelse af skabelon (RNA/cDNA) til den forberedte reaktionsmasterblanding.
    3. Masterblandingsområde: Opret et udpeget rent område (BSL1-skab/handskeboks) til fremstilling af reagensmasterblandinger. Der bør ikke være nogen skabelon på dette område.
    4. Post-PCR-område: Opret et separat område til arbejde med amplicons og sekventering af biblioteksforberedelse.
      BEMÆRK: Alle områder skal rengøres med et overfladedekontaminant og ultraviolet (UV)-steriliseret før og efter brug.

5. Indsamling og diagnosticering af feltprøver

BEMÆRK: Prøver skal indsamles af uddannet og immuniseret personale iført personlige værnemidler og efter de refererede standardprocedurer47,48,49.

  1. Prøven indsamles via foramen magnum (dvs. occipitalvejen) som beskrevet detaljeret i Mauti et al.50.
  2. Diagnostiser rabies i marken med hurtige diagnostiske tests og bekræft i laboratoriet ved hjælp af anbefalede procedurer47, såsom den direkte fluorescerende antistoftest (DFA), den direkte hurtige immunhistokemiske test (DRIT) 51,52 eller realtids revers transkription (RT) -PCR 53.
  3. Brug bekræftede positive hjerneprøver til RNA-ekstraktion eller opbevar i en fryser ved -20 °C i 2-3 måneder eller -80 °C i længere perioder. Opbevar RNA til opbevaring og transport ved hjælp af et passende DNA / RNA-stabiliseringsmedium.

6. Prøveforberedelse og RNA-ekstraktion (3 timer)

BEMÆRK: Brug et spinkolonnebaseret viralt RNA-ekstraktionssæt, der passer til prøvetypen.

  1. Forbered to keramiske perlerør ved at fylde et 2 ml PCR-rør med ca. 200 μL rør fyldt med 1,4 mm keramiske perler og mærk røret.
  2. Tilsæt det anbefalede volumen lysisbuffer, der leveres i RNA-ekstraktionssættet, til det mærkede PCR-rør.
  3. Få ca. en 3 mm terning fra hjerneprøven bekræftet med rabiesinfektion ved hjælp af en træapplikator og læg i et mærket rør med prøve-id og 100 μL nukleasefrit vand i røret mærket negativ kontrol.
    BEMÆRK: Brug homogenisering baseret på lukkede rørperler for at begrænse prøveeksponeringen. Hvis det ikke er muligt, skal du bruge andre egnede mekaniske forstyrrende stoffer (f.eks. rotorbaseret) eller en manuel mikrostøder. Disse kan dog være mindre effektive end perleslag på hård overflade for at forstyrre væv (vævsprøver kan hærde i visse lagringsmedier).
  4. Forstyrre hjernevævet manuelt ved hjælp af en træapplikatorpind og derefter hvirvel med maksimal hastighed, indtil fuldstændig vævshomogenisering er opnået.
  5. Lysatet centrifugeres i henhold til producentens anvisninger, og supernatanten overføres med en pipette til et nyt mærket mikrocentrifugeglas. Brug kun denne supernatant i de efterfølgende trin.
  6. Følg RNA-ekstraktionssættets spinkolonneinstruktioner for at opnå oprenset RNA.
  7. Inkluder en negativ ekstraktionskontrol (NEC) her, og tag hele vejen igennem til sekventeringsfasen.

7. cDNA-forberedelse (20 min)

  1. I masterblandingsområdet fremstilles en masterblanding til cDNA-syntese i første streng i henhold til antallet af prøver og kontroller, der skal behandles (med et overskydende volumen på 10% for at sikre tilstrækkeligt reagens; Tabel 1). Der bør medtages en kontrol uden skabelon (NTC) på dette stadium.
  2. Mærk 0,2 ml PCR-striprør og alikvote 5 μL af masterblandingen i rørene.
  3. Tag de forberedte rør til skabelonområdet. Tilsæt 5 μL RNA i hvert mærket rør, inklusive NEC. Tilsæt 5 μL nukleasefrit vand (NFW) til NTC.
  4. Inkuberes i en termisk cyklist efter betingelserne i tabel 1.
    BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: cDNA kan opbevares ved -20 °C i op til 1 måned, hvis det er nødvendigt, men at fortsætte til PCR foretrækkes.

8. Forberedelse af grundpuljelager (1 time)

BEMÆRK: Dette trin er kun nødvendigt, hvis der fremstilles nye lagre fra individuelle primere, hvorefter forberedte stamopløsninger kan bruges.

  1. Forbered en primerpulje på 100 μM lager i masterblandingsområdet.
  2. Resuspender de frysetørrede primere i 1x tris-EDTA (TE) buffer eller NFW i en koncentration på 100 μM hver. Vortex grundigt og spin ned.
    BEMÆRK: I de følgende trin adskilles individuelle primere i to primerpuljer - ulige nummereret (navngivet Pool A) og lige nummereret (navngivet Pool B) - for at undgå interaktioner mellem primere, der flankerer amplicon overlapninger. Disse puljer af primere genererer overlappende 400 bp amplicons, der spænder over målgenomet.
  3. Arranger alle de ulige nummererede primere i et rørstativ. Generer en primerpuljebestand ved at tilføje 5 μL fra hver primer til et 1,5 ml mikrocentrifugerør mærket "primerskemanavn - Pool A (100 μM)".
  4. Gentag processen for alle de lige nummererede primere og mærk som "grundskemanavn - pulje B (100 μM)".
  5. Fortynd hver primerpulje 1:10 i vand af molekylær kvalitet for at generere 10 μM primerstammer.
    BEMÆRK: Lav flere delprøver af 10 μM primerfortyndinger og frys dem i tilfælde af nedbrydning eller kontaminering.

9. Multiplex PCR (5 timer)

  1. Forbered to PCR-masterblandinger, en for hver primerpulje i masterblandingsområdet.
    1. Brug en slutkoncentration på 0,015 μM pr. Primer. Beregn det krævede primerpuljevolumen til PCR-reaktionen (tabel 2) ved hjælp af følgende formel:
      Primerbassinvolumen = antal primere x reaktionsvolumen x 0,015/koncentration (μM) grundmasse
  2. Alikvote 10 μL hver af pulje A mastermix og pulje B master mix til mærkede PCR strip rør i skabelonområdet. For hver prøve tilsættes 2,5 μL cDNA (fra trin 3) til hver af de tilsvarende mærkede primerpulje A- og B-reaktioner. Overskydende cDNA kan opbevares ved -20 °C.
  3. Bland ved forsigtigt at svirpe og pulscentrifugere.
  4. Prøverne inkuberes med betingelserne i tabel 2 på en PCR-maskine.
    BEMÆRK: Programmet inkluderer ikke et specifikt forlængelsestrin på grund af den lange udglødningstid på 5 min (påkrævet på grund af det store antal primere) og ampliconernes korte længde (400 bp), hvilket er tilstrækkeligt til forlængelsen.

10. PCR-oprydning og kvantificering (3,5 timer)

  1. Udfør alt arbejde fra dette tidspunkt i post-PCR-området.
  2. Aliquot fastfasereversibel immobilisering (SPRI) perler i mikrocentrifugerør fra hovedflasken. Opbevares ved 4 °C.
  3. En SPRI-alikvot opvarmes til stuetemperatur (RT; ~20 °C) og hvirvler grundigt, indtil perlerne er helt opslæmmet i opløsningen.
  4. I 1,5 ml rør kombineres primerpulje A og primerpulje B PCR-produkter til hver prøve. Tilsæt om nødvendigt vand for at bringe volumenet til 25 μL.
  5. Tilsæt 25 μL SPRI-perler til hver prøve (forholdet 1:1 perle:prøve). Bland ved at pipettere op og ned eller banke forsigtigt på røret.
  6. Inkuber ved RT i 10 minutter, lejlighedsvis invertering eller svirp rørene.
  7. Anbring på et magnetisk stativ, indtil perlerne og opløsningen er helt adskilt. Supernatanten fjernes og kasseres, idet det sikres, at perlepelletsen ikke forstyrres.
  8. Vask to gange med 80% ethanol (opvarmet til RT).
    1. Tilsæt 200 μL ethanol til pelleten. Vent i 30 s for at sikre, at perlerne vaskes ordentligt.
    2. Supernatanten fjernes forsigtigt og kasseres, idet du forsøger ikke at røre perlepelleten.
    3. Gentag trin 10.8.1-10.8.2 for at vaske pelleten en gang til.
  9. Fjern alle spor af ethanol ved hjælp af en 10 μL spids. Lufttørre, indtil sporethanol er fordampet (med små perler sker dette hurtigt, ~ 30 s); Når dette sker, skal pelleten gå fra skinnende til mat. Pas på ikke at tørre for meget (hvis pelleten revner, er den for tør), da dette vil påvirke DNA-gendannelsen.
  10. Resuspender perlerne i 15 μL NFW og inkuber ved RT (off magnetic rack) i 10 min.
  11. Gå tilbage til magnetstativet og overfør supernatanten (renset produkt) til et friskt 1,5 ml rør.
  12. Der fremstilles en 1:10 fortynding af hver prøve i et separat glas (2 μL produkt + 18 μL NFW).
    BEMÆRK: Vær meget forsigtig på dette tidspunkt for at undgå krydskontaminering. Hav kun ét amplikon rør åbent ad gangen. Alikvote 18 μL vand ind i rørene først (i et rent masterblandingsområde).
  13. DNA-koncentrationen af hver fortyndet prøve måles ved hjælp af et meget følsomt og specifikt fluorometer som beskrevet i protocols.io54,55.

11. Normalisering (30 min)

  1. Brug normaliseringsskabelonen (supplerende fil 3) og DNA-koncentrationen (ng/μL) for hver prøve til at beregne det volumen af fortyndet (eller pæn) prøve, der kræves til 200 fmol af hver prøve i et samlet volumen på 5 μL.
  2. Mærk nye PCR-rør, og tilføj beregnede mængder NFW og prøve for at opnå normaliseret DNA.
  3. Det beregnede volumen anvendes til ufortyndede (pæne) prøver, hvis der kræves over 5 μL af den fortyndede prøve for at opnå 200 fmol.
    BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: På dette tidspunkt kan det rensede PCR-produkt opbevares ved 4 °C i op til 1 uge eller placeres ved -20 °C til længerevarende opbevaring, hvis det er nødvendigt.

12. Slutforberedelse og stregkodning (1,5 timer)

BEMÆRK: De næste trin forudsætter brug af specifikke reagenser fra nanoporespecifikke stregkode- og ligeringssekventeringssæt (se materialetabel for detaljer). Protokollen kan overføres på tværs af forskellige kemiversioner, men brugerne skal sørge for at bruge kompatible sæt i henhold til producentens instruktioner.

  1. Afslut reparation og dA-tailing
    1. Slutforberedelsesreaktionen indstilles for hver prøve, der er nævnt i tabel 3. Forbered en masterblanding i henhold til antallet af prøver (plus 10% overskud). Vær forsigtig, når pipettering, da reagenser er tyktflydende.
    2. Der tilsættes 5 μL masterblanding i hvert rør med normaliseret DNA (5 μL). Den totale reaktionsblanding skal være 10 μL. Skift spidserne hver gang, og hav kun et rør åbent ad gangen.
    3. Der inkuberes i en termisk cyklist under de betingelser, der er nævnt i tabel 3.
  2. Stregkode
    1. Aliquot stregkoderne fra stregkodesættet til PCR-striprør ved 1,25 μL / rør og registrer stregkoden tildelt hver prøve.
    2. Tilsæt 0,75 μL af den slutforberedte prøve til den tildelte stregkodealikvote.
    3. Forbered en ligeringsmasterblanding i henhold til antallet af prøver (plus 10% overskud) (tabel 4).
    4. Tilsæt 8 μL ligeringsmasterblanding til den endeforberedte prøve + stregkoder, hvilket giver en samlet reaktion på 10 μL.
    5. Inkuberes i en termisk cyklist under anvendelse af betingelserne i tabel 4.
  3. SPRI-perleoprydning og DNA-kvantificering
    1. Optø kort fragmentbuffer (SFB) ved RT, bland ved hvirvelstrøm, pulscentrifuge og læg den på is.
    2. Alle stregkodeprøverne samles i et 1,5 ml lobindmikrocentrifugeglas. For ikke at gøre oprydningsvolumen for stor til at bruge, saml 12-24 prøver (10 μL / prøve), op til 48 prøver (5 μL / prøve) eller op til 96 prøver (2,5 μL / prøve) fra hver native stregkodereaktion.
    3. Tilføj en 0,4x volumen SPRI-perler til den stregkodede pool. Bland forsigtigt (svirp eller pipettering) og inkuber ved RT i 5 min.
    4. Prøverne anbringes på en magnet, indtil perlerne er pelleteret, og supernatanten er helt klar (~2 min). Supernatanten fjernes og kasseres. Pas på ikke at forstyrre perlerne.
    5. Vask to gange med 250 μL SFB.
      1. Fjern røret fra magneten, og resuspender pelleten fuldstændigt i 250 μL SFB. Inkuber i 30 s, pulscentrifuge og vend tilbage til magneten.
      2. Supernatanten fjernes og kasseres.
    6. Gentag trin 12.3.5 for at udføre endnu en SFB-vask.
    7. Pulscentrifuge og fjern eventuel resterende SFB.
    8. Tilsæt 200 μL 80% (RT) ethanol for at bade pelleten. Fjern og kassér ethanolen, pas på ikke at forstyrre perlepellet. Lufttør i 30 s, eller indtil pelleten har mistet sin glans.
    9. Resuspender i 22 μL NFW ved RT i 10 min.
    10. Anbring magneten, lad den sætte sig i ~2 minutter, fjern derefter forsigtigt opløsningen og overfør den til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    11. Der anvendes 1 μL til opnåelse af DNA-koncentrationen som beskrevet tidligere (trin 10.13).
      BEMÆRK: Valgfrit pausepunkt: På dette tidspunkt kan biblioteket opbevares ved 4 °C i op til 1 uge eller -20 °C til længerevarende opbevaring, men det foretrækkes at fortsætte med adapterligering og sekventering.

13. Sekvens af handlinger (højst 48 timer)

  1. Klargør computeren (se også Forudsætninger afsnit 1-4).
    1. Kontroller, at der er plads nok til at gemme nye data (min. 150 GB), data fra gamle kørsler sikkerhedskopieres/flyttes til en server, før de slettes, og den nyeste version af MinKNOW installeres.
  2. Fjern den lagrede flowcelle fra køleskabet, og lad den nå RT.
  3. Adapter ligering (1 time)
    1. Pulscentrifuger adapterblandingen og ligasen og læg den på is.
    2. Optøningselueringsbuffer (EB), SFB og ligeringsbuffer ved RT. Bland ved hvirvelstrøm, pulscentrifuge og læg den på is.
    3. Forbered adapterligeringsmasterblandingen (tabel 5), der kombinerer reagenser i den angivne rækkefølge i et rør med lav binding.
      BEMÆRK: Alternativer til adapter ligation master mix reagenser (tabel 5) kan bruges afhængigt af tilgængeligheden på laboratoriet. Se supplerende fil 3 og materialefortegnelse for en liste over alternativer. Brug beregning i regnearket Supplementary File 3 til at få volumen af DNA-bibliotek svarende til 200 fmol. Hvis der beregnes mindre end 20 μL, tilsættes NFW for at udgøre op til 20 μL.
    4. Bland ved forsigtigt svirp og pulscentrifuge. Inkuber ved RT i 20 min.
      BEMÆRK: Under inkubation skal du begynde at forberede flowcellen (afsnit 13.5).
  4. Ryd op med SPRI-perler (brug ikke ethanol som ved tidligere oprydninger).
    1. Tilføj en 0,4x volumen SPRI-perler (RT) til prøverne. Inkuber ved RT i 10 minutter, svip forsigtigt med mellemrum for at hjælpe blandingen.
    2. Placer magneten på, indtil perlerne og opløsningen er helt adskilt (~5 min). Supernatanten fjernes og kasseres. Pas på ikke at forstyrre perlepellet.
    3. Vask to gange med 125 μL SFB.
    4. Pellet resuspenderes fuldstændigt med 125 μL SFB ved at blande med en pipette. Lad det inkubere i 30 s.
    5. Pulscentrifuge for at opsamle væske ved rørbasen og placere på magneten. Supernatanten fjernes og kasseres.
    6. Gentag trin 13.4.4-13.4.5 for at vaske pillen en gang til.
    7. Pulscentrifuge og fjern overskydende SFB.
    8. Resuspender i 15 μL EB og inkuber i 10 minutter ved RT.
    9. Vend tilbage til magneten i ~2 minutter, og overfør derefter forsigtigt opløsningen til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    10. Kvantificer 1 μL af det eluerede bibliotek, som beskrevet tidligere i trin 10.13
      BEMÆRK: For de bedste resultater skal du fortsætte direkte til MinION-sekventering; Det endelige bibliotek kan dog opbevares i EB ved 4 °C i op til 1 uge, hvis det er nødvendigt.
  5. Kør en kvalitetskontrol af flowceller.
    1. Tilslut sekventeringsenheden til en bærbar computer, og åbn sekventeringssoftwaren.
    2. Vælg flowcelletype, og klik derefter på Kontroller flowcelle og Start test.
    3. Når du er færdig, vises det samlede antal aktive (dvs. levedygtige) porer. En ny flowcelle skal have >800 aktive porer; Hvis det ikke gør det, skal du kontakte producenten for at få en ny.
  6. Klargøring og ilægning af flowcellen (20 min)
    1. Optø følgende reagenser ved RT, og placer derefter sekventeringsbuffer, en skylletøjring, skyllebuffer og ilægning af perler på is.
    2. Vortex sekventeringsbufferen og skyllebufferen, pulscentrifuge og læg den på is.
    3. Pulscentrifuger skyllebåndet og blandes ved pipettering; Placer derefter på is.
    4. Klargør flowcelleprimingblandingen ved at tilsætte 30 μL skyllebånd direkte til røret med skyllebuffer fra et flowcelleprimingsæt og bland ved pipettering.
    5. Bland ilægningsperlerne ved pipettering umiddelbart før brug, da de sætter sig hurtigt.
    6. I et frisk rør forberedes den endelige biblioteksfortynding til sekventering som nævnt i tabel 5.
      BEMÆRK: Brug beregning i regnearket Supplementary File 3 til at få volumen DNA-bibliotek svarende til 50 fmol. Hvis der beregnes mindre end 12 μL, tilsættes EB for at fylde op til 12 μL.
    7. Vip sekventeringsenhedens låg tilbage, og skub dækslet til primingporten med uret, så primingporten er synlig (figur 3)
    8. Fjern luftboblerne forsigtigt ved at indstille en P1000-pipette til 200 μL, sæt spidsen ind i primingporten, og drej hjulet, indtil der ses en lille volumen, der kommer ind i pipettespidsen (maks. drejning til 230 μL).
    9. Læg 800 μL flowcelle priming mix i flowcellen via primingporten, og sørg for at undgå bobler.
    10. Lad stå i 5 min.
    11. Løft forsigtigt prøveportdækslet, og læg 200 μL primingblanding i flowcellen via primingporten ved hjælp af en P1000-pipette.
    12. Afpipetter biblioteksblandingen op og ned inden ilægning, og sørg for, at ilægningsperler i masterblandingen ophænges igen, før de ilægges.
    13. Indlæs 75 μL biblioteksblanding i flowcellen via prøveporten på en dråbevis måde. Sørg for, at hvert dryp strømmer ind i porten, før du tilføjer det næste.
    14. Sæt forsigtigt prøveportdækslet på igen, og sørg for, at spunsen kommer ind i prøveporten.
    15. Luk primingporten, og udskift sekventeringsenhedens låg.
  7. Sekvenseringskørsel (maks. 48 timer)
    1. Tilslut sekventeringsenheden til den bærbare computer, og åbn sekventeringssoftwaren.
    2. Klik på start , og klik derefter på Start sekvensering.
    3. Klik på Nyt eksperiment , og følg arbejdsprocessen for sekventeringssoftwarens grafiske brugergrænseflade (GUI) for at konfigurere parametrene for kørslen.
    4. Indtast eksperimentnavnet og prøve-id'et (f.eks. rabv_run1), og vælg flowcelletypen i rullemenuen.
    5. Fortsæt med at vælge kit, og vælg det relevante ligeringssekventeringssæt og de anvendte indbyggede stregkodesæt.
    6. Fortsæt til Kør indstillinger. Behold standardindstillingerne, medmindre det ønskes, at kørslen stopper automatisk efter et bestemt antal timer (kørsler kan til enhver tid stoppes manuelt).
    7. Fortsæt til Basecalling. Vælg at slå Basecalling til eller fra i henhold til computerressourcerne (se Computeropsætning). Vælg Rediger indstillinger under stregkode, og sørg for, at Stregkode begge ender er slået til. Gem og fortsæt til outputafsnittet.
    8. Accepter standardindstillingerne, og fortsæt til endelig gennemgang, kontroller indstillingerne, og registrer detaljerne i regnearket (supplerende fil 3). Klik på Start.
      BEMÆRK: Hvis flowcellen genbruges, skal du justere startspændingen (i det avancerede afsnit af kørselsindstillingerne) som angivet i skemaet i supplerende fil 3.
    9. Optag de første aktive kanaler - hvis dette er betydeligt lavere end kvalitetskontrol (QC) -kontrollen, skal du genstarte sekventeringssoftwaren. Hvis det stadig er lavere, skal du genstarte computeren.
    10. Registrer de indledende kanaler i streng versus enkelt pore for at give en omtrentlig porebelægning. Dette tal vil svinge, så giv en tilnærmelse.
    11. Overvåg kørslen, efterhånden som den skrider frem.

14. Live og offline basecalling

BEMÆRK: Disse instruktioner antager, at den allerede eksisterende mappestruktur, der findes i artic-rabv-lageret, og at forudsætningerne afsnit 1 og 3 i protokollen er blevet fulgt.

  1. På dit lokale filsystem skal du oprette en ny mappe kaldet analyse, hvor du vil gemme alle dine analyseoutput. For at organisere yderligere: Opret en undermappe med navnet på dit projekt og inde i den en ny mappe til kørslen ved hjælp af eksempel-id'et, der leveres til MinKNOW som run_name. Gør dette i en kommando som følger:
    mkdir -p
    Analyse/project_name/run_name
    Naviger derefter til dens placering:
    cd
    sti/analyse/project_name/run_name
  2. Live basecalling
    BEMÆRK: For at udføre nanopore basecalling i realtid kræver bærbare computere en NVIDIA CUDA-kompatibel grafikbehandlingsenhed (GPU). Sørg for, at instruktionerne til opsætningen af GPU-baseopkald er udført ved hjælp af guppy-protokollen56.
    1. Under opsætningen af kørslen skal du slå live basecalling til.
    2. Brug RAMPART til at overvåge sekventeringsdækningen i realtid i henhold til nedenstående instruktion.
    3. I computerens terminal skal du aktivere artic-rabv conda-miljøet:
      Conda Activate Artic-Rabv
    4. Opret en ny mappe til rampart-outputtet inde i run_name-mappen, og naviger ind i den:
      cd /sti/analyse/project_name/run_name
      MKDIR rampart_output
      CD rampart_output
    5. Opret en stregkode.csv fil for at parre stregkoder og eksempelnavne. Det skal have en linje pr. stregkode og kun angive stregkoder, der findes i biblioteket, med overskrifterne "stregkode" og "prøve". Følg eksemplet i artic-rabv mappen:
      analyse/example_project/example_run/rampart_output/stregkoder.csv
    6. Start RAMPART ved at angive den relevante protokolmappe og sti til fastq_pass-mappen i MinKNOW-outputtet til kørslen:
      rampart --protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol - basecalledPath
    7. Åbn et browservindue, og naviger til localhost:3000 i URL-feltet. Vent på, at der er basis for tilstrækkelige data, før resultaterne vises på skærmen.
  3. Offline basecalling (udføres efter kørsel)
    1. Hvis live basecalling ikke blev indstillet, vil outputtet fra MinKNOW være rå signaldata (fast5-filer). Man vil ikke kunne bruge RAMPART under kørslen. Konverter fast5-filerne til basecalled data (fastq-filer) efter kørsel ved hjælp af guppy (se opsætning i trin 1.1.1 under forudsætninger). Kør RAMPART post-hoc på basenkaldet data.
    2. Kør guppy basecaller:
      guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /sti/til/læser/fast5_* -s /sti/analyse/project_name/run_name -x auto -r
      -c er konfigurationsfilen til at specificere basecalling-modellen, -i er inputstien, -s er gemstien, -x angiver basecalling af GPU-enheden (ekskluder, hvis du bruger computerversionen af guppy), og -r specificerer at søge inputfiler rekursivt.
      BEMÆRK: Konfigurationsfilen (.cfg) kan ændres til en basecaller med høj nøjagtighed ved at erstatte _fast med _hac, selvom dette vil tage betydeligt længere tid.

15. Vask af flowcellerne

  1. Flowcellerne kan vaskes og genbruges til at sekvensere nye biblioteker, hvis porerne stadig er levedygtige. Se instruktioner for vask på ONT flowcellevaskeprotokol57.

16. Analyse og fortolkning

  1. Generering af konsensussekvens med ARTIC-bioinformatikpipeline
    1. Følg instruktionerne beskrevet i artic-rabv GitHub-lager40 i mappen rabv_protocols for at generere konsensussekvenser fra rå fast5- eller basecalled fastq-filer.
      BEMÆRK: Se Artic pipeline - Core pipeline58 for yderligere vejledning.
  2. Valgfrit: Analysér den gennemsnitlige læsedybde pr. amplicon.
    1. Tilpas de scripts, der er tilgængelige fra artic-rabv-lageret, med henvisning til supplerende fil 1. Kort fortalt genereres dybdegående statistikker ved hjælp af SAMtools59 og dækning pr. nukleotid plottet i R.
  3. Fylogenetisk analyse ved hjælp af GLUE
    1. Fra RABV_GLUE42 skal du vælge fanen Analyse > Genotyping og fortolkning > Tilføj filer og vælge fasta-filen med konsensussekvenser.
    2. Klik på Send, og vent. Når analyserne er færdige, kan du klikke på knappen Vis analyse , der viser klade- og subkladetildelinger, dækning pr. gen, variation fra referencesekvenser og nærmeste slægtning.
    3. Relevante kontekstuelle sekvenser kan også identificeres i afsnittet Sekvensdata > NCBI-sekvenser efter klade .
    4. Vælg den identificerede klade, eller klik på Rabiesvirus (RABV) for at se alle tilgængelige sekvenser.
    5. Filtrer efter relevante sekvenser (f.eks. oprindelsesland).
    6. Download disse sekvenser og tilhørende metadata til analyse og sammenligning.
  4. Afstamningsopgave ved hjælp af MADDOG41
    1. Træk MADDOG-lageret fra GitHub for at sikre, at du arbejder med den mest opdaterede version.
    2. Opret en opgavemappe i det lokale MADDOG-lager (tidligere oprettet i afsnittet Forudsætninger) kaldet kørselsnavnet.
    3. Inde i mappen skal du tilføje fasta-filen, der indeholder konsensussekvenserne.
    4. Føj en metadatafil til mappen.
      BEMÆRK: Denne fil skal være en csv med 4 kolonner kaldet 'ID', 'land', 'år' og 'tildeling', der beskriver sekvens-id'erne, prøveudtagningslandet og året for prøveindsamling, mens kolonnen 'tildeling' skal være tom.
    5. I kommandolinjegrænsefladen skal du aktivere conda-miljøet: conda activate MADDOG.
    6. I kommandolinjegrænsefladen skal du navigere til MADDOG-lagermappen.
    7. Indledningsvis skal du foretage afstamningstildeling på sekvenser for at kontrollere for eventuelle abnormiteter og for at identificere, om det ville være hensigtsmæssigt at køre det længere afstamningsbetegnelsestrin. For dette skal du skrive dette i kommandolinjen: sh assignment.sh.
    8. Når du bliver bedt om det, skal du indtaste Y for at angive, at du har trukket lageret og arbejder med den mest opdaterede version af MADDOG.
    9. Når du bliver bedt om det, skal du indtaste navnet på mappen i MADDOG-lagermappen, der indeholder fasta-filen.
    10. Når afstamningstildelingen er fuldført, skal du kontrollere outputfilen i din mappe. Hvis outputtet er som forventet, og der er tildelt flere sekvenser til den samme afstamning, skal du køre afstamningsbetegnelsen.
    11. Hvis du kører afstamningsbetegnelse, skal du slette den tildelingsoutputfil, der lige er oprettet.
    12. I terminalen, inde i MADDOG-lagermappen, skal du køre kommandoen sh designation.sh.
    13. Når du bliver bedt om det, skal du indtaste Y for at angive, at du har trukket lageret og arbejder med den mest opdaterede version af MADDOG.
    14. Når du bliver bedt om det, skal du indtaste mappenavnet i MADDOG-lagermappen, der indeholder fasta-filen og metadataene. Dette udsender afstamningsoplysninger om hver sekvens, en fylogeni af de nye og relevante tidligere sekvenser (fra 16.3.6), hierarkisk information om slægterne og detaljer om potentielt nye slægter og områder med undersampling.
      BEMÆRK: Alle detaljer om protokollen, brug og output kan findes i Campbell et al.60.
    15. Når den indledende analyse er afsluttet, skal du indtaste Y, hvis du bliver bedt om også at teste for nye og undersamplede slægter, hvis dette er nødvendigt. Ellers skal du indtaste N.
    16. Hvis du bliver bedt om at bekræfte nyligt fundne slægter, skal du indtaste Y og følge instruktionerne i den resulterende NEXT_STEPS.eml-fil. Ellers skal du indtaste N.

Representative Results

Prøve-til-sekvens-til-fortolkning-arbejdsgangen for RABV, der er beskrevet i denne protokol, er blevet anvendt med succes under forskellige laboratorieforhold i endemiske lande, såsom Tanzania, Kenya, Nigeria og Filippinerne (figur 4). Protokollen blev anvendt på forskellige prøvetyper og betingelser (tabel 6): frisk og frosset hjernevæv, cDNA- og RNA-ekstrakter fra hjernevæv transporteret under kølekæde i længere perioder og FTA-kort med hjernevævsudstrygninger.

Live basecalling ved hjælp af RAMPART (figur 5) viser genereringen af læsninger i næsten realtid og den procentvise dækning pr. prøve. Dette er især nyttigt, når du skal beslutte, hvornår kørslen skal stoppes, og flowcellen skal gemmes til genbrug. Der blev observeret variation i køretiden, hvor nogle blev færdige på 2 timer, mens andre kunne tage mere end 12 timer, før en tilstrækkelig dækningsdybde (x100) blev nået. Vi kan også se regioner med dårlig forstærkning; For eksempel viser figur 6 et øjebliksbillede af en sekventeringskørsel, hvor dækningsprofiler viser nogle amplicons med meget lav forstærkning, hvilket indikerer potentielt problematiske primere. Ved at undersøge disse dårligt forstærkende regioner mere grundigt har vi været i stand til at identificere primerfejl, hvilket vil gøre det muligt for os at redesigne og forbedre individuelle primere. Nogle primerordninger har vist flere uoverensstemmelser end andre. Dette observeres i den østafrikanske grundordning sammenlignet med Filippinerne i overensstemmelse med den målrettede mangfoldighed, da Østafrika-ordningen sigter mod at fange en meget bredere mangfoldighed.

RABV-GLUE42, en generel ressource til styring af RABV-genomdata, og MADDOG60, et afstamningsklassifikations- og nomenklatursystem, blev brugt til at kompilere og fortolke resulterende RABV-sekvenser. Tabel 7 viser de større og mindre klader, der cirkulerer i hvert land, der er tildelt ved hjælp af RABV-GLUE. Der vises også en højere opløsningsklassifikation af lokale slægter efter MADDOG-opgaven.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsproces for stikprøve-til-sekvens-til-fortolkning for RABV. Opsummerede trin vises for (A) prøveforberedelse, (B) PCR- og biblioteksforberedelse og (C) sekventering og bioinformatik op til analyse og fortolkning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk grundskema. Udglødningspositioner langs 'indeksreferencegenomet' (mørk lilla) for par fremadgående og omvendte primere (halvpile), som er tildelt i to separate puljer: A (rød) og B (grøn). Primerpar genererer 400 bp overlappende ampliconer (blå), som nummereres sekventielt langs indeksreferencegenomet i formatet 'scheme_name_X_DIRECTION', hvor 'X' er et tal, der henviser til amplion genereret af primeren, og 'DIRECTION' er enten 'LEFT' eller 'RIGHT', der beskriver henholdsvis fremad eller baglæns. Ulige eller lige værdier af 'X' bestemmer puljen (henholdsvis A eller B). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Nanopore flowcelle48. Blå etiketter illustrerer de forskellige dele af flowcellen, herunder primingportdækslet, der dækker primingporten, hvor primingopløsningen tilsættes, SpotON-prøveportdækslet, der dækker prøveporten, hvor prøven tilsættes dråbevis, affaldsportene 1 og 2 og flowcelle-id'et. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Kort, der viser det sted, hvor RABV-sekventering blev udført ved hjælp af den optimerede arbejdsgang i 2021 og 2022. Boblestørrelse og farve svarer til antallet af sekvenser pr. placering, hvor mindre og mørkere er færre, mens større og lysere er mere. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Skærmbillede af RAMPART-visualisering i webbrowser. Stregkodenavne erstattes af eksempelnavne i henhold til den bioinformatiske opsætning. De tre øverste paneler viser oversigtsplots for hele kørslen: dybde af dækning af kortlagte læsninger for hver stregkode pr. nukleotidposition på indeksreferencegenomet (øverst til venstre, farvet af stregkode), summerede kortlagte læsninger fra alle stregkoder over tid (øverste midte) og kortlagte læsninger pr. stregkode (øverst til højre, farvet af stregkode). Nederste paneler viser rækker af plots pr. stregkode. Fra venstre mod højre: dybden af dækningen af kortlagte aflæsninger pr. nukleotidposition på indeksreferencegenomet (venstre), længdefordelingen af kortlagte aflæsninger (midten) og andelen af nukleotidpositioner på indeksreferencegenomet, som har opnået en 10x, 100x og 1.000x dækning af kortlagte læsninger over tid (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Et eksempel læser dækning på tværs af genomet for en rabiesvirusprøve fra Filippinerne sekventeret ved hjælp af protokollen. Læsedækning ved hver nukleotidposition i genomet vises sammen med positionen af de overlappende amplicons (1-41), der bruges til at generere biblioteket. Spikes i dybden af dækningen svarer til områder med amplicon overlapning. Amplicons med lav dækningsdybde svarer til områder med amplicon overlapning. Amplicons med lav dækningsdybde er fremhævet med rødt, hvilket indikerer problematiske områder, der muligvis kræver optimering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Master mix og termiske cykliske betingelser for cDNA-forberedelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Mastermix og termiske cyklerbetingelser for multiplex PCR. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Masterblanding og termiske cyklistbetingelser for slut-prep-reaktion. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Mastermix og termiske cyklerbetingelser for stregkoder. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5: Adapter ligation master mix og endelig biblioteksfortynding til sekventering. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6: Antallet af genererede helgenomsekvenser af rabiesvirus og typen af prøver, der anvendes i forskellige lande ved hjælp af arbejdsgangen fra prøve til sekvens til fortolkning. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 7: Større og mindre kladeopgaver fra RABV-GLUE og afstamningsopgaver fra MADDOG for sekvenser genereret ved hjælp af workflowet. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: Primerskemadesign og optimering og amplicon læsedybdeanalyse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Beregningsmæssig opsætning Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: RABV WGS-protokolark Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

En tilgængelig RABV, nanopore-baseret, helgenomsekventeringsarbejdsgang blev udviklet af Brunker et al.61 ved hjælp af ressourcer fra ARTIC-netværket46. Her præsenterer vi en opdateret arbejdsgang med komplette prøve-til-sekvens-til-fortolkningstrin. Arbejdsprocessen beskriver forberedelsen af hjernevævsprøver til helgenomsekventering, præsenterer en bioinformatikrørledning til at behandle læsninger og generere konsensussekvenser og fremhæver to rabiesspecifikke værktøjer til at automatisere afstamningstildeling og bestemme fylogenetisk kontekst. Den opdaterede arbejdsproces indeholder også omfattende instruktioner til opsætning af passende beregnings- og laboratoriearbejdsområder med overvejelser om implementering i forskellige sammenhænge (herunder indstillinger med få ressourcer). Vi har demonstreret den vellykkede implementering af arbejdsgangen i både akademiske og forskningsinstitutindstillinger i fire RABV-endemiske LMIC'er med ingen eller begrænset genomisk overvågningskapacitet. Arbejdsprocessen har vist sig modstandsdygtig over for applikationer på tværs af forskellige indstillinger og forståelig for brugere med varierende ekspertise.

Denne arbejdsgang til RABV-sekventering er den mest omfattende offentligt tilgængelige protokol (der dækker prøve-til-sekvens-til-fortolkningstrin) og specifikt tilpasset til at reducere både opstarts- og driftsomkostninger. Den tid og de omkostninger, der kræves til biblioteksforberedelse og sekventering med nanoporeteknologi, reduceres kraftigt i forhold til andre platforme, såsom Illumina61, og løbende teknologiudvikling forbedrer sekvenskvalitet og nøjagtighed for at være sammenlignelig med Illumina62.

Denne protokol er designet til at være modstandsdygtig i forskellige lavressourcekontekster. Ved at henvise til fejlfindings- og ændringsvejledningen, der leveres sammen med kerneprotokollen, understøttes brugerne til at tilpasse arbejdsgangen til deres behov. Tilføjelsen af brugervenlige bioinformatiske værktøjer til arbejdsgangen udgør en stor udvikling af den oprindelige protokol, der giver hurtige og standardiserede metoder, der kan anvendes af brugere med minimal forudgående bioinformatikerfaring til at fortolke sekvensdata i lokale sammenhænge. Kapaciteten til at gøre dette på stedet er ofte begrænset af behovet for at have specifikke programmeringsmæssige og fylogenetiske færdigheder, hvilket kræver en intensiv og langsigtet investering i færdighedsuddannelse. Mens denne færdighed er vigtig for grundigt at fortolke sekvensdata, er grundlæggende og tilgængelige fortolkningsværktøjer lige så ønskelige for at kapacitere lokale "sekventeringsmestre", hvis kerneekspertise kan være vådlaboratoriebaseret, så de kan fortolke og tage ejerskab over deres data.

Da protokollen har været gennemført i en årrække i flere lande, kan vi nu give vejledning i, hvordan man optimerer multiplexprimerordninger for at forbedre dækningen og håndtere akkumuleret mangfoldighed. Der er også gjort en indsats for at hjælpe brugerne med at forbedre omkostningseffektiviteten eller gøre det lettere at foretage indkøb i en given region, hvilket typisk er en udfordring for bæredygtigheden af molekylære tilgange63. For eksempel valgte vi i Afrika (Tanzania, Kenya og Nigeria) stump / TA ligase master mix på adapterligeringstrinnet, som var lettere tilgængeligt fra lokale leverandører og et billigere alternativ til andre ligeringsreagenser.

Erfaringen viser, at der er flere måder at reducere omkostningerne pr. prøve og pr. kørsel på. Reduktion af antallet af prøver pr. kørsel (f.eks. fra 24 ned til 12 prøver) kan forlænge flowcellernes levetid over flere kørsler, mens forøgelse af antallet af prøver pr. kørsel maksimerer tiden og reagenserne. I vores hænder var vi i stand til at vaske og genbruge flowceller til en ud af tre sekventeringskørsler, hvilket gjorde det muligt at sekventere yderligere 55 prøver. Vask af flowcellen umiddelbart efter brug, eller, hvis det ikke er muligt, fjernelse af affaldsvæsken fra affaldskanalen efter hver kørsel, syntes at bevare antallet af porer, der var tilgængelige til en anden kørsel. Under hensyntagen til det oprindelige antal porer, der er tilgængelige i en flowcelle, kan en kørsel også optimeres til at planlægge, hvor mange prøver der skal køres i en bestemt flowcelle.

Selvom arbejdsgangen sigter mod at være så omfattende som muligt, med tilføjelse af detaljeret vejledning og skiltede ressourcer, er proceduren stadig kompleks og kan være skræmmende for en ny bruger. Brugeren opfordres til at søge personlig træning og support, ideelt lokalt eller alternativt gennem eksterne samarbejdspartnere. I Filippinerne har et projekt om kapacitetsopbygning i regionale laboratorier til SARS-CoV-2 genomisk overvågning ved hjælp af ONT udviklet kernekompetencer blandt sundhedsdiagnostikere, der let kan overføres til RABV-sekventering. Vigtige trin, såsom SPRI-perleoprydning, kan være vanskelige at mestre uden praktisk træning, og ineffektiv oprydning kan beskadige flowcellen og kompromittere løbet. Prøvekontaminering er altid et stort problem, når amplicons behandles i laboratoriet og kan være vanskelige at fjerne. Navnlig er krydskontaminering mellem prøver ekstremt vanskelig at påvise under bioinformatik efter kørsel. God laboratorieteknik og -praksis, såsom vedligeholdelse af rene arbejdsflader, adskillelse af områder før og efter PCR og inkorporering af negative kontroller, er afgørende for at sikre kvalitetskontrol. Den hurtige udvikling af nanoporesekventering er både en fordel og ulempe for rutinemæssig genomisk overvågning af RABV. Fortsatte forbedringer af nanopores nøjagtighed, tilgængelighed og protokolrepertoire udvider og forbedrer anvendelsesområdet. Den samme udvikling gør det imidlertid udfordrende at opretholde standarddriftsprocedurer og bioinformatiske rørledninger. I denne protokol leverer vi et dokument, der hjælper overgangen fra ældre til nuværende nanoporebiblioteksforberedelsessæt (Table of Materials).

En almindelig vejspærring for sekventering i LMIC'er er tilgængelighed, herunder ikke kun omkostningerne, men også evnen til at anskaffe forbrugsstoffer rettidigt (især sekventeringsreagenser, som er relativt nye for indkøbsteams og leverandører) og beregningsressourcer samt simpelthen at have adgang til stabil strøm og internettet. Brug af bærbar nanoporesekventeringsteknologi som grundlag for denne arbejdsgang hjælper med mange af disse tilgængelighedsproblemer, og vi har demonstreret brugen af vores protokol på tværs af en række indstillinger og udført den fulde protokol og analyse i landet. Det er ganske vist fortsat en udfordring at indkøbe udstyr og sekventere forbrugsvarer rettidigt, og i mange tilfælde var vi tvunget til at transportere eller sende reagenser fra Det Forenede Kongerige. På nogle områder var vi imidlertid i stand til helt at stole på lokale forsyningsruter for reagenser og drage fordel af investeringer i SARS-CoV-2-sekventering (f.eks. Filippinerne), der har strømlinet indkøbsprocesser og begyndt at normalisere anvendelsen af patogengenomik.

Behovet for en stabil internetforbindelse minimeres ved engangsinstallationer; for eksempel kræver GitHub-lagre, softwaredownload og nanopore-sekventering i sig selv kun internetadgang for at starte kørslen (ikke hele vejen igennem) eller kan udføres helt offline efter aftale fra virksomheden. Hvis mobildata er tilgængelige, kan en telefon bruges som et hotspot til den bærbare computer til at starte sekventeringskørslen, før forbindelsen afbrydes for kørselsvarigheden. Ved rutinemæssig behandling af prøver kan kravene til datalagring vokse hurtigt, og ideelt set vil data blive gemt på en server. Ellers er solid state-drev (SSD) harddiske relativt billige at kilde.

Selvom vi erkender, at der stadig er barrierer for genomisk overvågning i LMIC'er, tyder stigende investeringer i opbygning af genomisk tilgængelighed og ekspertise (f.eks. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa BGB])64 på, at denne situation vil blive bedre. Genomisk overvågning er afgørende for pandemisk beredskab6, og kapacitet kan etableres ved at rutinisere genomovervågningen af endemiske patogener såsom RABV. Globale forskelle i sekventeringskapacitet, der blev fremhævet under SARS-CoV-2-pandemien, bør være en drivkraft for katalytisk forandring for at tackle disse strukturelle uligheder.

Denne prøve-til-sekvens-til-fortolkning-arbejdsgang for RABV, herunder tilgængelige bioinformatikværktøjer, har potentiale til at blive brugt til at vejlede kontrolforanstaltninger rettet mod målet om nul dødsfald blandt mennesker som følge af hundemedieret rabies inden 2030 og i sidste ende til eliminering af RABV-varianter. Kombineret med relevante metadata letter genomiske data genereret fra denne protokol hurtig karakterisering af RABV under udbrudsundersøgelser og identifikation af cirkulerende slægter i et land eller en region60,61,65. Vi illustrerer vores pipeline for det meste ved hjælp af eksempler fra hundemedieret rabies; Arbejdsprocessen er dog direkte anvendelig på rabies hos vilde dyr. Denne overførbarhed og lave omkostninger minimerer udfordringerne ved at gøre rutinemæssig sekventering let tilgængelig, ikke kun for rabies, men også for andre patogener46,66,67, for at forbedre sygdomsstyring og kontrol.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton-finansiering fra Medical Research Council [MR/R025649/1] og Philippines Department of Science and Technology (DOST), UK Research and Innovation Global indsats mod COVID-19 [MR/V035444/1], University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], og International Partnership Development Fund, et DOST British Council-Filippinerne studentship (CB), et National Institute for Health Research [17/63/82] GemVi-stipendium (GJ) og University of Glasgow-stipendier fra MVLS DTP (KC) [125638-06], EPSRC DTP (RD) [EP / T517896 / 1] og Wellcome IIB DTP (HF) [218518 / Z / 19 / Z]. Vi er taknemmelige for kolleger og samarbejdspartnere, der har støttet dette arbejde: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana og Anna Czupryna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brand name
Software
Sequencing software
(MinKnow)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/downloads
Bioinformatics tool kit
(Guppy)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018
Equipment
Thermal cycler
(miniPCR™ mini16 thermal cycler)		 Cambio MP-QP-1016-01
Homogenizer
(Precellys Evolution Touch Homogenizer)		 Bertin Instruments EQ02520-300
Cold Racks (0.2-0.5mL)
(PCR Mini-cooler with transparent lid)		 BRAND  781260
Pipettor
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) Gilson  SKU: FA10030
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) Gilson  SKU: FA10024
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) Gilson  SKU: FA10020
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) Gilson  SKU: FA10025
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) Gilson  SKU: FA10021
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) Gilson  SKU: FA10026
Fluorometer
(Qubit  4 Fluorometer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q33238
Laptop 
(Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU])
Microcentrifuge
(Refrigerated centrifuge)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 75004081
Vortex mixer
(Basic vortex mixer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 88882011
Magnetic rack
(DynaMag -2 Magnet)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 12321D
Sequencing device
(MinION)		 Oxford Nanopore Technologies MinION Mk1B
RNA Extraction 
RNA extraction kit
(Qiagen RNEasy Mini Kit 250)		 Qiagen 74106
RNA stabilizing reagents 
(RNA later)  Invitrogen AM7020
(DNA/RNA Shield) Zymo Research R1100-50
PCR
Nuclease-free Water
(Nuclease-free Water [not  DEPC-treated])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific AM9937
Master mix for first strand cDNA synthesis
(LunaScript RT SuperMix Kit)		 New England Biolabs E3010S
DNA amplification master mix
(Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])		 New England Biolabs M0494L
Primer (Scheme)
(Custom DNA oligos)		 Invitrogen
SPRI Bead Clean-up
SPRI beads
(Aline Biosciences PCR Clean DX )		 Cambio AL-AC1003-50
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] Merck 818760
Short Fragment buffer
(SFB expansion pack)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-SFB001
DNA Quantification
DNA quantification kit
(Qubit® dsDNA HS Assay Kit)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32854
DNA quantification assay tubes
(Qubit™ Assay Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32856
End Prep and barcoding
(Qubit™ Assay Tubes)
End Prep master mix
(NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)		 New England Biolabs E7546L
Barcoding kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9 
(Native Barcoding Expansion 1-12) EXP-NBD104 
(Native Barcoding Expansion 13-24)  EXP-NBD114 
(Native Barcoding Expansion 96) EXP-NBD196
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
(not compatible)  (not compatible) 
(Native Barcoding Kit 24 V14) SQK-NBD114.24
(Native Barcoding Kit 96 V14) SQK-NBD114.96
Ligation mastermix
(Blunt/TA Ligase Master Mix)		 New England Biolabs M0367S
Adapter Ligation
Adapter ligation master mix
(NEBNext  Quick Ligation Module) New England Biolabs E6056S  
(NEBNext Ultra II Ligation Module)  New England Biolabs E7595S
(Blunt/TA Ligase Master Mix) New England Biolabs M0367S
Adapter mix
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-AMII001
(Adapter Mix II [AMII])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-NBA114
(Native adapter [NA])
Sequencing 
Flowcell priming kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-FLP002
(Flush Buffer [FB])
(Flush Tether [FT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-FLP004
(Flow Cell Flush [FCF])
(Flow Cell Tether [FCT])
Ligation Sequencing Kit 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
SQK-LSK109
Adapter Mix
(Adapter Mix [AMX])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SQB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LB])
Sequencing Tether
(Sequencing Tether [SQT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
SQK-LSK114
Adapter Mix
(Ligation Adapter [LA])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LIB])
Sequencing Tether
(Flow Cell Tether [FCT])
Library solution
(Library solution [LIS])
Flush buffer
(Flow Cell Flush [FCF])
Flow Cell 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
FLO-MIN106D
(Flow Cell  [R9.4.1])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
FLO-MIN114
(Flow Cell  [R10.4.1])
Flow Cell wash 
Flowcell wash kit
(Flow cell wash kit)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-WSH004
Consummables 
Surface decontaminant 
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7010PK
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7002PK
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap
(PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner])		 Greiner 608281
PCR Tube 0.2ml
(PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner])		 Greiner 671201
1000µL Filter Tips (500)
(Stacked 1000µL Filter Tips [500])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11977724
100µL Filter Tips (1000) Thermofisher scientific/Fisher scientific 11947724
10µL Filter Tips (1000)
(Stacked 100µL Filter Tips [1000])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11907724
Reinforced tubes  tubes (2ml)  with screw caps and o-rings
(Fisherbrand™ Bulk tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 15545809
Microcentrifuge tube (1.5ml)
(1.5 ml Eppendorf Tubes [500])		 Eppendorf 1229888
DNA LoBind Tubes  (1.5ml)
(DNA LoBind Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 10051232
Cryobabies labels
Gloves (S/M/L)
Paper towel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupprecht, C. E. Rhabdoviruses: rabies virus. Medical Microbiology. , University of Texas Medical Branch. Galveston, TX. (1996).
  2. Rabies. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/rabies (2023).
  3. Health Organization, W. orld WHO Expert Consultation on Rabies: WHO TRS N°1012. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/WHO-TRS-1012 (2018).
  4. Benavides, J. A., et al. Defining new pathways to manage the ongoing emergence of bat rabies in Latin America. Viruses. 12 (9), 1002 (2020).
  5. Hampson, K. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), e0003709 (2015).
  6. Global genomic surveillance strategy for pathogens with pandemic and epidemic potential, 2022-2032. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/978924004679 (2022).
  7. Tsai, K. J., et al. Emergence of a sylvatic enzootic formosan ferret badger-associated rabies in Taiwan and the geographical separation of two phylogenetic groups of rabies viruses. Veterinary Microbiology. 182, 28-34 (2016).
  8. Chiou, H. -Y., et al. Molecular characterization of cryptically circulating rabies virus from ferret badgers, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 790-798 (2014).
  9. Sabeta, C. T., Mansfield, K. L., McElhinney, L. M., Fooks, A. R., Nel, L. H. Molecular epidemiology of rabies in bat-eared foxes (Otocyon megalotis) in South Africa. Virus Research. 129 (1), 1-10 (2007).
  10. Scott, T. P. Complete genome and molecular epidemiological data infer the maintenance of rabies among kudu (Tragelaphus strepsiceros) in Namibia. PLoS One. 8 (3), e58739 (2013).
  11. Lembo, T., et al. Exploring reservoir dynamics: a case study of rabies in the Serengeti ecosystem. The Journal of Applied Ecology. 45 (4), 1246-1257 (2008).
  12. Coetzee, P., Nel, L. H. Emerging epidemic dog rabies in coastal South Africa: a molecular epidemiological analysis. Virus Research. 126 (1-2), 186-195 (2007).
  13. Ou de Munnink, B. B. First molecular analysis of rabies virus in Qatar and clinical cases imported into Qatar, a case report. International Journal of Infectious Diseases. 96, 323-326 (2020).
  14. Smith, J., et al. Case report: Rapid ante-mortem diagnosis of a human case of rabies imported into the UK from the Philippines. Journal of Medical Virology. 69, 150-155 (2003).
  15. Mahardika, G. N. K., et al. Phylogenetic analysis and victim contact tracing of rabies virus from humans and dogs in Bali, Indonesia. Epidemiology and Infection. 142 (6), 1146-1154 (2014).
  16. Tohma, K., et al. Molecular and mathematical modeling analyses of inter-island transmission of rabies into a previously rabies-free island in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 38, 22-28 (2016).
  17. Tohma, K., et al. Phylogeographic analysis of rabies viruses in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 23, 86-94 (2014).
  18. Saito, M., et al. Genetic diversity and geographic distribution of genetically distinct rabies viruses in the Philippines. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (4), e2144 (2013).
  19. Biek, R., Henderson, J. C., Waller, L. A., Rupprecht, C. E., Real, L. A. A high-resolution genetic signature of demographic and spatial expansion in epizootic rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 7993-7998 (2007).
  20. Reddy, G. B., et al. Molecular characterization of Indian rabies virus isolates by partial sequencing of nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P) genes. Virus Genes. 43, 13-17 (2011).
  21. David, D., Dveres, N., Yakobson, B. A., Davidson, I. Emergence of dog rabies in the northern region of Israel. Epidemiology and Infection. 137 (4), 544-548 (2009).
  22. Benjathummarak, S. Molecular genetic characterization of rabies virus glycoprotein gene sequences from rabid dogs in Bangkok and neighboring provinces in Thailand, 2013-2014. Archives of Virology. 161 (5), 1261-1271 (2016).
  23. Denduangboripant, J., et al. Transmission dynamics of rabies virus in Thailand: implications for disease control. BMC Infectious Diseases. 5, 52 (2005).
  24. Talbi, C., et al. Phylodynamics and human-mediated dispersal of a zoonotic virus. PLoS Pathogens. 6 (10), e1001166 (2010).
  25. Bourhy, H., et al. Revealing the micro-scale signature of endemic zoonotic disease transmission in an African urban setting. PLoS Pathogens. 12 (4), e1005525 (2016).
  26. Zinsstag, J., et al. Vaccination of dogs in an African city interrupts rabies transmission and reduces human exposure. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  27. Yakovleva, A., et al. Tracking SARS-COV-2 variants using Nanopore sequencing in Ukraine in 2021. Scientific Reports. 12, 15749 (2022).
  28. Mannsverk, S., et al. SARS-CoV-2 variants of concern and spike protein mutational dynamics in a Swedish cohort during 2021, studied by Nanopore sequencing. Virology Journal. 19, 164 (2022).
  29. Soufi, M., et al. Fast and easy nanopore sequencing workflow for rapid genetic testing of familial Hypercholesterolemia. Frontiers in Genetics. 13, 836231 (2022).
  30. Cabibbe, A. M. Application of targeted next-generation sequencing assay on a portable sequencing platform for culture-free detection of drug-resistant tuberculosis from clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 00632 (2020).
  31. Xu, Y., et al. Nanopore metagenomic sequencing of influenza virus directly from respiratory samples: diagnosis, drug resistance and nosocomial transmission, United Kingdom, 2018/19 influenza season. Euro Surveillance. 26 (27), 2000004 (2021).
  32. Stubbs, S. C. B., et al. Assessment of a multiplex PCR and Nanopore-based method for dengue virus sequencing in Indonesia. Virology Journal. 17, 24 (2020).
  33. Croville, G., et al. Rapid whole-genome based typing and surveillance of avipoxviruses using nanopore sequencing. Journal of Virological Methods. 261, 34-39 (2018).
  34. Theuns, S., et al. Nanopore sequencing as a revolutionary diagnostic tool for porcine viral enteric disease complexes identifies porcine kobuvirus as an important enteric virus. Scientific Reports. 8, 9830 (2018).
  35. O'Donnell, V. K., et al. Rapid sequence-based characterization of African swine fever virus by use of the Oxford Nanopore MinION sequence sensing device and a companion analysis software tool. Journal of Clinical Microbiology. 58, 01104-01119 (2019).
  36. Brito, A. F. Global disparities in SARS-CoV-2 genomic surveillance. Nature Communications. 13, 7003 (2022).
  37. ONT login/register. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://nanoporetech.com/login-register (2023).
  38. Software Downloads. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://community.nanoporetech.com/downloads (2023).
  39. GitHub. , Available from: https://github.com/ (2023).
  40. Brunker, K. Artic-rabv. , Available from: https://github.com/kirstyn/artic-rabv (2022).
  41. Campbell, K. MADDOG: Method for Assignment, Definition and Designation of Global Lineages. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  42. Campbell, K. RABV-GLUE. Centre for Virus Research. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  43. Itokawa, K., Sekizuka, T., Hashino, M., Tanaka, R., Kuroda, M. Disentangling primer interactions improves SARS-CoV-2 genome sequencing by multiplex tiling PCR. PLoS ONE. 15 (9), e0239403 (2020).
  44. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 818619 (2022).
  45. Döring, M., Pfeifer, N. openPrimeR: Multiplex PCR primer design and analysis. , (2023).
  46. Quick, J. Multiplex PCR method for MiniON and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
  47. Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization. 1, Available from: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/310836/9789241515153-eng.pdf (2018).
  48. Lembo, T. Partners for Rabies Prevention. The blueprint for rabies prevention and control: a novel operational toolkit for rabies elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (2), e1388 (2012).
  49. Terrestrial Manual Online Access. World Organization for Animal Health. , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2023).
  50. Mauti, S. Field postmortem rabies rapid immunochromatographic diagnostic test for resource-limited settings with further molecular applications. Journal of Visualized Experiments. (160), e60008 (2020).
  51. Patrick, E., et al. Enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test. Journal of Visualized Experiments. (146), e59416 (2019).
  52. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  53. Marston, D. A., et al. Pan-lyssavirus real time RT-PCR for rabies diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (149), e59709 (2019).
  54. Brunker, K. DNA quantification using the Qubit fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-qubit-fluorometer-bc6vize6 (2020).
  55. Quick, J. DNA quantification using the Quantus fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-quantus-fluorometer-7pzhmp6 (2020).
  56. Guppy protocol. Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revaq_14dec2018 (2023).
  57. Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004). Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/flow-cell-wash-kit-exp-wsh004/v/wfc_9120_v1_revh_08dec2020 (2023).
  58. Core Pipeline - arctic pipeline. , Available from: https://artic.readthedocs.io/en/latest/minion/ (2023).
  59. Samtools. , Available from: https://www.htslib.org (2023).
  60. Campbell, K., et al. Making genomic surveillance deliver: A lineage classification and nomenclature system to inform rabies elimination. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010023 (2022).
  61. Brunker, K., et al. Rapid in-country sequencing of whole virus genomes to inform rabies elimination programmes. Wellcome Open Research. 5, 3 (2020).
  62. Bull, R. A., et al. Analytical validity of nanopore sequencing for rapid SARS-CoV-2 genome analysis. Nature Communications. 11, 6272 (2020).
  63. Okeke, I. N., Ihekweazu, C. The importance of molecular diagnostics for infectious diseases in low-resource settings. Nature Reviews. Microbiology. 19 (9), 547-548 (2021).
  64. Inzaule, S. C., Tessema, S. K., Kebede, Y., Ouma, A. E. O., Nkengasong, J. N. Genomic-informed pathogen surveillance in Africa: opportunities and challenges. The Lancet Infectious Diseases. 21 (9), 281-289 (2021).
  65. Kennedy, L. Integrating contact tracing and whole-genome sequencing to track the elimination of dog-mediated rabies: an observational and genomic study. eLife. , (2023).
  66. Pallerla, S. R. Diagnosis of pathogens causing bacterial meningitis using Nanopore sequencing in a resource-limited setting. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 21, 39 (2022).
  67. Quick, J. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).

Tags

Helgenomsekventering hurtig karakterisering rabiesvirus nanoporeteknologi genomiske data transmissionssporing geografisk spredning infektionssygdomme lav- og mellemindkomstlande (LMIC'er) hundemedieret rabies vampyrflagermus folkesundhed økonomiske bekymringer prøve-til-sekvens-til-fortolkning-arbejdsgang nanoporeteknologi prøveindsamling rabiesdiagnose helgenomsekventeringsarbejdsgang primerdesign og optimering multiplexpolymerasekædereaktion (PCR) sekventering Biblioteksforberedelse live og offline baseopkald genetisk afstamningsbetegnelse fylogenetisk analyse implementering af arbejdsgange pipelinevalidering negative kontroller genomiske værktøjer (GLUE MADDOG) regionale og globale fylogenier
Helgenomsekventering til hurtig karakterisering af rabiesvirus ved hjælp af nanoporeteknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bautista, C., Jaswant, G., French,… More

Bautista, C., Jaswant, G., French, H., Campbell, K., Durrant, R., Gifford, R., Kia, G. S. N., Ogoti, B., Hampson, K., Brunker, K. Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology. J. Vis. Exp. (198), e65414, doi:10.3791/65414 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter