Summary
הובלת אבץ הוכחה כמאתגרת למדידה בשל הקשרים הסיבתיים החלשים לתפקוד החלבונים והרזולוציה הטמפורלית הנמוכה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור, ברזולוציה טמפורלית גבוהה, של שחול Zn 2+ מתאים חיים על ידי שימוש בצבע פלואורסצנטי רגיש Zn 2+, ובכך מספק מדד ישיר של Zn2+ efflux.
Abstract
מתכות מעבר כגון יוני Zn2+ חייבות להיות מווסתות היטב בשל רעילותן התאית. בעבר, הפעילות של מובילי Zn 2+ נמדדה בעקיפין על ידי קביעת רמת הביטוי של הטרנספורטר בריכוזים שונים של Zn2+. זה נעשה על ידי שימוש באימונוהיסטוכימיה, מדידת mRNA ברקמה, או קביעת רמות Zn2+ תאי. עם התפתחותם של חיישני Zn2+ תוך-תאיים, פעילותם של מובילי אבץ נקבעת כיום בעיקר על ידי מתאם שינויים בטרנספורטרים תוך-תאיים Zn 2+, שזוהו באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות, עם הביטוי של מובילי Zn2+. עם זאת, אפילו כיום, רק מעבדות מעטות מנטרות שינויים דינמיים ב-Zn2+ תוך-תאי ומשתמשות בו כדי למדוד ישירות את הפעילות של מובילי אבץ. חלק מהבעיה היא שמתוך 10 מובילי אבץ ממשפחת ZnT, למעט ZnT10 (מוביל מנגן), רק טרנספורטר אבץ 1 (ZnT1) ממוקם בקרום הפלזמה. לכן, קשה לקשר את פעילות ההובלה לשינויים בריכוז Zn2+ התוך-תאי. מאמר זה מתאר דרך ישירה לקבוע את קינטיקה של הובלת אבץ באמצעות בדיקה המבוססת על צבע פלואורסצנטי ספציפי לאבץ, FluoZin-3. צבע זה נטען לתוך תאי יונקים בצורתו אסטר ולאחר מכן נלכד בציטוזול עקב פעילות די-אסטראז תאית. התאים נטענים ב-Zn 2+ על ידי שימוש בפיריתיון היונופור Zn2+. פעילות ZnT1 מוערכת מהחלק הליניארי של הפחתת הפלואורסצנטיות בעקבות שטיפת התא. הפלואורסצנטיות הנמדדת בעירור של 470 ננומטר ופליטה של 520 ננומטר פרופורציונלית ל-Zn2+ התוך-תאי החופשי. בחירת התאים המבטאים ZnT1 המתויגים עם mCherry fluorophore מאפשרת ניטור רק של התאים המבטאים את הטרנספורטר. בדיקה זו משמשת לחקר תרומתם של תחומים שונים של חלבון ZnT1 למנגנון ההובלה של ZnT1 אנושי, חלבון טרנסממברנה אאוקריוטי המוציא עודפי אבץ מהתא.
Introduction
אבץ הוא יסוד קורט חיוני בסביבה התאית. הוא משלב שליש מכלל החלבונים ומעורב בתהליכים תאיים שונים, כגון קטליזה1, שעתוק2 ומוטיבים מבניים3. עם זאת, למרות היותו אינרטי חמצון-חיזור, ריכוזי אבץ גבוהים רעילים לתא, ולכן אף אורגניזם יונקים לא שרד ללא נוכחות מנגנונים המווסתים את הומאוסטזיס האבץ. ביונקים, שלושה מנגנונים אחראים לתהליך זה: (1) מטלותיונינים, שהם חלבונים עשירים בציסטאין ציטוסולי הקושרים אבץ בזיקה גבוהה, ובכך מונעים עודף אבץ ציטוסולי חופשי4; (2) חלבונים דמויי Zrt/Irt (ZIPs), שהם מובילי אבץ האחראים לזרימת אבץ לתוך הציטוזול דרך קרום הפלזמה או מאברונים תוך-תאיים 4,5,6,7,8; ו-(3) ZnTs, שהם תת-קבוצה של יונקים ממשפחת CDF (cation diffusion facilitator) הנמצאים בכל מקום, והם מובילי אבץ, מכיוון שהם מפיצים אבץ מהציטוזול דרך קרום הפלזמה או לתוך האברונים התוך-תאיים 4,5,6,7,8,9. בשל חשיבותו של אבץ לחילוף החומרים בתאים, חיוני להבין את הדינמיקה של אבץ בתאים.
שיטות קודמות להערכת דינמיקת אבץ התמקדו בהערכת רמות הביטוי של mRNA בתנאי אבץ שונים, על-ידי קורלציה שלהן למדידות אבץ בתאים של רקמות קבועות או תאים10,11,12. שיטות אלה כוללות זיהוי כימי וצביעה אימונוהיסטוכימית. עם זאת, שיטות אלה מניבות רק מדדים עקיפים, ולכן קובעות רק מתאם לא מקוון בין ריכוז אבץ תוך-תאי לבין ביטוי מובילי אבץ. כתוצאה מכך, שיטות אלה אינן יכולות להסיק פרמטרים הדורשים רזולוציה זמנית גבוהה.
מדידה ישירה יותר של הובלת Zn2+ משתמשת באיזוטופים רדיואקטיביים של אבץ13. שיטה זו מסתמכת על מדידה של Zn2+ המסומן ברדיו כדי לנטר את הובלת האבץ ואת הקינטיקה שלו. עם זאת, בשל חשיבותו של אבץ להומאוסטזיס תאי, תהליכים תאיים מרובים מווסתים את ריכוז האבץ התוך-תאי. בין אלה קשירה חוץ-תאית ומספר מערכות תחבורה הפועלות בתיאום כדי לשמור על שליטה הדוקה ברמות Zn2+ תוך תאי. השילוב של תהליכים אלה יוצר רעשי רקע ניכרים, מה שמקשה על בדיקת פונקציות הובלה בודדות הקשורות לאבץ.
מאמר זה מדגים שיטה לניטור ישיר של קצב העברת האבץ על-ידי מדידת ריכוז האבץ החופשי התוך-תאי באמצעות צבע פלואורסצנטי ספציפי לאבץ, FluoZin-3. לצבע יש סגוליות גבוהה עבור Zn2+ והפרעה מועטה מקטיונים דו-ערכיים אחרים, כגון סידן. בנוסף, בצורתו אסטר, הוא נכנס לתאים על ידי דיפוזיה nonionic ולאחר מכן הוא לכוד עקב הפעילות של di-esterase תאי. לפיכך, הפלואורסצנטיות שלו מתואמת בעיקר עם ריכוז האבץ הציטוסולי החופשי. ניסויים אלה נערכו כדי לחקור את הקשר מבנה-פונקציה של טרנספורטר אבץ 1 (ZnT1), חבר במשפחת ZnT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טרנספקציה של תאים
- תרבית HEK293T תאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 2 מילימטר L-גלוטמין ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים) באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C/5% CO2 עד למפגש על צלחת של 10 ס"מ (8.8 x 106 תאים בסך הכל).
- מניחים מכסה אחד בקוטר 13 מ"מ בכל אחת מהבארות של צלחת בת 12 בארות. לדלל 0.44 x 106 תאים טריפסיניים משלב 1.1 ב 12 מ"ל של DMEM מלא. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים. מלא כל באר עם 1 מ"ל של פתרון מעורב. לגדול באינקובטור לח ב 37 ° C / 5% CO2 בן לילה.
- החלף את ה-DMEM המלא בכל באר ב-1 מ"ל DMEM ללא סרום (ראה טבלת חומרים) בכל באר. החזירו את צלחת 12 הקידוחים לאינקובטור הלח כמו בשלב 1.1.
- עבור כל באר טרנספקציה, לדלל 1 מיקרוגרם של פלסמיד pAAV2 המכיל את החלבון של עניין מתויג עם חלבון פלואורסצנטי mCherry (קובץ משלים 1) ב 100 μL של DMEM ללא סרום בצינור 1.5 מ"ל.
- הוסף 3 מיקרוגרם של פוליאתילנאימין (PEI, ראה טבלת חומרים) ל- 100 מיקרוליטר DMEM ללא סרום לכל טרנספקציה, כאשר כל טרנספקציה בצינור אחר של 1.5 מ"ל. יחס פלסמיד:PEI צריך להיות 1:3 (מיקרוגרם:מיקרוגרם).
- מערבלים את שני הצינורות משלב 1.4 ושלב 1.5 למשך 10 שניות, ומשאירים לנוח בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפחות.
- ערבב חלק אחד (100 μL לכל באר) של תמיסת ה- DNA משלב 1.4 עם חלק אחד (100 μL לכל באר) של תמיסת PEI משלב 1.5. מערבול את הפתרון הסופי במשך 10 שניות, ולהשאיר אותו לנוח בטמפרטורת החדר לפחות 20 דקות עד 6 שעות.
- קח את צלחת 12 בארות מהאינקובטור. מערבלים את הפתרון הסופי משלב 1.7, ומוסיפים 200 μL לכל אחת מהבארות בלוח 12 הקידוחים משלב 1.3. החזירו את צלחת 12 הקידוחים לאינקובטור הלח (שלב 1.1).
- לאחר 3 שעות, להחליף את המדיום בכל באר עם 1 מ"ל של DMEM מלא. החזירו את צלחת 12 הקידוחים לאינקובטור הלח כמו בשלב 1.1.
- לאחר יומיים, קח את תרבית התאים הנגועים מאינקובטור 37 ° C / 5% CO2 , והנח אותה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באמצעות הגדלה פי 10.
- באמצעות גלגל המיקוד של המיקרוסקופ, התמקדו בתאים תוך שימוש באור שדה בהיר.
- עברו לעירור פלואורסצנטי של דובדבן (587 ננומטר) ולאורכי גל של פליטה (610 ננומטר), וכבו את אור השדה הבהיר. בדוק את הפלואורסצנטיות של התאים כדי לאשר את הביטוי של ZnT1 mCherry.
- הכינו את תמיסת העמסת הצבע.
- קח aliquot של 4 μL של צבע פלואורסצנטי ספציפי אבץ (ראה טבלה של חומרים) בצורת אסטר אצטוקסימתיל (AM) שלה, מומס DMSO (1 מיקרוגרם / μL), ממלאי מוגן אור מאוחסן במקפיא -20 ° C. צורה זו מאפשרת לצבע להיכנס לתא דרך קרום הפלזמה על ידי דיפוזיה פשוטה.
- הוסף 4 μL של 10% חומצה פלורונית (או 2 μL של 20% חומצה פלורונית, ראה טבלת חומרים) לאליציטוט משלב 1.13.1. מערבבים היטב את התמיסה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה שלוש פעמים, ולאחר מכן להוסיף את כל 8 μL לצינור 1.5 מ"ל.
- הוסף 750 μL של תמיסה של רינגר (מוכן בבית, ראה טבלה של חומרים להרכב) בתוספת 1 מ"ג / מ"ל (~ 0.1%) אלבומין בסרום בקר לצינור משלב 1.13.2, ומערבל במרץ. מוסיפים עוד 750 μL של אותה תמיסה, ומערבלים שוב כדי להבטיח ערבוב מקסימלי.
- הוסף 750 μL של הפתרון הסופי משלב 1.13.3 לשתי בארות בלוח תרבית חדש בן 6 בארות. מכסים ברדיד אלומיניום.
הערה: כדי למנוע הלבנה, צלחת 6 הבארות מכוסה תמיד ברדיד אלומיניום משלב זה. - בעזרת טוויטר עדין, קחו עד ארבע כיסויים משוכפלים מצלחת תרבית התאים הנגועה, והניחו אותם בבאר המלאה הראשונה (עד ארבע שקופיות לכל באר) של הצלחת החדשה בעלת 6 הקידוחים משלב 1.14. חזור על תהליך זה עבור השני מלא היטב.
הערה: כל הכיסויים באותה באר מלאה חייבים להיות מאותו מצב. עם זאת, כל באר יכולה להכיל תנאים שונים. - מכסים ברדיד אלומיניום ומנערים בעדינות במשך 15-20 דקות.
- הסר את תמיסת העמסת הצבע והחלף אותה בתמיסת כביסה חדשה של אלבומין פלוס של רינגר, כפי שנעשה בו שימוש בשלב 1.13.3. מכסים ברדיד אלומיניום. השאירו לנער שוב למשך 20 דקות. זה מאפשר את המחשוף של אסטר AM על ידי אסטרזות תאיות.
2. הכנת מיקרוסקופ
- סדרו את הכלים הדרושים (ראו טבלת חומרים) כאמור: מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המסוגל לזהות פלואורופורים מסוג GFP ו-mCherry, מערכת זילוח המאפשרת מעבר בין שתי תמיסות לפחות, מערכת יניקה ותא זילוח.
- הפעל את המיקרוסקופ, את מקור האור שלו ואת המצלמה. הפעל את מערכת היניקה.
- לשטוף את מערכת זילוח. שטפו את התא הראשון בתמיסת רינגר ואת התא השני בתמיסת רינגר המכילה תמיסת אבץ 7 מיקרומטר בתוספת פיריתיון 7 מיקרומטר (יונופור אבץ, ראו טבלת חומרים). כדי למנוע בועות אוויר או רווחים, השאירו מעט נוזלים בכל חדר.
הערה: מכיוון ששני המיכלים מחוברים לאותו צינור המחובר לתא הזילוח, יש לוודא תמיד שהמקטע המשותף נשטף בתמיסת רינגר. - סגרו את הברזים, ומלאו את התאים המתאימים בתמיסת רינגר ותמיסת אבץ של רינגר, כמו בשלב 2.3.
3. הכנת מדגם
- קחו את תא הזילוח והניחו אותו כשהצד הצר של החריץ פונה כלפי מעלה.
הערה: החריץ הוא חור באמצע תא הזלוף. זה מאפשר לנוזל הזלוף גישה לתאים. צד אחד של החריץ צר, והצד הנגדי רחב. - יש למרוח סיליקון איטום (ראו טבלת חומרים) סביב החריץ. נקו כל סיליקון איטום מהחריץ בעזרת קצה פיפטה.
הערה: ודא שיש מספיק אטם סיליקון סביב החריץ כדי לאטום כיסוי בקוטר 22 מ"מ. - בעזרת טוויטר עדין, קחו פתק כיסוי מתמיסת הכביסה, והניחו אותו על גבי החריץ כשהתאים פונים כלפי מטה. בדרך זו, התאים ייחשפו לתמיסה המנקבת את החריץ במהלך הניסוי.
- הניחו מכסה בקוטר 22 מ"מ על גבי הכיסוי בקוטר 13 מ"מ, והדקו אותו באמצעות הטוויטר. היזהרו לא לפצח את הכיסויים.
- הפוך את התא, ולחץ עליו כדי לשחרר את כל הנוזלים הנוכחיים. מלאו את החריץ ב-100 מיקרוליטר של תמיסת הכביסה של רינגר ולחצו שוב כדי לוודא שאין דליפה.
הערה: אם מתגלה נזילה, יש למרוח חומר איטום במקום הנזילה ולבצע בדיקה חוזרת. - הרכיבו את תא הזילוח על הרציף, ואבטחו אותו. הניחו את צינורות הזילוח והיניקה כדי לאפשר זילוח על התאים בחריץ.
- שנו את קצב הזילוח לכ-2 מ"ל/דקה, והפעילו את הזלוף של תמיסת הצלצול. ודא שמערכת הזילוח פועלת ללא דליפה או זליגה.
4. הכנת מדידה
- פתח את תוכנת ההדמיה (ראה רשימת חומרים) על-ידי לחיצה כפולה על הסמל. התחבר עם האישורים הרלוונטיים. בחר את המצלמה המצורפת ולחץ על אישור.
- הגדר את הגדלת המיקרוסקופ ל -10x באמצעות הלחצן בצד שמאל של המיקרוסקופ.
- בחירת תצוגה חיה ושימוש בג'ויסטיק, הזז את הפלטפורמה כדי להתמקד בתאים בחריץ.
- בזמן שהזילוח דולק, כבה את האורות ושנה את אורך הגל ל- mCherry על ידי לחיצה על הכפתור הייעודי בממשק. כוונן את המיקוד באמצעות גלגל המיקוד של המיקרוסקופ.
- ברגע שהמיקרוסקופ מתמקד בתאים, הזיזו את הפלטפורמה באמצעות הג'ויסטיק כדי לאפשר בחירה של טלאי התאים המתאימים.
הערה: אזור מתאים נחשב לאזור עם לפחות 10 תאים עבור החזר השקעה ואזור ריק עבור רקע. - בחר בתפריט הנפתח הפעלה/כיבוי של החזר השקעה ובחר צייר החזר השקעה מעגלי.
- צייר ROI של אשכולות תאים עם התאים המבטאים mCherry (מציין את הביטוי של ZnT1).
- מאותו סרגל כלים כמו שלב 4.6, לחץ על לחצן הפעלה/כיבוי של החזר השקעה ברקע והתאם את המיקום והגודל של החזר ההשקעה על הרקע לאזור ללא תאים כלל.
- בדוק עם אורכי הגל mCherry ו- EGFP כדי לוודא שאין תאים בהחזר ההשקעה על הרקע שנבחר.
הערה: אורכי הגל הותאמו כך ש-mCherry השתמש באורך גל עירור של 520 ננומטר ובאורך גל פליטה של 610 ננומטר ו-EGFP השתמש באורך גל עירור של 470 ננומטר ובאורך גל פליטה של 520 ננומטר.
- בדוק עם אורכי הגל mCherry ו- EGFP כדי לוודא שאין תאים בהחזר ההשקעה על הרקע שנבחר.
- בחר בכרטיסיית המשנה אורך גל (λ). סמן את תיבת הסימון שלו וודא שאורך הגל של GFP קיים ותיבת הסימון שלו מסומנת. אם לא, הוסף וסמן אותו.
- בחר בכרטיסיה המשנה משך . הגדר את מרווח המדידה כ- 5 שניות, ושנה את מספר המרווחים כך שיתאימו למשך הניסוי.
- באזור פוקוס בלוח המיקרוסקופ מתחת לעינית, לחץ על כפתור מופעל כדי להפעיל את מערכת המיקוד המושלם (PFS).
- באמצעות גלגל המיקוד של PFS, התאם את המיקוד. בממשק התוכנה, תחת ND Acquisition, ודא ש - PFS מופעל מסומן.
- לחץ על הפעל כעת.
5. הליך ניסיוני
- התחל במדידת תקופת הבסיס של 90 שניות באמצעות זילוח הפתרון של Ringer.
- לאחר סיום תקופת ההתחלה, כבה את זילוח התמיסת של הצלצול ולאחר מכן הפעל את זילוח תמיסת האבץ של הצלצול. סמן את החלפת הפתרון על ידי לחיצה על הדגל האדום בפינה השמאלית התחתונה של לוח הממשק הראשי. צפויה להופיע עלייה בפלואורסצנטיות.
- ברגע שעליית הפלואורסצנטיות מתחילה להרוות, החליפו בחזרה לזילוח עם התמיסה של רינגר. כבו את זילוח תמיסת האבץ של הצלצול ולאחר מכן הפעילו את זילוח התמיסה של הצלצול.
- המתן עד שזמן הניסוי יפוג. צפויה ירידה ניכרת אך יציבה בפלואורסצנטיות אם ה-ZnT1 פועל כראוי.
6. ייצוא נתונים
- כדי לייצא את הנתונים עם חיסור בסיסי, לחץ על הלחצן Subtract Baseline והצג את השינויים בחלון הרכישה ND.
- לחץ על כפתור ייצוא בממשק התוכנה בחלון "רכישת ND". גליון נתונים של Excel ייפתח. שמור במיקום הרצוי.
7. ניתוח נתונים
- עבור כל החזר השקעה, צור פלואורסצנטיות בסיסית ממוצעת בין 90 ל-100 השניות הראשונות.
- בטא את הפלואורסצנטיות המחושבת עבור כל החזר השקעה כאחוז מהרקע עבור החזר השקעה זה.
- צור ממוצע שורה של כל החזר ההשקעה והתווה את התוצאה כתרשים קווי. זה יוצר ממוצע של כל ה- ROI כפונקציה של זמן.
- באמצעות פונקציית ההתאמה הליניארית, בחר את הקצב ההתחלתי לירידה בפלואורסצנטיות לאחר השטיפה עם תמיסת רינגר. ערך השיפוע של המשוואה מתואם עם קצב ההובלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZnT1 הוא טרנספורטר אבץ יונקים הממוקם על קרום פלזמה התא13. הוא חבר במשפחת החלבונים CDF (cation diffusion facilitator) המזרים אבץ מהציטוזול למילייה14 החוץ-תאי. ל-ZnT1 ארכיטקטורה דו-תחומית: תחום טרנסממברנה, המוביל את היונים על פני הממברנה, ותחום C-terminal14. שלא כמו חלבוני CDF ידועים אחרים, ל- ZnT1 יש תחום C-terminal מורחב ולא מובנה (USCTD). תפקידו של USCTD אינו ידוע כרגע. השתמשנו בפרוטוקול לעיל כדי להשוות את ZnT1 WT ל-ZnT1 ללא USCTD כדי להעריך את מעורבותו בפעילות הובלת אבץ.
תאי HEK 293T הודבקו בפלסמיד pAAV2 המכיל ZnT1 WT או ZnT1 ללא מסוף C בלתי מובנה (ΔUSCTD) ובדקו את קצב פעילות ההובלה כמתואר לעיל. איור משלים 1 מראה ששתי הגרסאות של ZnT1 מבטאות ומתמקמות לקרום הפלזמה ללא בעיות. איור 1 מתאר את התוצאות האופייניות לדוגמה של ניסוי כזה. עלייה בפלואורסצנטיות היא תוצאה של עלייה בריכוז התוך-תאי Zn 2+, בעוד שירידה היא תוצאה של הפעילות של ZnT1 המוביל Zn2+ דרך קרום התא (גרפים בודדים, כולל שגיאות תקן, נמצאים באיור משלים 2 ובאיור משלים 3). ניתן לראות מאיור זה כי ל- ZnT1 WT יש עקומת פלואורסצנטיות חלקה יותר מאשר למוטציה. עם זאת, זו אינה תכונה מבדילה אינהרנטית, אלא קשורה לשונות בתגובות התאיות לעומס אבץ, שנצפתה בניסויים קודמים. איור 2 מראה תרשים קופסה המסכם את התוצאות של 15-17 ניסויים כאלה. מן האיור, ברור כי ΔUSCTD מציג פריסה רחבה יותר של שיעורי הובלה לעומת WT. בעוד שניתן לייחס זאת לשונות התגובה התאית שהוזכרה קודם לכן, זה יכול גם להצביע על הבדל פונקציונלי. לדוגמה, זה עשוי לרמוז כי קטע ZnT1 USCTD הוא אפנן של קצב ההובלה. ברור שאין הבדל נראה לעין בין פעילויות השחול Zn2+ של WT ו-ΔUSCTD. בהתבסס על הניתוח הסטטיסטי, הנתונים לא הופצו בדרך כלל (WT dataset, Shapiro-Wilk test15, statistic = 0.72404, p value = 0.0004), ולכן שני מבחנים לא פרמטריים מדגמיים שימשו להשוואות בין מערכי הנתונים. התוצאות הראו כי לא היה הבדל סטטיסטי בין שיעורי ההובלה (מבחן Mann-Whitney16 U: U = 132, Z = 0.15105, Asymp. Prob>|U| = 0.87994; מבחן Kolmogorov-Smirnov17: D = 0.27059, Z = 0.76384, הסתברות מדויקת>|D|= 0.5161).
בשל העלות האנרגטית המשמעותית של יצירת הרחבה הבלתי מובנית (~80 חומצות אמינו), סביר להניח שתחום זה משרת פונקציה תאית. עם זאת, פונקציה תאית הקשורה לתחום זה לא זוהתה עד כה. תחום זה ייחודי ל- ZnT1 ואינו נמצא באף חבר אחר במשפחת ZnT. ככזה, זה יכול להיות בשל העובדה כי, בניגוד ZnTs אחרים, ZnT1 ממוקם בקרום פלזמה, בעוד למעט ZnT10, כל שאר החברים באים לידי ביטוי אברונים פנימיים.
הנתונים הגולמיים והגרפים הבאים המוצגים כאן מבוססים על מדידות מרווח של 5 שניות של הפלואורסצנטיות הנגרמת על ידי הצבע הרגיש לאבץ. משמעות הדבר היא כי במסגרת זמן קצרה יחסית (דקות), הדמיה של העברת אבץ תלוי זמן יכול להיווצר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה. הניתוח צריך לכלול נורמליזציה של תקופת הבסיס, שכן הצבע נטען לתוך התאים לפני העמסת אבץ, וייתכן שיש לו פלואורסצנטיות תוך-תאית ראשונית הנגרמת על ידי כמות קטנה של אבץ חופשי. בנוסף, צבע האבץ הופך להיות פעיל פלואורסצנטית רק לאחר מחשוף על ידי אסטראז תאי. לכן, מומלץ לתת זמן מה לתהליך הדה-אסטריפיקציה להתרחש עבור רוב הצבע על מנת למנוע דפוסי פלואורסצנטיות לא סדירים הנגרמים על ידי מחשוף אסטר צבע לאורך כל הניסוי.
איור 1: פעילויות שחול Zn2+ של WT ו-ΔUSCTD באמצעות בדיקת הובלת אבץ. ציר ה-x הוא הזמן בשניות. ציר ה-y הוא השינוי הפלואורסצנטי המתבטא כאחוז מקו הבסיס. הגרפים הקוויים הם השינוי הפלואורסצנטי כפונקציה של הזמן. הנתונים ממוצעים מעל >10 ROIs. גרפים בודדים עם שגיאת תקן מוצגים באיור משלים 2 ובאיור משלים 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השוואה בין הפעילויות של ZnT1 WT ו-ΔUSCTD המתוארות כעלילת קופסה. כל נקודת נתונים מייצגת ניסוי יחיד. הקו השחור מציין את הציון החציוני. התיבה הריבועית החלולה מציינת את הניקוד הממוצע. ציר ה-y מציין את השינוי באחוז הבסיס לשנייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: תאי HEK 293T שעברו טרנספורמציה עם (A) ZnT1 WT או (B) ZnT1 ΔUSCTD שעוררו באורכי גל של עירור mCherry (520 ננומטר) ופליטה (610 ננומטר). בשני המקרים, יש לוקליזציה של ביטוי וקרום של וריאנט ZnT1. הגדלת המיקרוסקופ היא פי 20. זמן החשיפה הוא 100 אלפיות השנייה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
איור משלים 2: ZnT1 WT Zn2+ העברת פעילות עם שגיאת התקן המומחשת. ציר ה-x הוא הזמן בשניות. ציר ה-y הוא אחוז השינוי הפלואורסצנטי מפלואורסצנטיות קו הבסיס. הקו השחור הוא השינוי הפלואורסצנטי הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ העברת פעילות עם שגיאת התקן המומחשת. ציר ה-x הוא הזמן בשניות. ציר ה-y הוא אחוז השינוי הפלואורסצנטי מפלואורסצנטיות קו הבסיס. הקו האדום הוא השינוי הפלואורסצנטי הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: רצף פלסמיד pAAV2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת לעיל מאפשרת מדידה ישירה של ריכוז האבץ התוך תאי ברזולוציה טמפורלית גבוהה. בהשוואה לשיטות אחרות, שיטה זו הכוללת ניטור שינויים ב- Zn2+ תוך תאי יכולה להפחית באופן משמעותי את רעשי הרקע. בנוסף, הסלקטיביות של הצבע עבור אבץ מבטלת אינטראקציות צולבות פוטנציאליות עם קטיונים מתכתיים אחרים18,19. לבסוף, היעדר ציטוטוקסיות מיידית מאפשר בדיקה של תהליכים תאיים חיים19.
עם זאת, שיטה זו יש מגבלות מסוימות. ראשית, זיהוי דינמיקה תוך-תאית יכול להיות מאתגר יותר באופן יחסי עם פרוטוקול זה, שכן הצבע המשמש בשיטה זו נועד להילכד בתא אך לא ניתן לכוונו לאזורים או לתהליכים ספציפיים. צבעים פלואורסצנטיים אחרים יכולים להיות מופנים לאזור מסוים בתאים, אבל, למרבה הצער, יש טווח דינמי נמוך בהרבה20. שנית, חשיפת הצבע לאור גורמת לירידה בפלואורסצנטיות עקב הלבנה, המגבילה את זמן החשיפה לאור וכתוצאה מכך את חלון הזמן הפעיל לביצוע הניסוי. שלישית, טעינת הצבע בפרוטוקול זה מסורבלת וגוזלת זמן בהשוואה לשימוש בצבעים אחרים, במיוחד צבעים מקודדים גנטית21. לבסוף, גם לאחר ניתוק האסטרים, הצבע דולף, מה שמוביל להפחתה בלתי תלויה ב-Zn 2+ בפלואורסצנטיות22.
יש לנקוט במספר צעדים כדי להבטיח את הצלחת הניסוי. ראשית, מאז transfection ניתן להפיץ באופן לא שווה, התאים שנבחרו צריך להכיל את החלבון של עניין. כדי למנוע הלבנת צבע, חשוב לשמור על התאים הטעונים מוגנים מפני אור. בעת ביצוע הניסוי, קצב הזילוח אמור להספיק כדי להשלים את הניסוי מבלי לגרום לניתוק התאים מהכיסוי. במקרה של מספר ריצות, מומלץ לשמור על אותם מאגרים לתמיסת הצלצול ולתמיסת האבץ של רינגר. ניתן לכוונן את זמן העמסת הצבע ואת זמן הכביסה על פי ניסויים ראשוניים. העמסת אבץ לתאים באמצעות זילוח עם פיריתיון יכולה להימשך בין דקה לחמש דקות, כפי שהוערך על ידי ניטור פלואורסצנטיות המושרה על ידי Zn2+ עם הזמן.
למרות קשיים אלה, שיטה זו מאפשרת לנו, לראשונה, ללמוד את הדינמיקה של תהליך השחולZn 2+. זה מפשט את התהליך ויוצר דרך ישירה לבסס טוב יותר קשרים סיבתיים בהשוואה לשיטות הקודמות23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
רז זריבך נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מס' 163/22). תומר אלי בן יוסף ואריה מורן נתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מס' 2047/20). ברצוננו להודות לדניאל גיטלר ולקבוצתו באוניברסיטת בן-גוריון על שיתוף הפעולה, התמיכה והמומחיות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M.
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
