Summary
Denne protokollen presenterer oppsett og drift av en nyutviklet, 3D-trykt bioreaktor for ex vivo-kulturen av blodkar i perfusjon. Systemet er designet for å være enkelt adoptert av andre brukere, praktisk, rimelig og tilpasningsdyktig til ulike eksperimentelle applikasjoner, for eksempel grunnleggende biologi og farmakologiske studier.
Abstract
Vaskulær sykdom danner grunnlaget for de fleste kardiovaskulære sykdommer (CVD), som fortsatt er den primære årsaken til dødelighet og sykelighet over hele verden. Effektive kirurgiske og farmakologiske inngrep for å forebygge og behandle vaskulær sykdom er presserende. Til dels begrenser mangelen på translasjonsmodeller forståelsen av de cellulære og molekylære prosessene som er involvert i vaskulær sykdom. Ex vivo perfusjonskulturbioreaktorer gir en ideell plattform for studier av store dyrekar (inkludert mennesker) i et kontrollert dynamisk miljø, som kombinerer den enkle in vitro-kulturen og kompleksiteten til det levende vevet. De fleste bioreaktorer er imidlertid spesialprodusert og derfor vanskelige å adoptere, noe som begrenser reproduserbarheten av resultatene. Dette papiret presenterer et 3D-trykt system som enkelt kan produseres og brukes i ethvert biologisk laboratorium, og gir en detaljert protokoll for oppsettet, slik at brukerne kan operere. Dette innovative og reproduserbare ex vivo perfusjonskultursystemet muliggjør dyrkning av blodkar i opptil 7 dager under fysiologiske forhold. Vi forventer at å ta i bruk en standardisert perfusjonsbioreaktor vil støtte en bedre forståelse av fysiologiske og patologiske prosesser i store dyreblodkar og akselerere oppdagelsen av nye terapier.
Introduction
Karveggen eksisterer i en reaktiv steady state, som sikrer både responsiviteter til ytre stimuli (dvs. endring av trykk, vasokonstriktorer) og en konsistent ikke-aktiverende overflate som forhindrer blodkoagulasjon og inflammatorisk celleinfiltrasjon1. Som respons på aldrings- og livsstilsavhengige stimuli og ved direkte skade aktiverer vaskulærveggen remodelleringsprosesser som restenose og aterosklerose, som er kjente bidragsytere til vanlige kardiovaskulære sykdommer (CVD), som iskemisk hjerneslag og hjerteinfarkt2. Mens intervensjonelle tilnærminger som perkutan revaskularisering og stenting er tilgjengelige for å takle avanserte manifestasjoner av vaskulær sykdom, er disse kjent for å provosere ytterligere vaskulær skade, noe som ofte fører til tilbakefall. I tillegg er det bare begrensede forebyggende og tidlige løsninger tilgjengelig. Å forstå mekanismene som opprettholder vaskulær vegghomeostase og driver dysfunksjonen er kjernen i å utvikle nye botemidler3.
Til tross for den konstante utviklingen og fremskrittene innen molekylærbiologi og vevsteknikk, forblir dyreforsøk en avgjørende komponent i vaskulære biologiske studier. In vivo dyreforsøk har gitt enorm innsikt i mekanismene bak vaskulær homeostase og patologi; Imidlertid er disse prosedyrene kostbare, har relativt lav gjennomstrømning og utgjør betydelige etiske problemer. I tillegg er små dyr dårlig representative for human vaskulær fysiologi, og større dyreforsøk er langt dyrere og skaper ytterligere etiske hensyn 4,5. Med den økende etterspørselen etter farmasøytiske og medisinske løsninger for en raskt aldrende befolkning, blir ulempene ved bruk av dyr forstørret, noe som påvirker reproduserbarheten, påliteligheten og overførbarheten av resultatene til pasientbehandling6.
In vitro-systemer tilbyr en forenklet plattform for å studere grunnleggende mekanismer, men unnlater å rekapitulere kompleksiteten til hele vevet, samspillet mellom celler og den ekstracellulære matrisen og de mekaniske kreftene, som er kritiske determinanter i utviklingen av vaskulære sykdommer7.
Ex vivo-studier utført på hele vev opprettholdt i kunstig kontrollerte miljøer etterligner in vivo-kompleksiteten samtidig som det muliggjør relativt høy gjennomstrømningsundersøkelse8. Gitt evnen til å nøye kontrollere kulturforholdene og miljøet, tillater ex vivo-modeller et bredt spekter av komplekse studier og gir et egnet alternativ for å redusere bruken av dyreprosedyrer i vaskulær biologi. Statiske vaskulære ringkulturer ga interessant innsikt, men klarte ikke å innlemme det avgjørende hemodynamiske elementet9. Faktisk utgjør studiet av det vaskulære systemet ex vivo spesifikke utfordringer knyttet til de mange dynamiske kreftene som gjelder for cellene i blodkarveggen. Stimuli som luminal strømning, turbulens, skjærspenning, trykk og veggdeformasjon påvirker vevspatofysiologien betydelig10,11,12.
Perfusjonsbioreaktorer er avgjørende for å studere vaskulær homeostase og remodellering som respons på skade eller hemodynamiske endringer13. Videre kan perfusjonskultur brukes til å forbedre modningen og holdbarheten av vevskonstruerte blodkar (TEBV), og gi egnede alternativer for vaskulære transplantater14.
Kommersielt tilgjengelige perfusjonsbioreaktorer er begrenset i fleksibilitet og tilpasningsevne og er kostbare. Mange av de eksisterende egenutviklede bioreaktorene er i stedet vanskelige å replikere i andre laboratorier, på grunn av begrensede beskrivelser og utilgjengelighet av spesiallagde komponenter 7,8,9,10,11,12. For å overvinne disse begrensningene har vi nylig utviklet en ny bioreaktor (EasyFlow), som er økonomisk å produsere, har plass til en rekke vev og muliggjør relativt enkle modifikasjoner for å tilpasse seg ulike forskningskrav13. Innsatsen er 3D-printet og passer som i et lokk på et standard 50 ml sentrifugerør. Den modulære designen og 3D-utskriftsproduksjonen gjør den tilgjengelig og reproduserbar på tvers av forskjellige laboratorier, samt lett modifiserbar for å tilpasse seg ulike vitenskapelige behov. Denne protokollen beskriver montering og grunnleggende drift av bioreaktorsystemet i en arteriell perfusjonsinnstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen beskriver montering og bruk av et system sammensatt av to EasyFlow (bioreaktor) innsatser: en som representerer reaksjonskammeret (C), som inneholder den perfunderte arterieprøven, og en som fungerer som et medium reservoar (R) (figur 1 og figur 2A). Carotisarterier ble oppnådd fra 4-6 uker gamle mannlige og kvinnelige grisunger (6-12 kg) ved The Pirbright Institute, Storbritannia. Dyreprosedyrer ble utført i henhold til Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) (ASPA) og godkjent av Animal Welfare and Ethical Review Board (AWERB) ved The Pirbright Institute. Dyrene ble plassert i henhold til Code of Practice for Housing and Care of Animals Bred. Alle prosedyrer ble utført av innehavere av personlig lisens som var opplært og kompetent under prosjektlisens PPL70/8852. Smågrisene ble avlivet i henhold til tidsplanen en metode under ASPA.
1. Sett inn produksjon
- Fremstill innsatsen ved hjelp av 3D-utskrift ved hjelp av den medfølgende 3D-modellen (tilleggsfil 1).
MERK: 3D-modellering gjør det enkelt å endre designet for å tilpasse seg nye applikasjoner. Alternative materialer og alternative produksjonsteknikker kan også brukes til å produsere innsatsen. På grunn av den komplekse indre strukturen er selektiv lasersintring og stereolitografi passende alternativer15. Polyamid 12 (PA12; se materialfortegnelse) er en god materialkandidat på grunn av sin overlegne ytelse når det gjelder væskeretensjon og motstand mot gjentatte varmesteriliseringssykluser16. - Fremstill silisiumpakningene og polykarbonatskivene ved laserskjæring17 ved hjelp av designene som er gitt i tilleggsfil 2.
NOTAT: Laserskjæring er lett outsourcet og en billig produksjonsmetode. Skiver kan produseres av rustfritt stål, noe som gir en mer motstandsdyktig komponent for gjentatt bruk. Alle andre komponenter er kommersielt tilgjengelige varer. En fullstendig liste over nødvendige materialer er gitt i tabell 1. De kommersielle detaljene for elementene er inkludert i materialfortegnelsen.
2. Enhetssterilisering, montering og priming
- Steriliser alle komponenter i henhold til instruksjonene i tabell 1.
- Under laminære strømningsforhold setter du sammen to fabrikkerte innsatser (trinn 1), som vist i figur 1A.
- Monter perfusjonssystemet som i figur 2, ved å følge trinnene nedenfor:
- Fest to tilkoblede treveisventiler til reservoarets R1-port (medieutvekslingsport).
- Koble det resulterende utløpet til den peristaltiske pumpens hode ved hjelp av et rør utstyrt med en enveisventil (enveis ventilrør).
- Koble pumpehodet til reaksjonskammerets C4-port ved hjelp av systemslangen utstyrt med en enveisventil.
MERK: Denne grenen kan eventuelt utstyres med en trykksensor som muliggjør konstant overvåking. - Koble reaksjonskammerporten C1 til mykveggsrør, og dette til motstandskanalen (liten indre diameter).
MERK: Lengden på motstandsslangen vil i stor grad påvirke trykket som er tilstede i systemet. Dette bør undersøkes videre for å sikre tilstrekkelige perfusjonsbetingelser. - Forleng motstandskanalen med systemslangen, opprett en returkanal og lukk luminalsirkulasjonssløyfen ved å koble til reservoaret ved R5 (figur 2C).
- Opprett en overløpskanal ved å koble reaksjonskammeret C3 til reservoaret R3 med systemrør.
- Fest et ventilasjonsfilter gjennom R2.
- Lag en trykkdemper ved å koble en sprøyte som inneholder luft og media til reaksjonskammeret C6.
MERK: Riktig luft-til-medie-forhold vil avhenge av den nødvendige trykkdempingen.
- Prime systemet med perfusjonsmedium (Dulbeccos modifiserte ørnemedium [DMEM] + 10% [v / v] føtalt bovint serum [FBS] + 1% [v / v] penicillin-streptomycin + 1% [v / v] amfotericin B + 30% [v / v] dextran; se materialfortegnelse) gjennom medieutvekslingsportene og reservoaret.
MERK: Priming av systemet reduserer risikoen for fangede bobler i systemet og identifiserer potensielle lekkasjer. Det anbefalte volumet av media er ca. 100-120 ml. Volumet som brukes vil avhenge av dødvolumet til slangen som brukes til eksperimentering.
3. Prøvehøsting og forberedelse
- Samle venstre og høyre felles halspulsårer, minimere direkte håndtering av arterielt vev13.
- Plasser vevet i kalde transportmedier (DMEM + 20% [v / v] FBS + 2% [v / v] penicillin-streptomycin + 1% [v / v] amfotericin B, se materialfortegnelse) for overføring.
- I et laminært strømningskap, fjern overflødig bindevev og trim endene av vevet ved hjelp av et skalpellblad. Vask vevet to ganger i kalde transportmedier.
- Plasser vev på en orbital shaker i transportmedier i minst 30 minutter for grundig vask.
- Koble et ikke-forgrenende segment av arterien til bioreaktorsystemet ved hjelp av to piggluerkontakter og fest den på plass ved hjelp av en karbinding (vaskulære silikonbånd; Tabell 1).
MERK: Fartøyets binding gir riktig spenning og tilbaketrekning for å sikre fartøyet. Den ovale delen forhindrer vevskader. - Forsiktig flyt media gjennom arterien for å verifisere patency.
- Etter å ha sikret arterien til den fabrikkerte innsatsen, fyll reaksjonsrommet med perfusjonsmedier (trinn 2.4). Til slutt fyller du forsiktig luminalsirkulasjonssløyfen med medier for å eliminere eventuell gjenværende luft fra systemet.
- Koble reaksjonsrommet med det tidligere monterte perfusjonssystemet (seksjon 2), og fullfør sirkulasjonen.
MERK: Det anbefales å utføre en kvalitetskontroll ved immunhistokjemi av behandlet vev. Dette identifiserer eventuelle skader på grunn av overdreven håndtering under klargjøring.
4. Perfusjonskultur og medieendring
- Plasser perfusjonssystemet i en 37 °C inkubator med 5% CO2 og koble det deretter til en peristaltisk pumpe (se Materialfortegnelse)
- Koble til eventuelle ekstra (fakultative) innsamlingssystemer, for eksempel trykksensorer (se Materialtabell).
- La systemet balansere over natten med en lav mediestrømningshastighet på ~10-15 ml/min.
MERK: Innledende eksperimenter for å bestemme pumpeinnstillinger, mediestrømning, systemtrykk og optimale trykkdempere/klemmeinnstillinger er nødvendige for å sikre at passende forhold oppfylles. - Neste dag øker du strømningen trinnvis (+1 o/min hver time, tilsvarende en ~2,5 ml/min økning hver time, i det nåværende systemet) til den endelige strømningshastigheten (35 ml/min) er oppnådd. Overvåk systemet med jevne mellomrom for lekkasjer.
MERK: For å beregne nøyaktig strømningshastighet basert på den peristaltiske pumpehastigheten, må brukerne først utføre tilstrekkelig pumpekalibrering18. Ved hjelp av formelen (1) kan volumetrisk strømningshastighet (Q) beregnes basert på volumet dispensert (V) innen en gitt tid (t). For å beregne estimert strømningshastighet () kan vi bruke den tidligere beregnede strømningshastigheten (Q) og arealet av fartøyets tverrsnitt (A), beskrevet i ligning (
2).
(1)
(2) - Hver 3. dag bytter du 50 % av mediet (~50 ml) ved å koble en sprøyte fylt med ferske medier til medieutvekslingsporten nærmere pumpen og en tom sprøyte til porten nærmere reservoaret for å samle opp det brukte mediet (figur 2).
MERK: Bruk av to treveisventiler som medieutvekslingsporter letter kontinuerlig drift av perfusjonen under mediumutvekslingen. - På slutten av forsøket, høst vevet fra reaksjonskammeret ved å trimme endene som er koblet til bioreaktoren ved hjelp av steril kirurgisk saks.
- Demonter, rengjør og steriliser systemet for videre bruk.
2).
(1)
(2)5. Prøveanalyse
- Fest den høstede prøven i 4 % paraformaldehyd (PFA) over natten ved 4 °C.
- Legg vevet inn i optimal skjæretemperatur (OCT; se materialtabell)19 og frys ved nedsenkning i iso-pentan avkjølt i flytende nitrogen.
- Oppnå kryoseksjoner med 3-5 mm tykkelse ved bruk av en kryostat.
- Utfør immunhistokjemi (hematoksylin og eosin [H&E]) og/eller immunfluorescens. Følg den typiske immunfluorescensprotokollen:
- Blokker skivene i 1 time ved romtemperatur med 20% [v/v] geiteserum i fosfatbufret saltvann (PBS; se materialfortegnelse).
- Inkuber skivene over natten ved 4 °C med primært kaninantistoff mot CD31 fortynnet 1:50 i PBS (se materialfortegnelse).
- Vask tre ganger med PBS i 5 min.
- Inkuber i 1 time ved 37 °C med fluorescerende merket sekundært antistoff mot kaninkanin fortynnet 1:200 i PBS og α-glatt muskelaktin (SMA) direkte konjugert fluorescerende antistoff fortynnet 1:200 i PBS (se materialfortegnelse).
- Vask tre ganger med PBS i 5 min.
- Beis kjernene med DAPI fortynnet 1:1000 i PBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Inkuber med 0,1 % (w/v) Sudan Black (se materialfortegnelse) i 70 % (v/v) etanol i 10 minutter ved romtemperatur for å redusere vevsautofluorescens.
- Vask vevet med rikelig avionisert vann. Monter lysbildene i monteringsmediet.
- Bilde prøvene med et konfokal laserskanningsmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien har etablert et allsidig og rimelig perfusjonssystem (EasyFlow)13. Den 3D-printede utformingen av systemet letter adopsjonen av systemet av andre laboratorier og oppmuntrer derfor til reproduserbarhet.
Den fremstilte perfusjonsinnsatsen er plassert i et 50 ml sentrifugerør, noe som skaper et isolert miljø. Ved hjelp av to perfusjonsinnlegg kan det etableres en perfusjonssløyfe som inneholder et reservoar og et reaksjonskammer, hvor den biologiske prøven inkuberes. Perfusjonssystemet kobles deretter til en peristaltisk pumpe og valgfrie innsamlingssystemer, for eksempel trykksensorer og ultralydenheter, for å overvåke kulturforholdene (figur 2).
Prøver fra halspulsåren hos svin ble samlet inn og behandlet før de ble dyrket i perfusjon i 7 dager. For å sikre vevets kvalitet før dyrkning ble det gjort foreløpige forsøk der prøvene ble fiksert på eksisjonstidspunktet, etter vevspreparasjon og etter perfusjon. Fluorescerende farging for endotelial (CD31) og glatt muskulatur (αSMA) markører ble brukt til å vurdere vedlikehold av vevsintegritet. Eksempler på godt bevart og skadet vev er presentert i figur 3 for sammenligning. Bildene viser viktigheten av skånsom håndtering av vevet på eksisjonstidspunktet, da feil behandling (overdreven strekk, knusing etc.) kan føre til tap av endotelet foran kulturen. Resultatene viser også viktigheten av gradvis etablering av perfusjon for å unngå lysskader.
H&E-farging ble utført sammen med immunfluorescens (IF)-farging for å vise opprettholdelse av morfologi og total fordeling av cellene i åreveggen etter 7 dagers dyrkning (figur 4). Anvendelsen av fysiologiske kulturforhold i enheten sikrer vedlikehold av endoteldekningen av lumen, justering av glatte muskelceller i mediet og bevaring av vasa vasorum i adventitia.
Den kompakte og modulære utformingen av bioreaktorsystemet gir også mulighet for et bredt spekter av systemoppsett. Det mindre oppsettet består av en enkelt bioreaktor og er ideell for farmakologiske studier og lavvolumstudier (resirkulerende perfusjon20, totalvolum på 50-70 ml). For å øke kulturlengden og redusere antall medieendringer, er et enkelt reservoarsirkulasjonssystem, som det som er beskrevet i denne protokollen, eller et konstant fôringssystem mer ideelt, da de har et større volum medium i omløp. Et oppsett med dobbel sirkulasjon21 kan etableres for å utforske eksperimentelle innstillinger der lokaliseringen av stimuli er kritisk. Den nåværende enheten kan også kombineres med mer sofistikerte kontrollsystemer for å muliggjøre presis tilbakemeldingskontroll av parametere som pH og oppløst oksygen (figur 5).
Figur 1: EasyFlow-monteringsskjemaer. (A) 3D-gjengitte skjemaer som hjelper monteringen av perfusjonsinnsatsen. (B) Detaljerte skjemaer er gitt for å lette montering av tilkoblingsstedene. (C) Et tverrsnitt av reaksjonsrommet fremhever de essensielle komponentene i EasyFlow-innsatsen og vevets tilkobling til innsatsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av perfusjonssystemsammenstillingen. (A) Montert perfusjonssystem som inneholder alle viktige komponenter, som fremhever deres relative posisjon i et 3D-gjengitt miljø. Ikke alle komponentene er i skala. (B) Individuelle isometriske visninger av komponenter presenteres også. (C) En toppvisning av det monterte perfusjonssystemet vises for å hjelpe monteringen og tilkoblingen av de forskjellige komponentene. Portene er merket og nummerert mot klokken for å navigere de forskjellige tilkoblingsstedene over perfusjonssystemet. Dette prinsippet er anvendt på reservoaret (R) og reaksjonskammeret (C). De ulike kanalene som forbinder de to kamrene har også fått navn som referanse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vevsvedlikehold under prosessering. (A) Konfokale bilder viser den normale strukturen til en arterie på tidspunktet for høsting, (B) etter rengjøring og behandling, og (C) etter perfusjonskultur, som viser opprettholdelse av en godt bevart morfologi. (D) Eksempler på skadet vev på grunn av overdreven eller feil håndtering under behandling eller (E) på grunn av anvendelse av ikke-fysiologiske dyrkningsbetingelser (dvs. brå initiering av høy strømning) viser uttømming av luminaldekningen og forstyrrelse av mediet. (F) Negativ kontroll angir flekkens spesifisitet. CD31: grønn; αSMA: rød; DAPI: blå. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Histologisk evaluering av vev før og etter perfusjonsdyrkning. (A og B) Arterielt vev ble evaluert ved histologi ved høsting og (C og D) etter 7 dagers kultur med bioreaktorsystemet. (A og C) H&E-farging avslører bevaring av arterieveggstrukturen og organisasjonen. (B og D) Immunfluorescensfarging av samme vevsbevis endoteldekning, justering av glatte muskelceller og vasa vasorum i adventitia. CD31: grønn; SMA: rød; DAPI: blå. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Skjematisk fremstilling av mulige perfusjonsoppsett. Ulike alternative oppsett kan tilpasses perfusjonsinnsatsen for å muliggjøre forskjellige eksperimentelle studier. (A) Det resirkulerende perfusjonsoppsettet minimerer volumet av medium som kreves. (B) Det konstante fôringsoppsettet gir en jevn tilførsel av medium til vevet. (C) Sirkulasjon av enkelt reservoar (som beskrevet i denne artikkelen) gir et større volum medier for langsiktige inkubasjoner og inkluderer en buffersone for luftutveksling og trykklikevekt. (D) Det doble sirkulasjonsoppsettet gir to forskjellige sløyfer som mater den indre (inne i arterien) og ytre (reaksjonsrommet) sirkulasjoner uavhengig. (E) Det dynamiske perfusjonsoppsettet inkluderer kontinuerlige gasser og pH-kontroll av en proporsjonal-integral-derivativ (PID) regulator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Komponenter for fremstilling av innsatsene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil 1: 3D-modell av EasyFlow-innsatsen for produksjon av 3D-utskrift. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Utformingsskjemaer for den konstruerte enheten, seksjonsvisning, utskrift og forseglingskomponenter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo vaskulære perfusjonssystemer utgjør en unik plattform for å studere funksjonen og oppførselen til vaskulære celler i deres opprinnelige vev under kontrollerte forhold, noe som muliggjør disseksjon av komplekse prosesser som vaskulær remodellering etter skade22. Imidlertid er de fleste rapporterte bioreaktorer egenproduserte systemer basert på skreddersydde komponenter og er ofte vanskelige å replikere av andre23. Alternative kommersielle løsninger finnes, men mangler fleksibilitet i utformingen og kan være relativt kostbare24.
Vi har utviklet et alternativt system som gir en enkel, billig og reproduserbar plattform som kan produseres ved hjelp av åpen kildekode 3D-utskriftsteknikker13. Denne artikkelen beskriver systemets oppsett for å aktivere reproduserbare programmer av sluttbrukere. Dette oppsettet muliggjør anvendelse av fysiologiske og patologiske trykkforhold (40-180 mmHg), strømningshastighet (6-30 ml / min), og i kombinasjon med medier som etterligner blodviskositeten, med varierende grad av skjærspenning.
Reproduserbarhet er et viktig aspekt av den vitenskapelige prosessen, da det tillater forskere å validere andres funn og bygge videre på dem for å utvikle vår forståelse av vaskulære sykdommer. Videre er verktøy som muliggjør og fremmer samarbeid mellom grupper avgjørende for å fremme vitenskapelig kunnskap. EasyFlow representerer et eksempel på slike åpen kildekode, tilgjengelige løsninger som enkelt kan produseres og tas i bruk av laboratorier som arbeider med et bredt spekter av prosjekter innen vaskulære og mer.
Vi rapporterer at denne enhetskulturen opprettholder arterielt vevs levedyktighet i minst 7 dager, og kan brukes til å modellere spesifikke trinn av vaskulær sykdom. Ved hjelp av dette kunne man modellere fysiologiske strømningshastigheter og trykkforhold13. Det er viktig at denne perfusjonskulturen er kostnadseffektiv på grunn av de lave produksjonskostnadene og det lave volumet av medium som er nødvendig for å betjene systemet.
3D-designet kan også tilpasses nye applikasjoner, og nye materialer for utskrift kan testes. Selv i sitt nåværende format kan prøveforlegningsområdet enkelt tilpasses prøver av forskjellige størrelser ved å endre lengden på beslagene eller boringen på luerkoblingene. Det er viktig å merke seg at, gitt enhetens modulære natur og dens små dimensjoner, kan denne bioreaktoren brukes i flere oppsett (figur 5) og kan brukes på multiplekskulturer, hvor flere prøver kan utsettes for forskjellige forhold samtidig i separate bioreaktorer.
Det er tenkt at bruken av systemet skal utvides i fremtiden for å støtte kulturen av blodkar fra forskjellige opprinnelser (f.eks. forskjellige arter) og av forskjellige naturer (f.eks. Vener, lymfatiske), og kanskje brukes på kulturen til andre hule vev (f.eks. Luftrør, tarm). Spesielt viser forskning at dyrking av vevskonstruerte stillaser i konstant perfusjon bidrar til homogen fordeling av celler i konstruksjonen og modningen av det resulterende vevet25,26. I tillegg bidrar såing av vaskulære transplantater i perfusjon til å oppnå et mer jevnt cellularisert vaskulært lumen, sammenlignet med statiske metoder27. Av denne grunn ser vi for oss at systemet blir brukt til vevsteknikk for å bidra til å løse dagens utfordringer, noe som muliggjør fremtidig utvikling av reproduserbare syntetiske blodkarsubstitutter28.
Protokollen beskrevet her presenterer noen viktige skritt som er kritiske for suksessen til flytkulturen. Etablering og overvåking av passende strømningsforhold er ikke trivielt og må utføres på hvert system når det er satt opp for første gang, for å sikre at kulturforholdene er fysiologiske. Strømning og trykk ble overvåket ved hjelp av trykksensorer og ultralydavbildning. Et annet kritisk punkt er å sikre at vevet er levedyktig og intakt i begynnelsen av kulturen. Dette krever en ny kilde, forsiktig håndtering og kan verifiseres ved histologisk analyse. I tillegg må feilsøking utføres ved starten av hvert eksperiment for å identifisere potensiell bakteriell forurensning eller medielekkasjekilde.
Det er viktig å fremheve at det beskrevne perfusjonssystemet, samtidig som det gir fysiologiske trykk- og strømningsforhold, ikke er i stand til helt å etterligne de komplekse trykkbølgemønstrene som er registrert in vivo. Denne begrensningen kan tilskrives bruk av en peristaltisk pumpe og kan løses ved hjelp av mer spesialisert utstyr for å reprodusere avanserte hemodynamiske forhold. Kulturen av blodkar i en bioreaktor er heller ikke i stand til å ta opp studier der immunsystemet eller samspillet med andre organer er kritisk.
Avslutningsvis presenteres et enkelt 3D-trykt perfusjonssystem som kan etterligne det fysiologiske hemodynamiske miljøet, som forventes å bidra til standardisering av ex vivo blodkarkulturer. Potensialet for tilpasning og anvendelse på langsiktig kultur gjør det til et viktig verktøy for å fremme forståelsen av disse komplekse biologiske systemene i fysiologi og patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Veterinary Pathology Centre ved University of Surrey School of Veterinary Medicine for histologitjenester. Vi takker også Dr. L. Dixon, A. Reis og M. Henstock fra The Pirbright Institute (Pirbright, Storbritannia) for deres støtte i anskaffelsen av animalsk vev, og Department of Biochemical Sciences ved University of Surrey, spesielt det tekniske teamet, for deres fortsatte støtte. RSM ble støttet av doktorgradsstudentprisen (University of Surrey), DM og PC ble støttet av Nasjonalt senter for erstatning, forfining og reduksjon av dyr i forskning (stipendnummer: NC / R001006 / 1 og NC / T001216 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasyFlow | - | - | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 - 3D printing | Protolabs | - | - |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt - 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | - | - | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , Elsevier. (2017).
- McKeen, L. W. Chapter 6 - Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). McKeen, L. W. , William Andrew Publishing. 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. Computer Methods in Chemical Engineering. , CRC Press. (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
