Summary
Dit protocol presenteert de opzet en werking van een nieuw ontwikkelde, 3D-geprinte bioreactor voor de ex vivo kweek van bloedvaten in perfusie. Het systeem is ontworpen om gemakkelijk door andere gebruikers te worden overgenomen, praktisch, betaalbaar en aanpasbaar aan verschillende experimentele toepassingen, zoals basisbiologie en farmacologische studies.
Abstract
Vaatziekten vormen de basis van de meeste hart- en vaatziekten (HVZ), die wereldwijd de belangrijkste oorzaak van sterfte en morbiditeit blijven. Effectieve chirurgische en farmacologische ingrepen om vaatziekten te voorkomen en te behandelen zijn dringend nodig. Voor een deel beperkt het tekort aan translationele modellen het begrip van de cellulaire en moleculaire processen die betrokken zijn bij vaatziekten. Ex vivo perfusiekweekbioreactoren bieden een ideaal platform voor de studie van grote dierlijke vaten (inclusief mensen) in een gecontroleerde dynamische omgeving, waarbij het gemak van in-vitrokweek en de complexiteit van het levende weefsel worden gecombineerd. De meeste bioreactoren worden echter op maat gemaakt en zijn daarom moeilijk te gebruiken, waardoor de reproduceerbaarheid van de resultaten wordt beperkt. Dit artikel presenteert een 3D-geprint systeem dat gemakkelijk kan worden geproduceerd en toegepast in elk biologisch laboratorium, en biedt een gedetailleerd protocol voor de installatie ervan, waardoor gebruikers kunnen werken. Dit innovatieve en reproduceerbare ex vivo perfusiekweeksysteem maakt het mogelijk om bloedvaten tot 7 dagen in fysiologische omstandigheden te kweken. We verwachten dat het gebruik van een gestandaardiseerde perfusiebioreactor een beter begrip van fysiologische en pathologische processen in grote bloedvaten van dieren zal ondersteunen en de ontdekking van nieuwe therapieën zal versnellen.
Introduction
De vaatwand bevindt zich in een reactieve steady-state, die zorgt voor zowel responsiviteiten op externe stimuli (d.w.z. verandering van druk, vasoconstrictoren) als een consistent niet-activerend oppervlak dat bloedstolling en infiltratie van ontstekingscellen voorkomt. Als reactie op verouderings- en levensstijlafhankelijke stimuli en bij directe schade, activeert de vaatwand remodelleringsprocessen zoals restenose en atherosclerose, waarvan bekend is dat ze bijdragen aan veel voorkomende hart- en vaatziekten (HVZ's), zoals ischemische beroerte en myocardinfarct. Hoewel interventionele benaderingen zoals percutane revascularisatie en stenting beschikbaar zijn om gevorderde manifestaties van vaatziekten aan te pakken, is bekend dat deze verdere vasculaire schade veroorzaken, wat vaak tot herhaling leidt. Bovendien zijn er slechts beperkte preventieve en vroegtijdige oplossingen beschikbaar. Het begrijpen van de mechanismen die de homeostase van de vaatwand in stand houden en de disfunctie ervan aansturen, vormt de kern van het ontwikkelen van nieuwe behandelingen3.
Ondanks de constante ontwikkeling en vooruitgang in de moleculaire biologie en weefselmanipulatie, blijven dierstudies een cruciaal onderdeel van vasculaire biologiestudies. In vivo dierstudies hebben enorm veel inzicht gegeven in de mechanismen van vasculaire homeostase en pathologie; Deze procedures zijn echter duur, hebben een relatief lage doorvoer en brengen aanzienlijke ethische problemen met zich mee. Bovendien zijn kleine dieren slecht representatief voor de menselijke vasculaire fysiologie, en grotere dierproeven zijn veel duurder en creëren verdere ethische overwegingen 4,5. Met de toenemende vraag naar farmaceutische en medische oplossingen voor een snel vergrijzende bevolking, worden de nadelen van diergebruik uitvergroot, wat van invloed is op de reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en overdraagbaarheid van resultaten naar patiëntenzorg6.
In-vitrosystemen bieden een vereenvoudigd platform om basismechanismen te bestuderen, maar slagen er niet in om de complexiteit van het hele weefsel, de interacties tussen cellen en de extracellulaire matrix en de mechanische krachten te recapituleren, die cruciale determinanten zijn bij de ontwikkeling van vaatziekten7.
Ex-vivo-onderzoeken die worden uitgevoerd op hele weefsels die in kunstmatig gecontroleerde omgevingen worden bewaard, bootsen de in vivo complexiteit na en maken onderzoeken met een relatief hoge doorvoer mogelijk8. Gezien het vermogen om de kweekomstandigheden en -omgeving nauwlettend te controleren, maken ex vivo-modellen een breed scala aan complexe studies mogelijk en bieden ze een geschikt alternatief om het gebruik van dierproeven in de vasculaire biologie te verminderen. Statische vasculaire ringculturen boden interessante inzichten, maar slaagden er niet in om het cruciale hemodynamische element9 op te nemen. De studie van het vasculaire systeem ex vivo brengt inderdaad specifieke uitdagingen met zich mee die verband houden met de vele dynamische krachten die van toepassing zijn op de cellen in de bloedvatwand. Stimuli zoals luminale stroming, turbulentie, schuifspanning, druk en wandvervorming hebben een aanzienlijke invloed op de pathofysiologie van het weefsel10,11,12.
Perfusiebioreactoren zijn essentieel voor het bestuderen van vasculaire homeostase en remodellering als reactie op letsel of hemodynamische veranderingen13. Bovendien kan perfusiecultuur worden gebruikt om de rijping en duurzaamheid van weefselgemanipuleerde bloedvaten (TEBV's) te verbeteren, waardoor geschikte alternatieven voor vasculaire transplantaten worden geboden14.
In de handel verkrijgbare perfusiebioreactoren zijn beperkt in flexibiliteit en aanpassingsvermogen en zijn duur. Veel van de bestaande in-house ontwikkelde bioreactoren zijn in plaats daarvan moeilijk te repliceren in andere laboratoria, vanwege de beperkte beschrijvingen en het niet beschikbaar zijn van speciaal gemaakte componenten 7,8,9,10,11,12. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we onlangs een nieuwe bioreactor (EasyFlow) ontwikkeld, die economisch te produceren is, een reeks weefsels kan herbergen en relatief eenvoudige aanpassingen mogelijk maakt om zich aan te passen aan verschillende onderzoekseisen13. Het inzetstuk is 3D-geprint en past als in een deksel van een standaard centrifugebuisje van 50 ml. Het modulaire ontwerp en de productie van 3D-printen maken het toegankelijk en reproduceerbaar in verschillende laboratoria, en gemakkelijk aanpasbaar om aan te passen aan verschillende wetenschappelijke behoeften. Dit protocol beschrijft de assemblage en basiswerking van het bioreactorsysteem in een arteriële perfusieomgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol beschrijft de assemblage en het gebruik van een systeem dat bestaat uit twee EasyFlow (bioreactor) inserts: één die de reactiekamer (C) vertegenwoordigt, die het geperfuseerde slagadermonster bevat, en één die functioneert als een medium reservoir (R) (Figuur 1 en Figuur 2A). Halsslagaders werden verkregen van 4-6 weken oude mannelijke en vrouwelijke biggen (6-12 kg) in het Pirbright Institute, VK. Dierproeven werden uitgevoerd onder de Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) (ASPA) en goedgekeurd door de Animal Welfare and Ethical Review Board (AWERB) van het Pirbright Institute. De dieren werden gehuisvest in overeenstemming met de gedragscode voor de huisvesting en verzorging van gefokte dieren. Alle procedures werden uitgevoerd door houders van een persoonlijke licentie die waren opgeleid en bekwaam onder projectlicentie PPL70/8852. Biggen werden geruimd volgens de schema één-methode onder de ASPA.
1. Productie van tussenvoegsels
- Fabriceer het inzetstuk door middel van 3D-printen, met behulp van het meegeleverde 3D-model (aanvullend bestand 1).
OPMERKING: 3D-modellering maakt eenvoudige wijzigingen in het ontwerp mogelijk om zich aan te passen aan nieuwe toepassingen. Alternatieve materialen en alternatieve productietechnieken kunnen ook worden gebruikt om de insert te produceren. Vanwege de complexe inwendige structuur zijn selectief lasersinteren en stereolithografie geschikte alternatieven15. Polyamide 12 (PA12; zie Materiaaltabel) is een goede materiaalkandidaat vanwege de superieure prestaties op het gebied van vloeistofretentie en weerstand tegen herhaalde hittesterilisatiecycli16. - Fabriceer de siliconen pakkingen en polycarbonaat ringen door lasersnijden17, met behulp van de ontwerpen in aanvullend bestand 2.
OPMERKING: Lasersnijden is gemakkelijk uit te besteden en een goedkope productiemethode. Ringen kunnen worden vervaardigd uit roestvrij staal, waardoor een resistenter onderdeel ontstaat voor herhaald gebruik. Alle andere componenten zijn in de handel verkrijgbare artikelen. Een volledige lijst van de benodigde materialen is te vinden in tabel 1. De commerciële details van de artikelen zijn opgenomen in de Materiaaltabel.
2. Sterilisatie, assemblage en priming van het apparaat
- Steriliseer alle componenten volgens de instructies in tabel 1.
- Monteer onder laminaire stromingsomstandigheden twee gefabriceerde inzetstukken (stap 1), zoals weergegeven in figuur 1A.
- Monteer het perfusiesysteem zoals in afbeelding 2 en volg de onderstaande stappen:
- Bevestig twee aangesloten driewegkleppen aan de R1-poort van het reservoir (media-uitwisselingspoort).
- Sluit de resulterende uitlaat aan op de kop van de peristaltische pomp met behulp van een buis die is uitgerust met een eenrichtingsklep (eenrichtingsventielbuis).
- Sluit de pompkop aan op de C4-poort van de reactiekamer met behulp van systeemslangen die zijn uitgerust met een eenrichtingsklep.
OPMERKING: Deze aftakking kan optioneel worden uitgerust met een druksensor die een constante bewaking mogelijk maakt. - Sluit de poort van de reactiekamer C1 aan op de softwall-buizen, en dit op het weerstandskanaal (kleine binnendiameter).
NOTITIE: De lengte van de weerstandsslang heeft een grote invloed op de druk die in het systeem aanwezig is. Dit moet verder worden onderzocht om adequate perfusieomstandigheden te garanderen. - Verleng het weerstandskanaal met de systeemslang, creëer een retourkanaal en sluit de luminale circulatielus door deze aan te sluiten op het reservoir op R5 (Figuur 2C).
- Creëer een overloopkanaal door de reactiekamer C3 aan te sluiten op het reservoir R3 met systeemslang.
- Bevestig een ventilatiefilter via R2.
- Creëer een drukdemper door een spuit met lucht en media aan te sluiten op de reactiekamer C6.
NOTITIE: De juiste lucht-mediaverhouding is afhankelijk van de vereiste drukdemping.
- Vul het systeem met perfusiemedium (Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium [DMEM] + 10% [v/v] foetaal runderserum [FBS] + 1% [v/v] penicilline-streptomycine + 1% [v/v] amfotericine B + 30% [v/v] dextran; zie Materiaaltabel) via de media-uitwisselingspoorten en het reservoir.
NOTITIE: Het vullen van het systeem vermindert het risico op ingesloten luchtbellen in het systeem en identificeert mogelijke lekken. Het aanbevolen volume media is ongeveer 100-120 ml. Het gebruikte volume is afhankelijk van het dode volume van de slang die voor experimenten wordt gebruikt.
3. Monsteroogst en -voorbereiding
- Verzamel de linker en rechter gemeenschappelijke halsslagaders, waardoor directe hantering van het arteriële weefsel tot een minimum wordt beperkt13.
- Plaats het weefsel in koude transportmedia (DMEM + 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] penicilline-streptomycine + 1% [v/v] amfotericine B, zie materiaaltabel) voor overdracht.
- Verwijder in een laminaire flowkast het overtollige bindweefsel en knip de uiteinden van het weefsel af met een scalpelmesje. Was het zakdoekje twee keer in koude transportmiddelen.
- Plaats het weefsel gedurende ten minste 30 minuten op een orbitale shaker in transportmedia om grondig te wassen.
- Verbind een niet-vertakkend segment van de slagader met het bioreactorsysteem met behulp van twee luer-connectoren met weerhaken en bevestig het op zijn plaats met behulp van een vaatverbinding (vasculaire siliconenbanden; Tabel 1).
NOTITIE: De vaatverbinding zorgt voor de juiste spanning en terugtrekking om het vat vast te zetten. Het ovale gedeelte voorkomt weefselbeschadiging. - Laat het medium voorzichtig door de slagader stromen om de doorgankelijkheid te verifiëren.
- Nadat de slagader aan het gefabriceerde inzetstuk is bevestigd, vult u de reactieruimte met perfusiemedia (stap 2.4). Vul ten slotte de luminale circulatielus voorzichtig met media om eventuele resterende lucht uit het systeem te verwijderen.
- Sluit de reactieruimte aan op het eerder gemonteerde perfusiesysteem (sectie 2) en voltooi de circulatie.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een kwaliteitscontrole uit te voeren door middel van immunohistochemie van bewerkt weefsel. Dit identificeert eventuele schade als gevolg van overmatige behandeling tijdens de bereiding.
4. Perfusiecultuur en mediaverandering
- Plaats het perfusiesysteem in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en sluit het vervolgens aan op een slangenpomp (zie materiaaltabel)
- Sluit eventuele aanvullende (facultatieve) acquisitiesystemen aan, zoals druksensoren (zie Materiaaltabel).
- Laat het systeem een nacht in evenwicht komen met een laag mediadebiet van ~10-15 ml/min.
NOTITIE: De eerste experimenten om de pompinstellingen, de mediastroom, de systeemdruk en de optimale instellingen van de drukdempers/klemmen te bepalen, zijn vereist om ervoor te zorgen dat aan de juiste voorwaarden wordt voldaan. - Verhoog de volgende dag het debiet stapsgewijs (+1 tpm per uur, gelijk aan een toename van ~2,5 ml/min per uur, in het huidige systeem) totdat het uiteindelijke debiet (35 ml/min) is bereikt. Controleer het systeem regelmatig op lekken.
NOTITIE: Om het nauwkeurige debiet te berekenen op basis van de peristaltische pompsnelheid, moeten gebruikers eerst een adequate pompkalibratie uitvoeren18. Met behulp van de formule (1) kan het volumedebiet (Q) worden berekend op basis van het afgegeven volume (V) binnen een bepaalde tijd (t). Om de geschatte stroomsnelheid () te berekenen, kunnen we gebruik maken van het eerder berekende debiet (Q) en de oppervlakte van de doorsnede van het vat (A), beschreven in vergelijking (
2).
(1)
(2) - Vervang elke 3 dagen 50% van het medium (~50 ml) door een spuit gevuld met vers medium aan te sluiten op de media-uitwisselingspoort dichter bij de pomp en een lege spuit op de poort dichter bij het reservoir om het verbruikte medium op te vangen (Figuur 2).
NOTITIE: Het gebruik van twee driewegkleppen als media-uitwisselingspoorten vergemakkelijkt de continue werking van de perfusie tijdens de mediumuitwisseling. - Oogst aan het einde van het experiment het weefsel uit de reactiekamer door de uiteinden die op de bioreactor zijn aangesloten af te knippen met een steriele chirurgische schaar.
- Demonteer, reinig en steriliseer het systeem voor verder gebruik.
2).
(1)
(2)5. Analyse van monsters
- Fixeer het geoogste monster een nacht in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C.
- Veranker het weefsel in een optimale snijtemperatuur (OCT; zie materiaaltabel)19 en vries het in door onderdompeling in iso-pentaan gekoeld in vloeibare stikstof.
- Verkrijg cryosecties van 3-5 mm dikte met behulp van een cryostaat.
- Voer immunohistochemie (hematoxyline en eosine [H&E]) en/of immunofluorescentie uit. Volg het typische immunofluorescentieprotocol:
- Blokkeer de plakjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 20% [v/v] geitenserum in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; zie materiaaltabel).
- Incubeer de plakken een nacht bij 4 °C met primair konijnenantilichaam tegen CD31 verdund 1:50 in PBS (zie materiaaltabel).
- Was drie keer met PBS gedurende 5 min.
- Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met fluorescerend gelabeld secundair anti-konijn geit-antilichaam verdund 1:200 in PBS en α-gladde spieractine (SMA) direct geconjugeerd fluorescerend antilichaam verdund 1:200 in PBS (zie materiaaltabel).
- Was drie keer met PBS gedurende 5 min.
- Kleurs de kernen met DAPI verdund 1:1.000 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer met 0,1% (g/v) Sudan Black (zie materiaaltabel) in 70% (v/v) ethanol gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om autofluorescentie van het weefsel te verminderen.
- Was het weefsel met overvloedig gedeïoniseerd water. Monteer de geleiders in het montagemedium.
- Breng de monsters in beeld met een confocale laserscanmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze studie heeft geleid tot een veelzijdig en betaalbaar perfusiesysteem (EasyFlow)13. Het 3D-geprinte ontwerp van het systeem vergemakkelijkt de adoptie van het systeem door andere laboratoria en bevordert daardoor de reproduceerbaarheid.
Het gefabriceerde perfusie-inzetstuk is ondergebracht in een centrifugebuis van 50 ml, waardoor een geïsoleerde omgeving ontstaat. Met behulp van twee perfusie-inzetstukken kan een perfusielus tot stand worden gebracht met daarin een reservoir en een reactiekamer, waar het biologische monster wordt geïncubeerd. Het perfusiesysteem wordt vervolgens aangesloten op een peristaltische pomp en optionele acquisitiesystemen, zoals druksensoren en ultrasone apparaten, om de kweekomstandigheden te bewaken (Figuur 2).
Monsters van de halsslagader van varkens werden verzameld en verwerkt voordat ze gedurende 7 dagen in perfusie werden gekweekt. Om de kwaliteit van het weefsel vóór de kweek te waarborgen, werden voorbereidende experimenten uitgevoerd waarbij de monsters werden gefixeerd op het moment van excisie, na weefselvoorbereiding en na perfusie. Fluorescerende kleuring voor endotheliale (CD31) en gladde spier (αSMA) markers werd gebruikt om het behoud van de weefselintegriteit te beoordelen. Ter vergelijking worden in figuur 3 voorbeelden gegeven van goed geconserveerde en beschadigde weefsels. De beelden tonen het belang aan van een voorzichtige behandeling van het weefsel op het moment van excisie, aangezien onjuiste verwerking (overmatige rek, verbrijzeling, enz.) kan leiden tot verlies van het endotheel vóór de kweek. De resultaten tonen ook het belang aan van de geleidelijke totstandbrenging van perfusie om luminale schade te voorkomen.
H&E-kleuring werd uitgevoerd naast immunofluorescentie (IF)-kleuring om het behoud van de morfologie en de algehele verdeling van de cellen in de vaatwand na 7 dagen kweek aan te tonen (Figuur 4). De toepassing van fysiologische kweekomstandigheden in het apparaat zorgt voor behoud van de endotheeldekking van het lumen, uitlijning van de gladde spiercellen in de media en behoud van de vasa vasorum in de adventitia.
Het compacte en modulaire ontwerp van het bioreactorsysteem maakt ook een breed scala aan systeemopstellingen mogelijk. De kleinere opstelling bestaat uit een enkele bioreactor en is ideaal voor farmacologische onderzoeken en onderzoeken met een laag volume (recirculerende perfusie20, totaal volume van 50-70 ml). Om de kweekduur te verlengen en het aantal mediawisselingen te verminderen, is een circulatiesysteem met één reservoir, zoals beschreven in dit protocol, of een constant toevoersysteem idealer, omdat ze een groter volume medium in omloop hebben. Er kan een opstelling met dubbele circulatie21 worden opgezet om experimentele omgevingen te verkennen waar de lokalisatie van de stimuli van cruciaal belang is. Het huidige apparaat kan ook worden gecombineerd met meer geavanceerde regelsystemen om een nauwkeurige feedbackregeling van parameters zoals pH en opgeloste zuurstof mogelijk te maken (afbeelding 5).
Figuur 1: EasyFlow-montageschema's. (A) 3D-gerenderde schema's die helpen bij de montage van het perfusie-inzetstuk. (B) Er worden gedetailleerde schema's verstrekt om de montage van de verbindingsplaatsen te vergemakkelijken. (C) Een dwarsdoorsnede van de reactieruimte belicht de essentiële componenten van de EasyFlow-inlegplaat en de verbinding van het weefsel met de wisselplaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische weergave van de samenstelling van het perfusiesysteem. (A) Geassembleerd perfusiesysteem dat alle belangrijke componenten bevat, met vermelding van hun relatieve positie in een 3D-gerenderde omgeving. Niet alle componenten zijn op schaal. (B) Individuele isometrische weergaven van componenten worden ook gepresenteerd. (C) Een bovenaanzicht van het geassembleerde perfusiesysteem wordt getoond om de montage en verbinding van de verschillende componenten te vergemakkelijken. De poorten zijn tegen de klok in gelabeld en genummerd om door de verschillende verbindingsplaatsen in het perfusiesysteem te navigeren. Dit principe is toegepast op het reservoir (R) en de reactiekamer (C). De verschillende kanalen die de twee kamers met elkaar verbinden, hebben ook namen gekregen ter referentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Weefselonderhoud tijdens de verwerking. (A) Confocale beelden tonen de normale structuur van een slagader op het moment van oogsten, (B) na reiniging en verwerking, en (C) na perfusiekweek, wat het behoud van een goed bewaarde morfologie aantoont. (D) Voorbeelden van beschadigd weefsel als gevolg van overmatige of onjuiste behandeling tijdens de verwerking of (E) als gevolg van de toepassing van niet-fysiologische kweekomstandigheden (d.w.z. abrupte initiatie van hoge stroom) tonen uitputting van de luminale dekking en verstoring van de media. (F) Negatieve controle geeft de specificiteit van de kleuring aan. CD31: groen; αSMA: rood; DAPI: blauw. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histologische evaluatie van weefsel voor en na perfusiekweek. (A en B) Arteriële weefsel werd geëvalueerd door middel van histologie op het moment van oogst en (C en D) na 7 dagen kweek met het bioreactorsysteem. (A en C) H&E-kleuring onthult behoud van de structuur en organisatie van de arteriële wand. (B en D) Immunofluorescentiekleuring van hetzelfde weefsel wijst op endotheeldekking, uitlijning van gladde spiercellen en vasa vasorum in de adventitia. CD31: groen; SMA: rood; DAPI: blauw. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Schematische weergave van mogelijke perfusie-opstellingen. Verschillende alternatieve opstellingen kunnen worden ondergebracht met het perfusie-inzetstuk om verschillende experimentele onderzoeken mogelijk te maken. (A) De recirculerende perfusie-opstelling minimaliseert het benodigde volume van het medium. (B) De constante voedingsopstelling zorgt voor een constante toevoer van medium naar het weefsel. (C) Circulatie met één reservoir (zoals beschreven in dit artikel) biedt een groter volume media voor langdurige incubaties en omvat een bufferzone voor luchtverversing en drukevenwicht. (D) De opstelling met dubbele circulatie biedt twee verschillende lussen die de binnenste (in de slagader) en buitenste (reactieruimte) circulaties onafhankelijk van elkaar voeden. (E) De dynamische perfusie-opstelling omvat continue gassen en pH-regeling door een proportionele-integraal-afgeleide (PID) regelaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Onderdelen voor het vervaardigen van de inzetstukken. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend bestand 1: 3D-model van de EasyFlow-insert voor de productie van 3D-printen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Ontwerpschema's van het geconstrueerde apparaat, doorsnedeweergave, afdruk en afdichtingscomponenten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo vasculaire perfusiesystemen vormen een uniek platform om de functie en het gedrag van vasculaire cellen in hun oorspronkelijke weefsels onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen, wat de ontleding van complexe processen mogelijk maakt, zoals vasculaire remodellering na een verwonding22. De meeste gerapporteerde bioreactoren zijn echter in eigen huis gemaakte systemen op basis van op maat gemaakte componenten en zijn vaak moeilijk te repliceren door andere23. Er bestaan alternatieve commerciële oplossingen, maar deze zijn niet flexibel in het ontwerp en kunnen relatief duur zijn24.
We hebben een alternatief systeem ontwikkeld dat een eenvoudig, goedkoop en reproduceerbaar platform biedt dat kan worden vervaardigd met behulp van open-source 3D-printtechnieken13. In dit artikel wordt beschreven hoe het systeem is ingesteld om reproduceerbare toepassingen door eindgebruikers mogelijk te maken. Deze opstelling maakt de toepassing mogelijk van fysiologische en pathologische omstandigheden van druk (40-180 mmHg), stroomsnelheid (6-30 ml/min) en in combinatie met media die de viscositeit van het bloed nabootsen, met verschillende gradaties van schuifspanning.
Reproduceerbaarheid is een essentieel aspect van het wetenschappelijke proces, omdat het onderzoekers in staat stelt de bevindingen van anderen te valideren en erop voort te bouwen om ons begrip van vaatziekten te vergroten. Bovendien zijn instrumenten die samenwerking tussen groepen mogelijk maken en bevorderen essentieel voor het bevorderen van wetenschappelijke kennis. EasyFlow is een voorbeeld van dergelijke open-source, toegankelijke oplossingen die gemakkelijk kunnen worden geproduceerd en toegepast door laboratoria die werken aan een breed scala aan projecten op het gebied van vasculaire wetenschappen en daarbuiten.
We melden dat deze apparaatkweek de levensvatbaarheid van het arteriële weefsel gedurende ten minste 7 dagen behoudt en kan worden gebruikt om specifieke stappen van vaatziekten te modelleren. Aan de hand hiervan zou men fysiologische stroomsnelheden en drukcondities kunnen modelleren13. Belangrijk is dat deze perfusiecultuur kosteneffectief is vanwege de lage productiekosten en het lage volume medium dat nodig is om het systeem te laten werken.
Het 3D-ontwerp kan ook worden aangepast aan nieuwe toepassingen en nieuwe materialen voor het printen kunnen worden getest. Zelfs in het huidige formaat kan de ruimte voor het onderbrengen van monsters eenvoudig worden aangepast aan monsters van verschillende afmetingen door de lengte van de fittingen of de boring van de luer-connectoren te veranderen. Het is belangrijk op te merken dat, gezien het modulaire karakter van het apparaat en de kleine afmetingen, deze bioreactor in verschillende opstellingen kan worden gebruikt (Figuur 5) en kan worden toegepast op multiplexculturen, waar verschillende monsters tegelijkertijd in afzonderlijke bioreactoren aan verschillende omstandigheden kunnen worden blootgesteld.
Het is de bedoeling dat het gebruik van het systeem in de toekomst wordt uitgebreid om de kweek van bloedvaten van verschillende oorsprong (bijv. verschillende soorten) en van verschillende aard (bijv. aderen, lymfatische) te ondersteunen, en misschien wordt toegepast op de kweek van andere holle weefsels (bijv. luchtpijp, darm). In het bijzonder toont onderzoek aan dat het kweken van weefsel-gemanipuleerde steigers in constante perfusie de homogene verdeling van cellen binnen het construct en de rijping van het resulterende weefsel helpt25,26. Bovendien draagt het zaaien van vasculaire transplantaten in perfusie bij aan het bereiken van een meer uniform gecellulariseerd vasculair lumen, in vergelijking met statische methoden27. Om deze reden stellen we ons voor dat het systeem wordt toegepast op weefselmanipulatie om de huidige uitdagingen aan te pakken, waardoor de toekomstige ontwikkeling van reproduceerbare synthetische bloedvatvervangers mogelijkwordt28.
Het hier beschreven protocol presenteert enkele belangrijke stappen die cruciaal zijn voor het succes van de flowcultuur. Het vaststellen en bewaken van de juiste stromingscondities is niet triviaal en moet op elk systeem worden uitgevoerd wanneer het voor de eerste keer wordt opgezet, om ervoor te zorgen dat de kweekomstandigheden fysiologisch zijn. Het debiet en de druk werden bewaakt met behulp van druksensoren en echografie. Een ander cruciaal punt is ervoor te zorgen dat het weefsel levensvatbaar en intact is aan het begin van de kweek. Dit vereist een nieuwe bron, een zorgvuldige behandeling en kan worden geverifieerd door histologische analyse. Bovendien moet aan het begin van elk experiment probleemoplossing worden uitgevoerd om mogelijke bacteriële besmetting of bron van medialekkage te identificeren.
Het is belangrijk om te benadrukken dat het beschreven perfusiesysteem, hoewel het fysiologische druk- en stromingsomstandigheden biedt, niet in staat is om de complexe drukgolfpatronen die in vivo zijn geregistreerd, volledig na te bootsen. Deze beperking is toe te schrijven aan het gebruik van een peristaltische pomp en kan worden opgelost met behulp van meer gespecialiseerde apparatuur om geavanceerde hemodynamische aandoeningen te reproduceren. De kweek van bloedvaten in een bioreactor is ook niet in staat om studies aan te pakken waarbij het immuunsysteem of de interactie met andere organen van cruciaal belang is.
Concluderend wordt een eenvoudig 3D-geprint perfusiesysteem gepresenteerd dat de fysiologische hemodynamische omgeving kan nabootsen, wat naar verwachting zal bijdragen aan de standaardisatie van ex vivo bloedvatculturen. Het potentieel voor maatwerk en toepassing op langdurige cultuur maakt het een essentieel hulpmiddel voor het bevorderen van het begrip van deze complexe biologische systemen in fysiologie en pathologische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs willen het Veterinary Pathology Centre van de University of Surrey School of Veterinary Medicine bedanken voor histologiediensten. We danken ook Drs. L. Dixon, A. Reis en M. Henstock van The Pirbright Institute (Pirbright, VK) voor hun steun bij het verkrijgen van de dierlijke weefsels, en het Department of Biochemical Sciences van de University of Surrey, in het bijzonder het technische team, voor hun voortdurende steun. RSM werd ondersteund door de Doctoral College studentship award (University of Surrey), DM en PC werden ondersteund door het National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research (subsidienummers: NC/R001006/1 en NC/T001216/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasyFlow | - | - | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 - 3D printing | Protolabs | - | - |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt - 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | - | - | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , Elsevier. (2017).
- McKeen, L. W. Chapter 6 - Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). McKeen, L. W. , William Andrew Publishing. 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. Computer Methods in Chemical Engineering. , CRC Press. (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
