Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Helgenomsekvensering for rask karakterisering av rabiesvirus ved hjelp av nanoporeteknologi

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65414
Automatic Translation
1,2, 1,3,4,5, 1,6, 1, 1, 1,6, 7,8, 3,9, 1, 1,6
1School of Biodiversity, One Health & Veterinary Medicine, University of Glasgow, 2Research Institute for Tropical Medicine, 3University of Nairobi, Institute of Tropical and Infectious Diseases, 4Tanzania Industrial Research Development Organization, 5Ifakara Health Institute, 6MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, 7Department of Veterinary Public health, Ahmadu Bello University, 8African Centre of Excellence for Neglected Tropical Diseases and Forensic Biotechnology, Ahmadu Bello University, 9University of Nairobi, Kenya and Center for Epidemiological Modelling and Analysis, University of Nairobi

Summary

Her presenterer vi en rask og kostnadseffektiv arbeidsflyt for karakterisering av rabiesvirus (RABV) genomer ved hjelp av nanopore-teknologi. Arbeidsflyten er ment å støtte genomikkinformert overvåking på lokalt nivå, og gi informasjon om sirkulerende RABV-linjer og deres plassering i regionale fylogenier for å veilede rabieskontrolltiltak.

Abstract

Genomiske data kan brukes til å spore overføring og geografisk spredning av smittsomme sykdommer. Imidlertid er sekvenseringskapasiteten som kreves for genomisk overvåking fortsatt begrenset i mange lav- og mellominntektsland (LMICs), hvor hundmediert rabies og / eller rabies overført av dyreliv som vampyrflaggermus utgjør store folkehelse og økonomiske bekymringer. Vi presenterer her en rask og rimelig arbeidsflyt fra prøve til sekvens til tolkning ved hjelp av nanopore-teknologi. Protokoller for prøveinnsamling og diagnostisering av rabies er kort beskrevet, etterfulgt av detaljer om den optimaliserte arbeidsflyten for helgenomsekvensering, inkludert primerdesign og optimalisering for multiplex polymerasekjedereaksjon (PCR), en modifisert, billig sekvenseringsbibliotekforberedelse, sekvensering med live og offline baseanrop, genetisk avstamningsbetegnelse og fylogenetisk analyse. Implementering av arbeidsflyten demonstreres, og kritiske trinn fremheves for lokal distribusjon, for eksempel pipelinevalidering, primeroptimalisering, inkludering av negative kontroller og bruk av offentlig tilgjengelige data og genomiske verktøy (GLUE, MADDOG) for klassifisering og plassering innen regionale og globale fylogenier. Behandlingstiden for arbeidsflyten er 2-3 dager, og kostnadene varierer fra $ 25 per prøve for en 96-prøvekjøring til $ 80 per prøve for en 12-prøvekjøring. Vi konkluderer med at det er mulig å sette opp genomisk overvåking av rabiesvirus i LMICs og kan støtte fremgang mot det globale målet om null hundemedierte menneskelige rabiesdødsfall innen 2030, samt forbedret overvåking av rabiesspredning av dyreliv. Videre kan plattformen tilpasses andre patogener, og bidra til å bygge en allsidig genomisk kapasitet som bidrar til epidemi- og pandemiberedskap.

Introduction

Rabiesviruset (RABV) er et lyssavirus i familien Rhabdoviridae som forårsaker en dødelig nevrologisk sykdom hos pattedyr1. Selv om rabies er 100% forebygges ved vaksinasjon, er det fortsatt en stor folkehelse og økonomisk bekymring i endemiske land. Av de 60.000 menneskelige rabiesdødsfallene som anslås å forekomme hvert år, er over 95% i Afrika og Asia hvor hunder er det primære reservoaret2. I motsetning til dette har hundevaksinasjon ført til eliminering av hundemediert rabies over hele Vest-Europa, Nord-Amerika og mye av Latin-Amerika. I disse regionene er reservoarer av rabies nå begrenset til dyreliv, som, vaskebjørn, stinkdyr og ville canids3. Over hele Latin-Amerika er den vanlige vampyrflaggermusen en problematisk kilde til rabies på grunn av regelmessig overføring fra til både mennesker og husdyr under nattlig blodfôring4. Den årlige globale økonomiske effekten av rabies anslås å være 8, 6 milliarder dollar, med husdyrtap som står for 6% 5.

Sekvensdata fra virale patogener kombinert med metadata om tidspunkt og smittekilde kan gi robust epidemiologisk innsikt6. For RABV har sekvensering blitt brukt til å undersøke opprinnelsen til utbrudd7,8, identifisere vertsforeninger med dyreliv eller husdyr 8,9,10,11,12 og spore kilder til menneskelige tilfeller 13,14. Utbruddsundersøkelser ved hjelp av fylogenetiske analyser har indikert at rabies dukket opp i den tidligere rabiesfrie provinsen Bali, Indonesia, gjennom en enkelt introduksjon fra de nærliggende endemiske områdene Kalimantan eller Sulawesi15. I mellomtiden, på Filippinene, ble et utbrudd på Tablas Island, Romblon-provinsen vist seg å være introdusert fra hovedøya Luzon16. Virale genomiske data har også blitt brukt til å bedre forstå patogenoverføringsdynamikken som kreves for å målrette kontrolltiltak geografisk. For eksempel illustrerer genomisk karakterisering av RABV den geografiske grupperingen av klader 17,18,19, samsirkulasjon av linjer 20,21,22, menneskemediert virusbevegelse 17,23,24 og metapopulasjonsdynamikk 25,26.

Sykdomsovervåking er en viktig funksjon av genomisk overvåking som har blitt forbedret med den globale økningen i sekvenseringskapasitet som svar på SARS-CoV-2-pandemien. Genomisk overvåking har støttet sanntidssporing av SARS-COV-2-varianter av bekymring27,28 og tilhørende mottiltak6. Fremskritt innen tilgjengelig sekvenseringsteknologi, som nanoporeteknologi, har ført til forbedrede og rimeligere protokoller for rask sekvensering av både humane 29,30,31,32 og dyr33,34,35 patogener. I mange rabiesendemiske land er det imidlertid fortsatt barrierer for operasjonalisering av patogengenomisk overvåking, som vist ved globale forskjeller i SARS-CoV-2-sekvenseringskapasitet36. Begrensninger i laboratorieinfrastruktur, forsyningskjeder og teknisk kunnskap gjør etablering og rutinisering av genomisk overvåking utfordrende. I denne artikkelen demonstrerer vi hvordan en optimalisert, rask og rimelig arbeidsflyt for helgenomsekvensering kan distribueres for RABV-overvåking i ressursbegrensede innstillinger.

Protocol

Studien er godkjent av koordineringskomiteen for medisinsk forskning ved Nasjonalt institutt for medisinsk forskning (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), departementet for regional administrasjon og lokale myndigheter (AB.81/288/01), og Ifakara Health Institute Institutional Review Board (IHI/IRB/No:22-2014) i Tanzania; University of Nairobi Institute of Tropical and Infectious Diseases (P947/11/2019) og Kenya Medical Research Institute (KEMRI-SERU; protokoll nr. 3268) i Kenya; og Research Institute for Tropical Medicine (RITM), Department of Health (2019-023) på Filippinene. Sekvensering av prøver med opprinnelse fra Nigeria ble utført på arkivert diagnostisk materiale samlet inn som en del av nasjonal overvåking.

MERK: § 1-4 er en forutsetning. Avsnitt 5-16 beskriver prøve-til-sekvens-til-tolkningsarbeidsflyten for RABV nanoporesekvensering (figur 1). For påfølgende trinn i protokollen som trenger pulssentrifugering, sentrifuge ved 10-15.000 x g i 5-15 s.

1. Beregningsmiljøoppsett for sekvensering og dataanalyse

  1. Åpne Oxford Nanopore Technology (ONT) nettsted37 og opprett en konto for å få tilgang til nanopore-spesifikke ressurser.
    1. Logg inn og installer ONT-sekvenserings- og basecalling-programvaren38.
  2. Åpne GitHub39 og opprett en konto.
    1. Gå til artic-rabv40 og MADDOG repositories41 og følg installasjonsinstruksjonene.

2. Design eller oppdater multiplex primerskjemaet

MERK: Eksisterende RABV-ordninger er tilgjengelige i artic-rabv-depotet40. Ved målretting mot et nytt geografisk område bør det utformes en ny ordning, eller en eksisterende ordning endres for å inkludere ytterligere mangfold.

  1. Velg et genomreferansesett for å representere mangfoldet i studieområdet; Dette er vanligvis et sett med offentlig tilgjengelige sekvenser (f.eks. fra NCBI GenBank) eller foreløpige interne data. Følg trinn 2.1.1 for å bruke RABV-GLUE42, en RABV-sekvensdataressurs, til å filtrere og laste ned NCBI-sekvenser og tilknyttede metadata.
    MERK: Velg referansesekvenser med komplette genomer (dvs. uten hull og maskerte baser). Det anbefales å velge opptil 10 sekvenser som referansesett for primerdesign. Dersom tilgjengelige sekvensdata er ufullstendige eller ikke representative for studieområdet, se råd43,44,45 i tilleggsfil 1.
    1. Naviger til NCBI RABV Sequences by Clade-siden fra rullegardinmenyen Sekvensdata i RABV-GLUE. Klikk på koblingen Rabies Virus (RABV) for å få tilgang til alle tilgjengelige data eller velg en bestemt klade av interesse. Bruk filteralternativet for å legge til filtre som passer til de ønskede kriteriene (f.eks. opprinnelsesland, sekvenslengde). Last ned sekvenser og metadata.
  2. Generer et primerskjema for multiplekspolymerasekjedereaksjon (PCR) i henhold til instruksjonene gitt av Primal Scheme46. En 400 bp-ordning med 50 bp overlapping anbefales for å sekvensere prøver av lav kvalitet. Last ned og lagre alle utganger (ikke rediger filen eller primernavnene).
    MERK: Skjemaet vil bli indeksert til den første sekvensen i inngangen fasta, heretter referert til som 'indeksreferansen' (figur 2). Se Tilleggsfil 1 for alternativer for å optimalisere primerytelsen.

3. Sett opp RAMPART og ARTIC bioinformatikk rørledninger

  1. Se tilleggsfil 2 for å konfigurere en katalogstruktur for å administrere inndata-/utdatafilene for RAMPART og ARTIC bioinformatikk-pipeline.

4. Biosikkerhet og laboratorieoppsett

  1. Håndter potensielt rabies-positive prøver i biosikkerhetsnivå (BSL) 2 eller 3 forhold.
  2. Sørg for at laboratoriepersonalet har fullført rabiesvaksinasjon før eksponering og gjennomgår overvåking av immunitet i henhold til Verdens helseorganisasjons (WHO) anbefalinger3.
  3. Sikre at dedikerte standard driftsprosedyrer og risikovurderinger, som følger nasjonale eller internasjonale retningslinjer, er på plass for laboratoriet.
  4. Nødvendig laboratorieoppsett: Minimer forurensning ved å opprettholde fysisk separasjon mellom pre- og post-PCR-områder. I laboratorier med begrenset plass eller laboratorieinnstillinger i felten, bruk bærbare hanskerom eller provisoriske laboratoriestasjoner for å minimere forurensning.
  5. I denne protokollen må du sørge for å utpeke separate områder for:
    1. Prøveutvinning: Sett opp et BSL2/3 skap/hanskerom for å håndtere biologisk materiale og utføre inaktivering og RNA-ekstraksjon.
    2. Malområde: Sett opp et BSL1-skap/hanskerom for tilsetning av mal (RNA/cDNA) til den ferdiglagde reaksjonsmasterblandingen.
    3. Master mix område: Sett opp et eget rent område (BSL1 skap / hanskerom) for fremstilling av reagensmasterblandinger. Det skal ikke være noen mal på dette området.
    4. Post-PCR-område: Sett opp et eget område for arbeid med forsterkere og sekvensering av bibliotekforberedelse.
      MERK: Alle områder skal rengjøres med overflatedekontaminant og ultrafiolett (UV)-sterilisert før og etter bruk.

5. Feltprøveinnsamling og diagnose

MERK: Prøver må samles inn av opplært og immunisert personell iført personlig verneutstyr og i henhold til de refererte standardprosedyrene47,48,49.

  1. Samle prøven via foramen magnum (dvs. occipital rute), som beskrevet i detalj i Mauti et al.50.
  2. Diagnostiser rabies i feltet med raske diagnostiske tester og bekreft i laboratoriet ved hjelp av anbefalte prosedyrer47, for eksempel direkte fluorescerende antistofftest (DFA), direkte rask immunhistokjemisk test (DRIT) 51,52 eller sanntids revers transkripsjon (RT)-PCR 53.
  3. Bruk bekreftede positive hjerneprøver for RNA-ekstraksjon eller oppbevar i fryser ved -20 °C i 2-3 måneder eller -80 °C i lengre perioder. Bevare RNA for lagring og transport ved hjelp av et egnet DNA / RNA stabiliseringsmedium.

6. Prøvepreparering og RNA-ekstraksjon (3 timer)

MERK: Bruk et spinnkolonnebasert viralt RNA-ekstraksjonssett som passer for prøvetypen.

  1. Forbered to keramiske perlerør ved å fylle et 2 ml PCR-rør med ca. 200 μL rør fullt av 1,4 mm keramiske perler og merk røret.
  2. Legg til det anbefalte volumet av lysisbuffer som følger med i RNA-ekstraksjonssettet til det merkede PCR-røret.
  3. Få omtrent en 3 mm kube fra hjerneprøven bekreftet med rabiesinfeksjon ved hjelp av en treapplikator og satt inn i et merket rør med prøve-ID og 100 μL nukleasefritt vann inn i røret merket negativ kontroll.
    MERK: Bruk perlebasert homogenisering basert på lukkede rør for å begrense eksponeringen av prøven. Hvis det ikke er mulig, bruk andre egnede mekaniske forstyrrelser (f.eks. rotorbasert) eller en manuell mikropestle. Disse kan imidlertid være mindre effektive enn perleslag på hard overflate for å forstyrre vev (vevsprøver kan stivne i visse lagringsmedier).
  4. Forstyrr hjernevevet manuelt ved hjelp av en applikatorpinne av tre og deretter virvel med maksimal hastighet til fullstendig vevshomogenisering oppnås.
  5. Sentrifuger lysatet i henhold til produsentens instruksjoner, og bruk en pipette til å overføre supernatanten til et nytt merket mikrosentrifugerør. Bruk bare denne supernatanten i de påfølgende trinnene.
  6. Følg RNA-ekstraksjonssettets spinnkolonneinstruksjoner for å oppnå renset RNA.
  7. Inkluder en negativ ekstraksjonskontroll (NEC) her og ta hele veien gjennom til sekvenseringstrinnet.

7. cDNA-preparat (20 min)

  1. I masterblandingsområdet, lag en masterblanding for første streng cDNA-syntese i henhold til antall prøver og kontroller som skal behandles (med et overskuddsvolum på 10% for å sikre tilstrekkelig reagens; Tabell 1). En ikke-malkontroll (NTC) bør inkluderes på dette stadiet.
  2. Merk 0,2 ml PCR-striperør og alikot 5 μL av masterblandingen i rørene.
  3. Ta de forberedte rørene til malområdet. Tilsett 5 μL RNA i hvert merket rør, inkludert NEC. Tilsett 5 μL nukleasefritt vann (NFW) til NTC.
  4. Inkuber i en termisk syklist etter forholdene nevnt i tabell 1.
    MERK: Valgfritt pausepunkt: cDNA kan lagres ved -20 °C i opptil 1 måned om nødvendig, men å fortsette til PCR foretrekkes.

8. Klargjøring av primerbassenglager (1 time)

MERK: Dette trinnet er bare nødvendig hvis du lager nye lagre fra individuelle primere, hvoretter ferdiglagde stamløsninger kan brukes.

  1. Forbered et primerbasseng på 100 μM lager i master mix-området.
  2. Resuspender lyofiliserte primere i 1x tris-EDTA (TE) buffer eller NFW i en konsentrasjon på 100 μM hver. Vortex grundig og spinn ned.
    MERK: I de følgende trinnene er individuelle primere delt inn i to primerbassenger - oddetall nummerert (kalt basseng A) og partall (kalt basseng B) - for å unngå interaksjoner mellom primere som flankerer ampliconoverlappinger. Disse poolene av primere genererer overlappende 400 bp-amplicons som spenner over målgenomet.
  3. Ordne alle oddetallsprimere i et rørstativ. Generer et primerbassenglager ved å legge til 5 μL fra hver primer til et 1,5 ml mikrosentrifugerør merket "primer scheme name - Pool A (100 μM)".
  4. Gjenta prosessen for alle partallsprimere og merk som "primer scheme name - Pool B (100 μM)".
  5. Fortynn hvert primerbasseng 1:10 i molekylært vann for å generere 10 μM primerstokker.
    MERK: Lag flere alikoter med 10 μM primerfortynninger og frys dem i tilfelle nedbrytning eller forurensning.

9. Multiplex PCR (5 timer)

  1. Forbered to PCR-mastermikser, en for hvert primerbasseng i mastermiksområdet.
    1. Bruk en endelig konsentrasjon på 0,015 μM per primer. Beregn nødvendig primerpoolvolum for PCR-reaksjonen (tabell 2) ved å bruke følgende formel:
      Primerpoolvolum = antall primere x reaksjonsvolum x 0,015/konsentrasjon (μM) primerstokk
  2. Aliquot 10 μL hver av Pool A master mix og Pool B master mix til merkede PCR-striperør i malområdet. For hver prøve, tilsett 2,5 μL cDNA (fra trinn 3) til hver av de tilsvarende merkede primer Pool A- og B-reaksjonene. Overflødig cDNA kan lagres ved -20 °C.
  3. Bland ved forsiktig flikking og pulssentrifuge.
  4. Inkuber prøvene med betingelsene nevnt i tabell 2 på en PCR-maskin.
    MERK: Programmet inkluderer ikke et spesifikt forlengelsestrinn på grunn av den lange glødetiden på 5 minutter (nødvendig på grunn av det høye antallet primere) og den korte lengden på forsterkerne (400 bp) som er tilstrekkelig for forlengelsen.

10. PCR-opprydding og kvantifisering (3,5 timer)

  1. Utfør alt arbeid fra dette punktet i post-PCR-området.
  2. Aliquot fastfase reversibel immobilisering (SPRI) perler i mikrosentrifugerør fra hovedflasken. Oppbevares ved 4 °C.
  3. Varm en SPRI perle aliquot til romtemperatur (RT; ~ 20 ° C) og grundig virvel til perlene er helt resuspendert i løsningen.
  4. I 1,5 ml rør, kombiner primer Pool A og primer Pool B PCR-produkter for hver prøve. Tilsett om nødvendig vann for å bringe volumet til 25 μL.
  5. Legg til 25 μL SPRI-perler til hver prøve (1: 1 perle: prøveforhold). Bland ved å pipettere opp og ned eller banke forsiktig på røret.
  6. Inkubere ved RT i 10 min, av og til invertere eller flikke rørene.
  7. Plasser på et magnetstativ til perlene og løsningen er helt skilt. Fjern og kast supernatanten, pass på at perlepelleten ikke forstyrres.
  8. Vask to ganger med 80% etanol (oppvarmet til RT).
    1. Tilsett 200 μL etanol til pelleten. Vent i 30 sekunder for å sikre at perlene vaskes ordentlig.
    2. Fjern forsiktig og kast supernatanten, prøv å ikke berøre perlepelleten.
    3. Gjenta trinn 10.8.1-10.8.2 for å vaske pelleten en gang til.
  9. Fjern alle spor av etanol ved hjelp av en 10 μL-spiss. Lufttørk til sporetanol har fordampet (med små perler skjer dette raskt, ~ 30 s); Når dette skjer, skal pelleten gå fra skinnende til matt. Pass på at du ikke tørker for mye (hvis pelleten sprekker, er den for tørr), da dette vil påvirke DNA-utvinningen.
  10. Resuspender perlene i 15 μL NFW og inkuber ved RT (off magnetic rack) i 10 minutter.
  11. Gå tilbake til magnetstativet og overfør supernatanten (renset produkt) til et nytt 1,5 ml rør.
  12. Forbered en 1:10 fortynning av hver prøve i et separat rør (2 μL produkt + 18 μL NFW).
    MERK: Vær veldig forsiktig på dette stadiet for å unngå krysskontaminering. Ha bare ett amplikonrør åpent om gangen. Aliquot 18 μL vann inn i rørene først (i et rent masterblandingsområde).
  13. Mål DNA-konsentrasjonen av hver fortynnet prøve ved hjelp av et svært følsomt og spesifikt fluorometer, som beskrevet i protocols.io54,55.

11. Normalisering (30 min)

  1. Bruk normaliseringsmalen (tilleggsfil 3) og DNA-konsentrasjon (ng/μL) for hver prøve til å beregne volumet av fortynnet (eller pen) prøve som kreves for 200 fmol av hver prøve i et totalvolum på 5 μL.
  2. Merk nye PCR-rør og legg til beregnede volumer av NFW og prøve for å oppnå normalisert DNA.
  3. Bruk det beregnede volumet for ufortynnede (ryddige) prøver hvis over 5 μL av den fortynnede prøven er nødvendig for å oppnå 200 fmol.
    MERK: Valgfritt pausepunkt: På dette tidspunktet kan det opprensede PCR-produktet oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke eller plasseres ved -20 °C for lengre tids oppbevaring om nødvendig.

12. End-prep og strekkoding (1,5 t)

MERK: De neste trinnene forutsetter bruk av spesifikke reagenser fra nanopore-spesifikke strekkodings- og ligeringssekvenseringssett (se materialfortegnelse for detaljer). Protokollen kan overføres på tvers av forskjellige kjemiversjoner, men brukerne bør passe på å bruke kompatible sett, i henhold til produsentens instruksjoner.

  1. Avslutt reparasjon og dA-tailing
    1. Sett opp ende-prep-reaksjonen for hver prøve nevnt i tabell 3. Forbered en masterblanding i henhold til antall prøver (pluss 10% overskudd). Vær forsiktig når pipettering, da reagenser er tyktflytende.
    2. Tilsett 5 μL masterblanding i hvert rør av normalisert DNA (5 μL). Den totale reaksjonsblandingen skal være 10 μL. Bytt spissene hver gang og ha bare ett rør åpent om gangen.
    3. Inkuber i en termisk syklist under betingelsene nevnt i tabell 3.
  2. Strekkoding
    1. Aliquot strekkodene fra strekkodesettet til PCR-striperør ved 1,25 μL / rør, og registrer strekkode tildelt hver prøve.
    2. Tilsett 0,75 μL av den endepreppede prøven til den tildelte strekkodealikoten.
    3. Forbered en ligeringsmasterblanding i henhold til antall prøver (pluss 10% overskudd) (tabell 4).
    4. Tilsett 8 μL ligeringsmasterblanding til den endepreppede prøven + strekkoder, noe som gir en total reaksjon på 10 μL.
    5. Inkuber i en termisk syklist ved hjelp av betingelsene nevnt i tabell 4.
  3. SPRI perleopprydding og DNA-kvantifisering
    1. Tine kort fragmentbuffer (SFB) ved RT, bland ved virvel, pulssentrifuge og legg på is.
    2. Samle alle strekkodeprøvene sammen i et 1,5 ml lobind mikrosentrifugerør. For ikke å gjøre oppryddingsvolumet for stort til å bruke, pool 12-24 prøver (10 μL / prøve), opptil 48 prøver (5 μL / prøve), eller opptil 96 prøver (2,5 μL / prøve) fra hver innfødt strekkodingsreaksjon.
    3. Legg til et 0,4x volum SPRI-perler i det strekkodede bassenget. Bland forsiktig (flikking eller pipettering) og inkuber ved RT i 5 minutter.
    4. Plasser prøvene på en magnet til kulene har pelletert og supernatanten er helt klar (~2 min). Fjern og kast supernatanten. Pass på at du ikke forstyrrer perlene.
    5. Vask to ganger med 250 μL SFB.
      1. Fjern røret fra magneten og resuspender pelleten helt i 250 μL SFB. Inkubere i 30 s, puls sentrifuge, og gå tilbake til magneten.
      2. Fjern supernatanten og kast.
    6. Gjenta trinn 12.3.5 for å utføre en ny SFB-vask.
    7. Pulssentrifuge og fjern eventuell gjenværende SFB.
    8. Tilsett 200 μL 80% (RT) etanol for å bade pelleten. Fjern og kast etanolen, vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlepelleten. Lufttørk i 30 sekunder eller til pelleten har mistet glansen.
    9. Resuspender i 22 μL NFW ved RT i 10 minutter.
    10. Plasser på magneten, la den slå seg ned i ~ 2 min, fjern deretter løsningen forsiktig og overfør til et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    11. Bruk 1 μL for å oppnå DNA-konsentrasjonen, som beskrevet tidligere (trinn 10.13).
      MERK: Valgfritt pausepunkt: På dette tidspunktet kan biblioteket lagres ved 4 °C i opptil 1 uke eller -20 °C for lengre tidslagring, men det er å foretrekke å fortsette med adapterligering og sekvensering.

13. Sekvensering (maksimalt 48 timer)

  1. Klargjør datamaskinen (se også Forutsetninger § 1-4).
    1. Sjekk at det er nok plass til å lagre nye data (min 150 GB), data fra gamle kjøringer sikkerhetskopieres/flyttes til en server før sletting, og siste versjon av MinKNOW er installert.
  2. Fjern den lagrede flytcellen fra kjøleskapet og la den nå RT.
  3. Adapter ligering (1 time)
    1. Pulssentrifuger adapterblandingen og ligasen og legg på is.
    2. Tine elueringsbuffer (EB), SFB og ligeringsbuffer ved RT. Bland med vortexing, pulssentrifuge og legg på is.
    3. Forbered adapterligeringsmasterblandingen (tabell 5), kombinere reagenser i spesifisert rekkefølge i et lavbindingsrør.
      MERK: Alternativer for adapterligeringsmasterblandingsreagenser (tabell 5) kan brukes avhengig av tilgjengelighet på laboratoriet. Se Tilleggsfil 3 og Materialfortegnelse for en liste over alternativer. Bruk beregning i tilleggsfil 3-regnearket for å få volumet av DNA-bibliotek tilsvarende 200 fmol. Hvis mindre enn 20 μL beregnes, legg til NFW for å lage opptil 20 μL.
    4. Bland med forsiktig flikking og pulssentrifuge. Inkuber ved RT i 20 min.
      MERK: Begynn å klargjøre flytcellen under inkubasjon (pkt. 13.5).
  4. Rydd opp med SPRI-perler (ikke bruk etanol som i tidligere opprydding).
    1. Legg til et 0,4x volum SPRI-perler (RT) til prøvene. Inkuber ved RT i 10 minutter, flikk forsiktig periodisk for å hjelpe til med blanding.
    2. Plasser på magneten til perlene og løsningen er helt atskilt (~ 5 min). Fjern og kast supernatanten; Pass på at du ikke forstyrrer perlepelleten.
    3. Vask to ganger med 125 μL SFB.
    4. Resuspender pelleten helt med 125 μL SFB ved å blande med en pipette. La være å inkubere i 30 s.
    5. Pulssentrifuge for å samle væske ved rørbasen og plassere på magneten. Fjern supernatanten og kast.
    6. Gjenta trinn 13.4.4-13.4.5 for å vaske pelleten en gang til.
    7. Puls sentrifuge og fjern overflødig SFB.
    8. Resuspender i 15 μL EB og inkuber i 10 minutter ved RT.
    9. Gå tilbake til magneten i ~2 min og overfør deretter oppløsningen forsiktig til et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    10. Kvantifiser 1 μL av det eluerte biblioteket, som beskrevet tidligere i trinn 10.13
      MERK: For best resultat, fortsett direkte til MinION-sekvensering; Det endelige biblioteket kan imidlertid oppbevares i EB ved 4 °C i inntil 1 uke ved behov.
  5. Kjør en kvalitetskontroll av flytcellen.
    1. Koble sekvenseringsenheten til en bærbar datamaskin og åpne sekvenseringsprogramvaren.
    2. Velg flytcelletype, og klikk deretter Kontroller flytcelle og Start test.
    3. Når den er fullført, vises det totale antallet aktive (dvs. levedyktige) porer. En ny flytcelle skal ha >800 aktive porer; Hvis den ikke gjør det, kontakt produsenten for en erstatning.
  6. Klargjøring og lasting av flytcellen (20 min)
    1. Tine følgende reagenser ved RT og plasser deretter sekvenseringsbuffer, en spyleter, spylebuffer og lasteperler på is.
    2. Virvel sekvenseringsbufferen og spylebufferen, pulssentrifugen og legg på is.
    3. Puls sentrifuge flush tether og bland ved pipettering; Legg deretter på is.
    4. Forbered strømningscelleprimingblandingen ved å tilsette 30 μL spylebånd direkte til røret med spylebuffer fra et strømningscelleprimingssett og bland ved pipettering.
    5. Bland lastekulene ved å pipettere umiddelbart før bruk, da de legger seg raskt.
    6. Forbered den endelige bibliotekfortynningen for sekvensering i et nytt rør, som nevnt i tabell 5.
      MERK: Bruk beregning i tilleggsfil 3-regnearket for å få volumet av DNA-bibliotek tilsvarende 50 fmol. Hvis mindre enn 12 μL beregnes, legg til EB for å gjøre opptil 12 μL.
    7. Vipp lokket på sekvenseringsenheten bakover og skyv primingportdekselet med klokken slik at primingporten er synlig (figur 3)
    8. Fjern luftbobler forsiktig ved å sette en P1000-pipette til 200 μL, sett spissen inn i primingporten og vri hjulet til et lite volum som kommer inn i pipettespissen ses (maks sving til 230 μL).
    9. Legg 800 μL primingblanding av strømningsceller i strømningscellen via primingporten, og pass på at bobler unngås.
    10. La stå i 5 min.
    11. Løft prøveportdekselet forsiktig og legg 200 mikrol primingblanding inn i strømningscellen via primingporten ved hjelp av en P1000-pipette.
    12. Pipetter biblioteket blandes opp og ned før lasting, slik at innlastingsperler i masterblandingen resuspenderes før innlasting.
    13. Legg 75 μL bibliotekblanding til flytcellen via prøveporten på en dråpevis måte. Sørg for at hvert drypp strømmer inn i porten før du legger til neste.
    14. Sett prøveportdekselet forsiktig tilbake og pass på at prikken kommer inn i prøveporten.
    15. Lukk primingporten og sett på lokket på sekvenseringsenheten.
  7. Sekvenseringskjøring (maksimalt 48 timer)
    1. Koble sekvenseringsenheten til den bærbare datamaskinen og åpne sekvenseringsprogramvaren.
    2. Klikk Start , og klikk deretter Start sekvensering.
    3. Klikk Nytt eksperiment , og følg arbeidsflyten for det grafiske brukergrensesnittet i sekvenseringsprogramvaren for å konfigurere parameterne for kjøringen.
    4. Skriv inn eksperimentnavnet og eksempel-ID-en (f.eks. rabv_run1), og velg Flytcelletype fra rullegardinmenyen.
    5. Fortsett å kit utvalg og velg relevant ligering sekvensering kit og native strekkoding kit (er) brukt.
    6. Fortsett å kjøre alternativer. Behold standardinnstillingene, med mindre det er ønskelig at kjøringen skal stoppe automatisk etter et visst antall timer (kjøringer kan stoppes manuelt når som helst).
    7. Fortsett til Basecalling. Velg å slå basecalling på eller av i henhold til databehandlingsressursene (se datamaskinoppsett). Velg Rediger alternativer under strekkoding og sørg for at strekkode begge ender er slått på. Lagre og fortsett til utdatadelen.
    8. Godta standardinnstillingene og fortsett til endelig gjennomgang, kontroller innstillingene og registrer detaljene i regneark (tilleggsfil 3). Klikk Start.
      MERK: Hvis flytcellen brukes på nytt, justerer du startspenningen (i den avanserte delen av kjørealternativene), som angitt av skjemaet i tilleggsfil 3.
    9. Ta opp de første aktive kanalene - hvis dette er betydelig lavere enn kvalitetskontrollen (QC), start sekvenseringsprogramvaren på nytt. Hvis den fortsatt er lavere, start datamaskinen på nytt.
    10. Ta opp de første kanalene i tråd kontra enkeltpore for å gi et omtrentlig porebelegg. Dette tallet vil variere, så gi en tilnærming.
    11. Overvåk kjøringen mens den skrider frem.

14. Live og offline basecalling

MERK: Disse instruksjonene forutsetter at den eksisterende katalogstrukturen som er angitt i artic-rabv-repositoriet, og at forutsetningene del 1 og 3 i protokollen er fulgt.

  1. På ditt lokale filsystem oppretter du en ny katalog kalt analyse, hvor du vil lagre alle analyseutgangene dine. For å organisere videre: opprett en underkatalog med navnet på prosjektet ditt og inne i det en ny katalog for kjøringen, ved hjelp av eksempel-IDen som er gitt til MinKNOW som run_name. Gjør dette i en kommando som følger:
    mkdir -p
    analyse/project_name/run_name
    Naviger deretter til plasseringen:
    CD
    bane/analyse/project_name/run_name
  2. Live basecalling
    MERK: For å utføre nanopore-basecalling i sanntid krever bærbare datamaskiner en NVIDIA CUDA-kompatibel grafikkbehandlingsenhet (GPU). Forsikre deg om at instruksjonene for GPU-basecalling-oppsettet er utført ved hjelp av guppy-protokollen56.
    1. Under løpeoppsettet slår du på basecalling i sanntid.
    2. Bruk RAMPART til å overvåke sekvenseringsdekningen i sanntid, i henhold til instruksjonene nedenfor.
    3. I datamaskinens terminal, aktiver artic-rabv conda-miljøet:
      Conda aktiverer Artic-Rabv
    4. Opprett en ny katalog for rampart-utgangen i run_name-katalogen og naviger inn i den:
      cd / bane / analyse / project_name / run_name
      mkdir rampart_output
      CD rampart_output
    5. Opprett en strekkoder.csv fil for å pare strekkodene og eksempelnavnene. Den skal ha en linje per strekkode og bare spesifisere strekkoder som finnes i biblioteket, med overskriftene "strekkode" og "prøve". Følg eksemplet i artic-rabv-katalogen:
      analyse/example_project/example_run/rampart_output/strekkoder.csv
    6. Start RAMPART ved å gi den relevante protokollmappen og banen til fastq_pass-mappen i MinKNOW-utgangen for kjøringen:
      rampart --protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol - basecalledPath
    7. Åpne et nettleservindu og naviger til localhost: 3000 i URL-boksen. Vent til tilstrekkelige data er basert på presentasjonen før resultatene vises på skjermen.
  3. Frakoblet basecalling (utføres etter kjøring)
    1. Hvis live basecalling ikke ble angitt, vil utgangen fra MinKNOW være rå signaldata (fast5-filer). Man vil ikke kunne bruke RAMPART under løpet. Konverter fast5-filene til basecalled data (fastq-filer) etter kjøring ved hjelp av guppy (se oppsett i Forutsetninger trinn 1.1.1.). Kjør RAMPART post-hoc på basecalled data.
    2. Kjør guppy basecaller:
      guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /path/to/reads/fast5_* -s /path/analysis/project_name/run_name -x auto-r
      -c er konfigurasjonsfilen for å spesifisere basecalling-modellen, -i er inngangsbanen, -s er lagringsbanen, -x spesifiserer basecalling av GPU-enheten (ekskluder hvis du bruker datamaskinversjonen av guppy), og -r spesifiserer å søke i inndatafiler rekursivt.
      MERK: Konfigurasjonsfilen (.cfg) kan endres til en basecaller med høy nøyaktighet ved å erstatte _fast med _hac, selv om dette vil ta betydelig lengre tid.

15. Vask flytcellene

  1. Flytcellene kan vaskes og gjenbrukes til å sekvensere nye biblioteker hvis porene fortsatt er levedyktige. Se instruksjoner for vask på ONT flow cell wash protocol57.

16. Analyse og tolkning

  1. Konsensussekvensgenerering med ARTIC bioinformatikkrørledning
    1. Følg instruksjonene som er beskrevet i artic-rabv GitHub repository40 i rabv_protocols-mappen for å generere konsensussekvenser fra rå fast5 eller basecalled fastq-filer.
      MERK: Se Artic pipeline - Core pipeline58 for ytterligere veiledning.
  2. Valgfritt: Analyser gjennomsnittlig lesedybde per forsterker.
    1. Tilpass skriptene som er tilgjengelige fra artic-rabv-depotet, med henvisning til tilleggsfil 1. Kort fortalt genereres dyptgående statistikk ved hjelp avSAM59 og dekning per nukleotid plottet i R.
  3. Fylogenetisk analyse ved bruk av GLUE
    1. Fra RABV_GLUE42 velger du kategorien Analyse > Genotyping og tolkning > Legg til filer, og velger fastafilen med konsensussekvenser.
    2. Klikk på Send inn, og vent. Når analysene er fullført, vil Vis analyse-knappen være tilgjengelig for å klikke, og vise klade- og underkladeoppgaver, dekning per gen, variasjon fra referansesekvenser og nærmeste slektning.
    3. Relevante kontekstuelle sekvenser kan også identifiseres i avsnittet Sequence Data > NCBI Sequences by Clade .
    4. Velg den identifiserte kladen eller klikk Rabies Virus (RABV) for å se alle tilgjengelige sekvenser.
    5. Filtrer etter relevante sekvenser (f.eks. opprinnelsesland).
    6. Last ned disse sekvensene og tilhørende metadata for analyse og sammenligning.
  4. Avstamningsoppgave ved bruk av MADDOG41
    1. Trekk MADDOG-depotet fra GitHub for å sikre at du jobber med den mest oppdaterte versjonen.
    2. Opprett en oppdragsmappe i det lokale MADDOG-repositoriet (tidligere opprettet i Forutsetninger-delen) kalt kjørenavnet.
    3. Inne i mappen, legg til fasta-filen som inneholder konsensussekvensene.
    4. Legg til en metadatafil i mappen.
      MERK: Denne filen må være en csv med 4 kolonner kalt 'ID', 'land', 'år' og 'oppgave', som beskriver sekvens-ID-ene, prøvetakingslandet og året for prøveinnsamlingen, mens kolonnen 'oppgave' skal være tom.
    5. I kommandolinjegrensesnittet aktiverer du conda-miljøet: conda activate MADDOG.
    6. I kommandolinjegrensesnittet navigerer du til MADDOG repository-mappen.
    7. I første omgang må du foreta avstamningstildeling på sekvenser for å se etter potensielle avvik og for å identifisere om det vil være hensiktsmessig å kjøre det lengre avstamningsbetegnelsestrinnet. For dette skriver du dette på kommandolinjen: sh assignment.sh.
    8. Når du blir bedt om det, skriv inn Y for å indikere at du har trukket depotet og jobber med den mest oppdaterte versjonen av MADDOG.
    9. Når du blir bedt om det, skriv inn navnet på mappen i MADDOG repository-mappen som inneholder fasta-filen.
    10. Når avstamningsoppdraget er fullført, sjekk utdatafilen i mappen din. Hvis utdataene er som forventet og det er flere sekvenser tilordnet samme avstamning, kjører du avstamningsbetegnelsen.
    11. Hvis du kjører avstamningsbetegnelse, sletter du oppdragsutdatafilen som nettopp ble opprettet.
    12. I terminalen, inne i MADDOG repository mappen, kjør kommandoen sh designation.sh.
    13. Når du blir bedt om det, skriv inn Y for å indikere at du har trukket depotet og jobber med den mest oppdaterte versjonen av MADDOG.
    14. Når du blir bedt om det, skriv inn mappenavnet i MADDOG repository-mappen som inneholder fasta-filen og metadataene. Dette gir ut avstamningsinformasjon om hver sekvens, en fylogeni av de nye og relevante tidligere sekvensene (fra 16.3.6), hierarkisk informasjon om linjene, og detaljer om potensielt nye linjer og områder med undersampling.
      MERK: Fullstendige detaljer om protokollen, bruken og utgangene finner du i Campbell et al.60.
    15. Når den første analysen er fullført, angir du Y hvis du blir bedt om å teste for nye og undersamplede linjer, hvis dette er nødvendig. Hvis ikke, skriver du inn N.
    16. Hvis du blir bedt om å bekrefte nye linjer, skriver du inn Y og følger instruksjonene i den resulterende NEXT_STEPS.eml-filen. Hvis ikke, skriver du inn N.

Representative Results

Arbeidsflyten fra prøve til sekvens til tolkning for RABV beskrevet i denne protokollen har blitt brukt med hell under forskjellige laboratorieforhold i endemiske land, som Tanzania, Kenya, Nigeria og Filippinene (figur 4). Protokollen ble brukt på ulike prøvetyper og betingelser (tab 6): ferskt og frossent hjernevev, cDNA- og RNA-ekstrakter fra hjernevev transportert under kjølekjede i lengre perioder, og FTA-kort med hjernevevsutstryk.

Live basecalling ved hjelp av RAMPART (figur 5) viser nesten sanntidsgenerering av avlesninger og prosentvis dekning per utvalg. Dette er spesielt nyttig når du skal bestemme når du skal stoppe kjøringen og lagre flytcellen for gjenbruk. Variasjon i kjøretid ble observert, med noen ferdig på 2 timer, mens andre kunne ta mer enn 12 timer for en tilstrekkelig dybde av dekning (x100) som skal nås. Vi kan også se regioner med dårlig forsterkning; For eksempel viser figur 6 et øyeblikksbilde av en sekvenseringskjøring der dekningsprofiler viser noen forsterkere med svært lav forsterkning, noe som indikerer potensielt problematiske primere. Ved å undersøke disse dårlig forsterkende regionene grundigere, har vi vært i stand til å identifisere primeravvik, noe som vil gjøre det mulig for oss å redesigne og forbedre individuelle primere. Noen primerordninger har vist flere misforhold enn andre. Dette observeres i Øst-Afrikas primærordning, sammenlignet med Filippinene, i tråd med det målrettede mangfoldet, da Øst-Afrika-ordningen tar sikte på å fange et mye bredere mangfold.

RABV-GLUE42, en generell ressurs for RABV-genomdatahåndtering, og MADDOG60, et avstamningsklassifiserings- og nomenklatursystem, ble brukt til å kompilere og tolke resulterende RABV-sekvenser. Tabell 7 viser de store og mindre kladene som sirkulerer i hvert land som er tildelt ved hjelp av RABV-GLUE. Det vises også en høyere oppløsningsklassifisering av lokale linjer etter MADDOG-oppdraget.

Figure 1
Figur 1: Prøve-til-sekvens-til-tolkning-arbeidsflyt for RABV. Oppsummerte trinn vises for (A) prøvepreparering, (B) PCR og bibliotekpreparering, og (C) sekvensering og bioinformatikk opp til analyse og tolkning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk primerskjema. Glødningsposisjoner langs 'indeksreferansegenomet' (mørk lilla) for par av forover- og bakoverprimere (halvpiler), som er tildelt i to separate puljer: A (rød) og B (grønn). Primerpar genererer 400 bp overlappende amplicons (blå) som nummereres sekvensielt langs indeksreferansegenomet i formatet 'scheme_name_X_DIRECTION', hvor 'X' er et tall som refererer til amplikonen generert av primeren og 'DIRECTION' er enten 'LEFT' eller 'RIGHT', som beskriver henholdsvis fremover eller bakover. Oddetalls- eller partallsverdier av 'X' bestemmer bassenget (henholdsvis A eller B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Nanopore strømningscelle48. Blå etiketter illustrerer de forskjellige delene av flytcellen, inkludert primingportdekselet som dekker primingporten der primingløsningen tilsettes, SpotON-prøveportdekselet som dekker prøveporten der prøven tilsettes dråpevis, avfallsportene 1 og 2 og flytcelle-ID-en. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kart som viser stedet der RABV-sekvensering ble utført ved hjelp av den optimaliserte arbeidsflyten i 2021 og 2022. Boblestørrelse og farge tilsvarer antall sekvenser per sted, der mindre og mørkere er færre, mens større og lysere er mer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Skjermbilde av RAMPART-visualisering i nettleser. Strekkodenavn erstattes av eksempelnavn i henhold til bioinformatikkoppsettet. De tre øverste panelene viser sammendragsplott for hele løpet: dekningsdybde for kartlagte avlesninger for hver strekkode per nukleotidposisjon på indeksreferansegenomet (øverst til venstre, farget av strekkode), summerte kartlagte avlesninger fra alle strekkoder over tid (øverst i midten) og kartlagte avlesninger per strekkode (øverst til høyre, farget av strekkode). Nedre paneler viser rader med plott per strekkode. Fra venstre til høyre: dybden av dekning av kartlagte avlesninger per nukleotidposisjon på indeksreferansegenomet (venstre), lengdefordeling av kartlagte avlesninger (midten), og andel nukleotidposisjoner på indeksreferansegenomet som har fått 10x, 100x og 1000x dekning av kartlagte avlesninger over tid (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Et eksempel leser dekning over genomet for en rabiesvirusprøve fra Filippinene sekvensert ved hjelp av protokollen. Lesedekning ved hver nukleotidposisjon i genomet vises, sammen med posisjonen til de overlappende amplikonene (1-41) som brukes til å generere biblioteket. Spikes i dekningsdybden tilsvarer områder med amplikon overlapping. Amplicons med lav dybde av dekning tilsvarer områder med amplikon overlapping. Forsterkere med lav dybdedybde er uthevet i rødt, noe som indikerer problematiske regioner som kan kreve optimalisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Masterblanding og termiske syklistbetingelser for cDNA-klargjøring. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Master mix og termiske syklistforhold for multiplex PCR. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Mastermiks og termiske syklistbetingelser for end-prep-reaksjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Master mix og termisk syklist forhold for strekkoding. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 5: Adapterligeringsmasterblanding og endelig bibliotekfortynning for sekvensering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 6: Antall rabiesvirus hele genomsekvenser generert og typen prøver som brukes i forskjellige land ved hjelp av prøve-til-sekvens-til-tolkningsarbeidsflyt. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 7: Store og mindre kladeoppgaver fra RABV-GLUE og avstammingsoppgaver fra MADDOG for sekvenser generert ved hjelp av arbeidsflyten. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: Primerskjemadesign og optimalisering, og amplikon lesedybdeanalyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Beregningsoppsett Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: RABV WGS-protokollark Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

En tilgjengelig RABV, nanopore-basert, helgenomsekvenseringsarbeidsflyt ble utviklet av Brunker et al.61, ved hjelp av ressurser fra ARTIC-nettverket46. Her presenterer vi en oppdatert arbeidsflyt, med komplette trinn fra prøve til sekvens til tolkning. Arbeidsflyten beskriver utarbeidelsen av hjernevevsprøver for helgenomsekvensering, presenterer en bioinformatikkrørledning for å behandle avlesninger og generere konsensussekvenser, og fremhever to rabiesspesifikke verktøy for å automatisere avstamningstildeling og bestemme fylogenetisk kontekst. Den oppdaterte arbeidsflyten inneholder også omfattende instruksjoner for oppsett av passende beregnings- og laboratoriearbeidsområder, med hensyn til implementering i forskjellige sammenhenger (inkludert innstillinger med lave ressurser). Vi har demonstrert vellykket implementering av arbeidsflyten i både akademiske og forskningsinstituttinnstillinger i fire RABV endemiske LMICs med ingen eller begrenset genomisk overvåkingskapasitet. Arbeidsflyten har vist seg å være motstandsdyktig mot bruk på tvers av ulike innstillinger, og forståelig for brukere med varierende ekspertise.

Denne arbeidsflyten for RABV-sekvensering er den mest omfattende offentlig tilgjengelige protokollen (som dekker trinn fra prøve til sekvens til tolkning) og er spesielt tilpasset for å redusere både oppstarts- og driftskostnader. Tiden og kostnadene som kreves for bibliotekforberedelse og sekvensering med nanopore-teknologi er sterkt redusert i forhold til andre plattformer, for eksempel Illumina61, og kontinuerlig teknologiutvikling forbedrer sekvenskvalitet og nøyaktighet for å være sammenlignbar med Illumina62.

Denne protokollen er designet for å være motstandsdyktig i ulike lavressurskontekster. Ved å referere til feilsøkings- og endringsveiledningen som gis sammen med kjerneprotokollen, støttes brukerne for å tilpasse arbeidsflyten til deres behov. Tilføyelsen av brukervennlige bioinformatiske verktøy til arbeidsflyten utgjør en stor utvikling av den opprinnelige protokollen, og gir raske og standardiserte metoder som kan brukes av brukere med minimal tidligere bioinformatikkerfaring for å tolke sekvensdata i lokale sammenhenger. Kapasiteten til å gjøre dette in situ er ofte begrenset av behovet for å ha spesifikke programmerings- og fylogenetiske ferdigheter, noe som krever en intensiv og langsiktig ferdighetstreningsinvestering. Selv om dette ferdighetssettet er viktig for å tolke sekvensdata grundig, er grunnleggende og tilgjengelige tolkningsverktøy like ønskelige for å kapasitere lokale "sekvenseringsmestere", hvis kjernekompetanse kan være våtlaboratoriebasert, slik at de kan tolke og ta eierskap over dataene sine.

Siden protokollen har blitt gjennomført i flere år i flere land, kan vi nå gi veiledning om hvordan man optimaliserer multipleksprimerordninger for å forbedre dekningen og håndtere akkumulert mangfold. Det er også gjort en innsats for å hjelpe brukerne med å forbedre kostnadseffektiviteten eller for å gjøre det enkelt å anskaffe i en gitt region, noe som vanligvis er en utfordring for bærekraften til molekylæretilnærminger63. For eksempel, i Afrika (Tanzania, Kenya og Nigeria), valgte vi stump / TA ligase master mix på adapterligeringstrinnet, som var lettere tilgjengelig fra lokale leverandører og et billigere alternativ til andre ligeringsreagenser.

Av erfaring er det flere måter å redusere kostnaden per prøve og per kjøring. Å redusere antall prøver per kjøring (f.eks. fra 24 ned til 12 prøver) kan forlenge levetiden til flytceller over flere kjøringer, mens å øke antall prøver per kjøring maksimerer tiden og reagensene. I våre hender var vi i stand til å vaske og gjenbruke flytceller for en av tre sekvenseringskjøringer, slik at ytterligere 55 prøver kunne sekvenseres. Vasking av flytcellen umiddelbart etter bruk, eller hvis det ikke var mulig, fjerning av avfallsvæsken fra avfallskanalen etter hver kjøring, syntes å bevare antall porer tilgjengelig for en andre kjøring. Med tanke på det opprinnelige antallet porer som er tilgjengelige i en flytcelle, kan en kjøring også optimaliseres for å planlegge hvor mange prøver som skal kjøres i en bestemt flytcelle.

Selv om arbeidsflyten har som mål å være så omfattende som mulig, med tillegg av detaljert veiledning og skiltede ressurser, er prosedyren fortsatt kompleks og kan være skremmende for en ny bruker. Brukeren oppfordres til å søke personlig opplæring og støtte, ideelt lokalt, eller alternativt gjennom eksterne samarbeidspartnere. På Filippinene har for eksempel et prosjekt om kapasitetsbygging i regionale laboratorier for SARS-CoV-2 genomisk overvåking ved hjelp av ONT utviklet kjernekompetanse blant helsepersonell som er lett overførbare til RABV-sekvensering. Viktige trinn, for eksempel opprydding av PRI-perler, kan være vanskelige å mestre uten praktisk trening, og ineffektiv opprydding kan skade flytcellen og kompromittere løpet. Prøvekontaminering er alltid et stort problem når amplicons behandles i laboratoriet og kan være vanskelig å eliminere. Spesielt er krysskontaminering mellom prøver ekstremt vanskelig å oppdage under bioinformatikk etter kjøring. God laboratorieteknikk og praksis, som å opprettholde rene arbeidsflater, skille pre- og post-PCR-områder og innlemme negative kontroller, er avgjørende for å sikre kvalitetskontroll. Det raske tempoet i utviklingen av nanoporesekvensering er både en fordel og ulempe for rutinemessig RABV-genomisk overvåking. Fortsatte forbedringer av nanopores nøyaktighet, tilgjengelighet og protokollrepertoar utvider og forbedrer omfanget for applikasjonen. Den samme utviklingen gjør det imidlertid utfordrende å opprettholde standard driftsprosedyrer og bioinformatiske rørledninger. I denne protokollen gir vi et dokument som hjelper overgangen fra eldre til nåværende nanopore bibliotekforberedelsessett (Table of Materials).

En vanlig hindring for sekvensering i LMICs er tilgjengelighet, inkludert ikke bare kostnadene, men også muligheten til å anskaffe forbruksvarer i tide (spesielt sekvenseringsreagenser, som er relativt nye for innkjøpsteam og leverandører) og beregningsressurser, samt ganske enkelt å ha tilgang til stabil strøm og internett. Bruk av bærbar nanopore sekvenseringsteknologi som grunnlag for denne arbeidsflyten hjelper med mange av disse tilgjengelighetsproblemene, og vi har demonstrert bruken av protokollen vår på tvers av en rekke innstillinger, og gjennomfører hele protokollen og analysen i landet. Riktignok er det fortsatt en utfordring å anskaffe utstyr og sekvensere forbruksvarer i tide, og i mange tilfeller ble vi tvunget til å frakte eller sende reagenser fra Storbritannia. I noen områder var vi imidlertid i stand til å stole helt på lokale forsyningsruter for reagenser, og dra nytte av investeringer i SARS-CoV-2-sekvensering (f.eks. Filippinene) som har strømlinjeformet anskaffelsesprosesser og begynt å normalisere anvendelsen av patogengenomikk.

Behovet for en stabil internettforbindelse minimeres av engangsinstallasjoner; for eksempel krever GitHub-depoter, nedlasting av programvare og nanopore-sekvensering i seg selv bare internettilgang for å starte kjøringen (ikke hele) eller kan utføres helt offline etter avtale fra selskapet. Hvis mobildata er tilgjengelig, kan en telefon brukes som et hotspot til den bærbare datamaskinen for å starte sekvenseringskjøringen, før du kobler fra for kjørevarigheten. Ved rutinemessig behandling av prøver kan kravene til datalagring vokse raskt, og ideelt sett vil data lagres på en server. Ellers er solid state drive (SSD) harddisker relativt billige å kilde.

Selv om vi erkjenner at det fortsatt er barrierer for genomisk overvåking i LMICs, øker investeringen i å bygge genomikk tilgjengelighet og kompetanse (f.eks. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa PGI])64 antyder at denne situasjonen vil bli bedre. Genomisk overvåking er kritisk for pandemiberedskap6, og kapasitet kan etableres gjennom rutinisering av genomisk overvåking av endemiske patogener som RABV. Globale forskjeller i sekvenseringskapasiteter fremhevet under SARS-CoV-2-pandemien bør være en driver for katalytisk endring for å takle disse strukturelle ulikhetene.

Denne arbeidsflyten fra prøve til sekvens til tolkning for RABV, inkludert tilgjengelige bioinformatikkverktøy, har potensial til å bli brukt til å veilede kontrolltiltak rettet mot målet om null menneskelige dødsfall fra hundemediert rabies innen 2030, og til slutt for eliminering av RABV-varianter. Kombinert med relevante metadata muliggjør genomiske data generert fra denne protokollen rask RABV-karakterisering under utbruddsundersøkelser og ved identifisering av sirkulerende linjer i et land eller en region60,61,65. Vi illustrerer rørledningen vår for det meste ved hjelp av eksempler fra hundemediert rabies; Arbeidsflyten er imidlertid direkte anvendelig for rabies i dyrelivet. Denne overførbarheten og lave kostnadene minimerer utfordringene med å gjøre rutinemessig sekvensering lett tilgjengelig, ikke bare for rabies, men også for andre patogener46,66,67, for å forbedre sykdomsbehandling og kontroll.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton-finansiering fra Medical Research Council [MR/R025649/1] og Philippines Department of Science and Technology (DOST), Storbritannias forsknings- og innovasjonsglobale innsats på COVID-19 [MR/V035444/1], University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], og International Partnership Development Fund, et DOST British Council-Filippinene studentskap (CB), et nasjonalt institutt for helseforskning [17/63/82] GemVi-stipend (GJ) og University of Glasgow studentships fra MVLS DTP (KC) [125638-06], EPSRC DTP (RD) [EP / T517896/1] og Wellcome IIB DTP (HF) [218518 / Z / 19 / Z]. Vi er takknemlige for kolleger og samarbeidspartnere som har støttet dette arbeidet: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana og Anna Czupryna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brand name
Software
Sequencing software
(MinKnow)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/downloads
Bioinformatics tool kit
(Guppy)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018
Equipment
Thermal cycler
(miniPCR™ mini16 thermal cycler)		 Cambio MP-QP-1016-01
Homogenizer
(Precellys Evolution Touch Homogenizer)		 Bertin Instruments EQ02520-300
Cold Racks (0.2-0.5mL)
(PCR Mini-cooler with transparent lid)		 BRAND  781260
Pipettor
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) Gilson  SKU: FA10030
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) Gilson  SKU: FA10024
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) Gilson  SKU: FA10020
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) Gilson  SKU: FA10025
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) Gilson  SKU: FA10021
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) Gilson  SKU: FA10026
Fluorometer
(Qubit  4 Fluorometer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q33238
Laptop 
(Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU])
Microcentrifuge
(Refrigerated centrifuge)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 75004081
Vortex mixer
(Basic vortex mixer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 88882011
Magnetic rack
(DynaMag -2 Magnet)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 12321D
Sequencing device
(MinION)		 Oxford Nanopore Technologies MinION Mk1B
RNA Extraction 
RNA extraction kit
(Qiagen RNEasy Mini Kit 250)		 Qiagen 74106
RNA stabilizing reagents 
(RNA later)  Invitrogen AM7020
(DNA/RNA Shield) Zymo Research R1100-50
PCR
Nuclease-free Water
(Nuclease-free Water [not  DEPC-treated])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific AM9937
Master mix for first strand cDNA synthesis
(LunaScript RT SuperMix Kit)		 New England Biolabs E3010S
DNA amplification master mix
(Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])		 New England Biolabs M0494L
Primer (Scheme)
(Custom DNA oligos)		 Invitrogen
SPRI Bead Clean-up
SPRI beads
(Aline Biosciences PCR Clean DX )		 Cambio AL-AC1003-50
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] Merck 818760
Short Fragment buffer
(SFB expansion pack)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-SFB001
DNA Quantification
DNA quantification kit
(Qubit® dsDNA HS Assay Kit)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32854
DNA quantification assay tubes
(Qubit™ Assay Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32856
End Prep and barcoding
(Qubit™ Assay Tubes)
End Prep master mix
(NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)		 New England Biolabs E7546L
Barcoding kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9 
(Native Barcoding Expansion 1-12) EXP-NBD104 
(Native Barcoding Expansion 13-24)  EXP-NBD114 
(Native Barcoding Expansion 96) EXP-NBD196
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
(not compatible)  (not compatible) 
(Native Barcoding Kit 24 V14) SQK-NBD114.24
(Native Barcoding Kit 96 V14) SQK-NBD114.96
Ligation mastermix
(Blunt/TA Ligase Master Mix)		 New England Biolabs M0367S
Adapter Ligation
Adapter ligation master mix
(NEBNext  Quick Ligation Module) New England Biolabs E6056S  
(NEBNext Ultra II Ligation Module)  New England Biolabs E7595S
(Blunt/TA Ligase Master Mix) New England Biolabs M0367S
Adapter mix
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-AMII001
(Adapter Mix II [AMII])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-NBA114
(Native adapter [NA])
Sequencing 
Flowcell priming kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-FLP002
(Flush Buffer [FB])
(Flush Tether [FT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-FLP004
(Flow Cell Flush [FCF])
(Flow Cell Tether [FCT])
Ligation Sequencing Kit 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
SQK-LSK109
Adapter Mix
(Adapter Mix [AMX])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SQB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LB])
Sequencing Tether
(Sequencing Tether [SQT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
SQK-LSK114
Adapter Mix
(Ligation Adapter [LA])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LIB])
Sequencing Tether
(Flow Cell Tether [FCT])
Library solution
(Library solution [LIS])
Flush buffer
(Flow Cell Flush [FCF])
Flow Cell 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
FLO-MIN106D
(Flow Cell  [R9.4.1])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
FLO-MIN114
(Flow Cell  [R10.4.1])
Flow Cell wash 
Flowcell wash kit
(Flow cell wash kit)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-WSH004
Consummables 
Surface decontaminant 
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7010PK
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7002PK
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap
(PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner])		 Greiner 608281
PCR Tube 0.2ml
(PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner])		 Greiner 671201
1000µL Filter Tips (500)
(Stacked 1000µL Filter Tips [500])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11977724
100µL Filter Tips (1000) Thermofisher scientific/Fisher scientific 11947724
10µL Filter Tips (1000)
(Stacked 100µL Filter Tips [1000])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11907724
Reinforced tubes  tubes (2ml)  with screw caps and o-rings
(Fisherbrand™ Bulk tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 15545809
Microcentrifuge tube (1.5ml)
(1.5 ml Eppendorf Tubes [500])		 Eppendorf 1229888
DNA LoBind Tubes  (1.5ml)
(DNA LoBind Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 10051232
Cryobabies labels
Gloves (S/M/L)
Paper towel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupprecht, C. E. Rhabdoviruses: rabies virus. Medical Microbiology. , University of Texas Medical Branch. Galveston, TX. (1996).
  2. Rabies. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/rabies (2023).
  3. Health Organization, W. orld WHO Expert Consultation on Rabies: WHO TRS N°1012. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/WHO-TRS-1012 (2018).
  4. Benavides, J. A., et al. Defining new pathways to manage the ongoing emergence of bat rabies in Latin America. Viruses. 12 (9), 1002 (2020).
  5. Hampson, K. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), e0003709 (2015).
  6. Global genomic surveillance strategy for pathogens with pandemic and epidemic potential, 2022-2032. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/978924004679 (2022).
  7. Tsai, K. J., et al. Emergence of a sylvatic enzootic formosan ferret badger-associated rabies in Taiwan and the geographical separation of two phylogenetic groups of rabies viruses. Veterinary Microbiology. 182, 28-34 (2016).
  8. Chiou, H. -Y., et al. Molecular characterization of cryptically circulating rabies virus from ferret badgers, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 790-798 (2014).
  9. Sabeta, C. T., Mansfield, K. L., McElhinney, L. M., Fooks, A. R., Nel, L. H. Molecular epidemiology of rabies in bat-eared foxes (Otocyon megalotis) in South Africa. Virus Research. 129 (1), 1-10 (2007).
  10. Scott, T. P. Complete genome and molecular epidemiological data infer the maintenance of rabies among kudu (Tragelaphus strepsiceros) in Namibia. PLoS One. 8 (3), e58739 (2013).
  11. Lembo, T., et al. Exploring reservoir dynamics: a case study of rabies in the Serengeti ecosystem. The Journal of Applied Ecology. 45 (4), 1246-1257 (2008).
  12. Coetzee, P., Nel, L. H. Emerging epidemic dog rabies in coastal South Africa: a molecular epidemiological analysis. Virus Research. 126 (1-2), 186-195 (2007).
  13. Ou de Munnink, B. B. First molecular analysis of rabies virus in Qatar and clinical cases imported into Qatar, a case report. International Journal of Infectious Diseases. 96, 323-326 (2020).
  14. Smith, J., et al. Case report: Rapid ante-mortem diagnosis of a human case of rabies imported into the UK from the Philippines. Journal of Medical Virology. 69, 150-155 (2003).
  15. Mahardika, G. N. K., et al. Phylogenetic analysis and victim contact tracing of rabies virus from humans and dogs in Bali, Indonesia. Epidemiology and Infection. 142 (6), 1146-1154 (2014).
  16. Tohma, K., et al. Molecular and mathematical modeling analyses of inter-island transmission of rabies into a previously rabies-free island in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 38, 22-28 (2016).
  17. Tohma, K., et al. Phylogeographic analysis of rabies viruses in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 23, 86-94 (2014).
  18. Saito, M., et al. Genetic diversity and geographic distribution of genetically distinct rabies viruses in the Philippines. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (4), e2144 (2013).
  19. Biek, R., Henderson, J. C., Waller, L. A., Rupprecht, C. E., Real, L. A. A high-resolution genetic signature of demographic and spatial expansion in epizootic rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 7993-7998 (2007).
  20. Reddy, G. B., et al. Molecular characterization of Indian rabies virus isolates by partial sequencing of nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P) genes. Virus Genes. 43, 13-17 (2011).
  21. David, D., Dveres, N., Yakobson, B. A., Davidson, I. Emergence of dog rabies in the northern region of Israel. Epidemiology and Infection. 137 (4), 544-548 (2009).
  22. Benjathummarak, S. Molecular genetic characterization of rabies virus glycoprotein gene sequences from rabid dogs in Bangkok and neighboring provinces in Thailand, 2013-2014. Archives of Virology. 161 (5), 1261-1271 (2016).
  23. Denduangboripant, J., et al. Transmission dynamics of rabies virus in Thailand: implications for disease control. BMC Infectious Diseases. 5, 52 (2005).
  24. Talbi, C., et al. Phylodynamics and human-mediated dispersal of a zoonotic virus. PLoS Pathogens. 6 (10), e1001166 (2010).
  25. Bourhy, H., et al. Revealing the micro-scale signature of endemic zoonotic disease transmission in an African urban setting. PLoS Pathogens. 12 (4), e1005525 (2016).
  26. Zinsstag, J., et al. Vaccination of dogs in an African city interrupts rabies transmission and reduces human exposure. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  27. Yakovleva, A., et al. Tracking SARS-COV-2 variants using Nanopore sequencing in Ukraine in 2021. Scientific Reports. 12, 15749 (2022).
  28. Mannsverk, S., et al. SARS-CoV-2 variants of concern and spike protein mutational dynamics in a Swedish cohort during 2021, studied by Nanopore sequencing. Virology Journal. 19, 164 (2022).
  29. Soufi, M., et al. Fast and easy nanopore sequencing workflow for rapid genetic testing of familial Hypercholesterolemia. Frontiers in Genetics. 13, 836231 (2022).
  30. Cabibbe, A. M. Application of targeted next-generation sequencing assay on a portable sequencing platform for culture-free detection of drug-resistant tuberculosis from clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 00632 (2020).
  31. Xu, Y., et al. Nanopore metagenomic sequencing of influenza virus directly from respiratory samples: diagnosis, drug resistance and nosocomial transmission, United Kingdom, 2018/19 influenza season. Euro Surveillance. 26 (27), 2000004 (2021).
  32. Stubbs, S. C. B., et al. Assessment of a multiplex PCR and Nanopore-based method for dengue virus sequencing in Indonesia. Virology Journal. 17, 24 (2020).
  33. Croville, G., et al. Rapid whole-genome based typing and surveillance of avipoxviruses using nanopore sequencing. Journal of Virological Methods. 261, 34-39 (2018).
  34. Theuns, S., et al. Nanopore sequencing as a revolutionary diagnostic tool for porcine viral enteric disease complexes identifies porcine kobuvirus as an important enteric virus. Scientific Reports. 8, 9830 (2018).
  35. O'Donnell, V. K., et al. Rapid sequence-based characterization of African swine fever virus by use of the Oxford Nanopore MinION sequence sensing device and a companion analysis software tool. Journal of Clinical Microbiology. 58, 01104-01119 (2019).
  36. Brito, A. F. Global disparities in SARS-CoV-2 genomic surveillance. Nature Communications. 13, 7003 (2022).
  37. ONT login/register. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://nanoporetech.com/login-register (2023).
  38. Software Downloads. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://community.nanoporetech.com/downloads (2023).
  39. GitHub. , Available from: https://github.com/ (2023).
  40. Brunker, K. Artic-rabv. , Available from: https://github.com/kirstyn/artic-rabv (2022).
  41. Campbell, K. MADDOG: Method for Assignment, Definition and Designation of Global Lineages. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  42. Campbell, K. RABV-GLUE. Centre for Virus Research. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  43. Itokawa, K., Sekizuka, T., Hashino, M., Tanaka, R., Kuroda, M. Disentangling primer interactions improves SARS-CoV-2 genome sequencing by multiplex tiling PCR. PLoS ONE. 15 (9), e0239403 (2020).
  44. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 818619 (2022).
  45. Döring, M., Pfeifer, N. openPrimeR: Multiplex PCR primer design and analysis. , (2023).
  46. Quick, J. Multiplex PCR method for MiniON and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
  47. Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization. 1, Available from: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/310836/9789241515153-eng.pdf (2018).
  48. Lembo, T. Partners for Rabies Prevention. The blueprint for rabies prevention and control: a novel operational toolkit for rabies elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (2), e1388 (2012).
  49. Terrestrial Manual Online Access. World Organization for Animal Health. , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2023).
  50. Mauti, S. Field postmortem rabies rapid immunochromatographic diagnostic test for resource-limited settings with further molecular applications. Journal of Visualized Experiments. (160), e60008 (2020).
  51. Patrick, E., et al. Enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test. Journal of Visualized Experiments. (146), e59416 (2019).
  52. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  53. Marston, D. A., et al. Pan-lyssavirus real time RT-PCR for rabies diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (149), e59709 (2019).
  54. Brunker, K. DNA quantification using the Qubit fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-qubit-fluorometer-bc6vize6 (2020).
  55. Quick, J. DNA quantification using the Quantus fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-quantus-fluorometer-7pzhmp6 (2020).
  56. Guppy protocol. Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revaq_14dec2018 (2023).
  57. Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004). Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/flow-cell-wash-kit-exp-wsh004/v/wfc_9120_v1_revh_08dec2020 (2023).
  58. Core Pipeline - arctic pipeline. , Available from: https://artic.readthedocs.io/en/latest/minion/ (2023).
  59. Samtools. , Available from: https://www.htslib.org (2023).
  60. Campbell, K., et al. Making genomic surveillance deliver: A lineage classification and nomenclature system to inform rabies elimination. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010023 (2022).
  61. Brunker, K., et al. Rapid in-country sequencing of whole virus genomes to inform rabies elimination programmes. Wellcome Open Research. 5, 3 (2020).
  62. Bull, R. A., et al. Analytical validity of nanopore sequencing for rapid SARS-CoV-2 genome analysis. Nature Communications. 11, 6272 (2020).
  63. Okeke, I. N., Ihekweazu, C. The importance of molecular diagnostics for infectious diseases in low-resource settings. Nature Reviews. Microbiology. 19 (9), 547-548 (2021).
  64. Inzaule, S. C., Tessema, S. K., Kebede, Y., Ouma, A. E. O., Nkengasong, J. N. Genomic-informed pathogen surveillance in Africa: opportunities and challenges. The Lancet Infectious Diseases. 21 (9), 281-289 (2021).
  65. Kennedy, L. Integrating contact tracing and whole-genome sequencing to track the elimination of dog-mediated rabies: an observational and genomic study. eLife. , (2023).
  66. Pallerla, S. R. Diagnosis of pathogens causing bacterial meningitis using Nanopore sequencing in a resource-limited setting. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 21, 39 (2022).
  67. Quick, J. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).

Tags

Helgenomsekvensering rask karakterisering rabiesvirus nanoporeteknologi genomiske data overføringssporing geografisk spredning smittsomme sykdommer lav- og mellominntektsland (LMICs) hundemedierte rabies vampyrflaggermus folkehelse økonomiske bekymringer arbeidsflyt fra prøve til sekvens til tolkning nanoporeteknologi prøveinnsamling rabiesdiagnose arbeidsflyt for helgenomsekvensering primerdesign og optimalisering multiplex polymerasekjedereaksjon (PCR) sekvensering Bibliotekforberedelse live og offline baseanrop genetisk avstamningsbetegnelse fylogenetisk analyse implementering av arbeidsflyt rørledningsvalidering negative kontroller genomiske verktøy (GLUE MADDOG) regionale og globale fylogenier
Helgenomsekvensering for rask karakterisering av rabiesvirus ved hjelp av nanoporeteknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bautista, C., Jaswant, G., French,… More

Bautista, C., Jaswant, G., French, H., Campbell, K., Durrant, R., Gifford, R., Kia, G. S. N., Ogoti, B., Hampson, K., Brunker, K. Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology. J. Vis. Exp. (198), e65414, doi:10.3791/65414 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter