Summary
Die Messung des Zinktransports hat sich aufgrund der schwachen kausalen Verbindungen zur Proteinfunktion und der geringen zeitlichen Auflösung als schwierig erwiesen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Überwachung der Zn2+-Extrusion aus lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung eines Zn2+-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, der eine direkte Messung desZn2+-Ausflusses ermöglicht.
Abstract
Übergangsmetalle wieZn2+-Ionen müssen aufgrund ihrer zellulären Toxizität streng reguliert werden. Bisher wurde die Aktivität von Zn2+-Transportern indirekt gemessen, indem das Expressionsniveau des Transporters unter verschiedenen Konzentrationen vonZn2+ bestimmt wurde. Dies geschah mit Hilfe der Immunhistochemie, der Messung von mRNA im Gewebe oder der Bestimmung des zellulärenZn2+-Spiegels. Mit der Entwicklung intrazellulärerZn2+-Sensoren werden die Aktivitäten von Zinktransportern derzeit hauptsächlich durch die Korrelation von Veränderungen des intrazellulären Zn 2+, die mit fluoreszierenden Sonden nachgewiesen werden, mit der Expression der Zn2+-Transporter bestimmt. Doch auch heute noch beobachten nur wenige Labore die dynamischen Veränderungen des intrazellulärenZn2+ und messen damit direkt die Aktivität von Zinktransportern. Ein Teil des Problems besteht darin, dass von den 10 Zinktransportern der ZnT-Familie, mit Ausnahme von ZnT10 (transportiert Mangan), nur Zinktransporter 1 (ZnT1) an der Plasmamembran lokalisiert ist. Daher ist es schwierig, die Transportaktivität mit Änderungen der intrazellulärenZn2+-Konzentration in Verbindung zu bringen. Dieser Artikel beschreibt einen direkten Weg zur Bestimmung der Zinktransportkinetik mit einem Assay, der auf einem zinkspezifischen Fluoreszenzfarbstoff, FluoZin-3, basiert. Dieser Farbstoff wird in seiner Esterform in Säugetierzellen geladen und dann aufgrund der zellulären Diesteraseaktivität im Zytosol gefangen. Die Zellen werden mit Zn2+ beladen, indem dasZn2+-Ionophor Pyrithion verwendet wird. Die ZnT1-Aktivität wird aus dem linearen Teil der Fluoreszenzreduktion nach der Zellauswaschung beurteilt. Die gemessene Fluoreszenz bei einer Anregung von 470 nm und einer Emission von 520 nm ist proportional zum freien intrazellulären Zn2+. Die Auswahl der Zellen, die ZnT1 exprimieren, die mit dem mCherry-Fluorophor markiert sind, ermöglicht es, nur die Zellen zu überwachen, die den Transporter exprimieren. Dieser Assay wird verwendet, um den Beitrag verschiedener Domänen des ZnT1-Proteins zum Transportmechanismus von humanem ZnT1 zu untersuchen, einem eukaryotischen Transmembranprotein, das überschüssiges Zink aus der Zelle extrudiert.
Introduction
Zink ist ein essentielles Spurenelement im zellulären Milieu. Es enthält ein Drittel aller Proteine und ist an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt, wie z. B. Katalyse1, Transkription2 und Strukturmotive3. Obwohl sie redoxinert sind, sind hohe Zinkkonzentrationen für die Zelle toxisch, weshalb kein Säugetierorganismus ohne das Vorhandensein von Mechanismen zur Regulierung der Zinkhomöostase überlebt hat. Bei Säugetieren sind drei Mechanismen für diesen Prozess verantwortlich: (1) Metallothionine, das sind zytosolische Cystein-reiche Proteine, die Zink mit hoher Affinität binden und so einen Überschuss an freiem zytosolischem Zink verhindern4; (2) Zrt/Irt-ähnliche Proteine (ZIPs), bei denen es sich um Zinktransporter handelt, die für den Zinkeinstrom in das Zytosol durch die Plasmamembran oder aus intrazellulären Organellen verantwortlich sind 4,5,6,7,8; und (3) ZnTs, die eine Säugetier-Untergruppe der ubiquitären Familie der Kationen-Diffusions-Facilitatoren (CDF) sind und Zinktransporter sind, da sie Zink aus dem Zytosol über die Plasmamembran oder in die intrazellulären Organellen extrudieren 4,5,6,7,8,9. Aufgrund der Bedeutung von Zink für den Zellstoffwechsel ist es wichtig, die zelluläre Zinkdynamik zu verstehen.
Bisherige Methoden zur Beurteilung der Zinkdynamik beruhten auf der Bewertung der Expressionsniveaus von mRNA unter verschiedenen Zinkbedingungen, indem sie mit zellulären Zinkmessungen von fixierten Geweben oder Zellen korreliertwurden 10,11,12. Zu diesen Methoden gehören der chemische Nachweis und die immunhistochemische Färbung. Diese Methoden liefern jedoch nur indirekte Messungen und bestimmen somit nur eine Offline-Korrelation zwischen der intrazellulären Zinkkonzentration und der Expression von Zinktransportern. Folglich können diese Methoden keine Parameter ableiten, die eine hohe zeitliche Auflösung erfordern.
Für eine direktere Messung desZn2+ -Transports werden radioaktive Isotope von Zink13 verwendet. Diese Methode beruht auf der Messung von radioaktiv markiertem Zn2+ , um den Zinktransport und seine Kinetik zu überwachen. Aufgrund der Bedeutung von Zink für die zelluläre Homöostase regulieren jedoch mehrere zelluläre Prozesse die intrazelluläre Zinkkonzentration. Dazu gehören die extrazelluläre Bindung und mehrere Transportsysteme, die zusammenarbeiten, um eine strenge Kontrolle über den intrazellulärenZn2+ -Spiegel aufrechtzuerhalten. Durch die Kombination dieser Prozesse entsteht ein erhebliches Hintergrundrauschen, das es schwierig macht, einzelne zinkbezogene Transportfunktionen zu testen.
Dieser Artikel demonstriert eine Methode zur direkten Überwachung der Zinktransportrate durch Messung der intrazellulären Konzentration von freiem Zink mit einem zinkspezifischen Fluoreszenzfarbstoff, FluoZin-3. Der Farbstoff hat eine hohe Spezifität fürZn2+ und geringe Interferenzen durch andere zweiwertige Kationen, wie z. B. Kalzium. Darüber hinaus gelangt es in seiner Esterform durch nichtionische Diffusion in die Zellen und wird dann aufgrund der Aktivität der intrazellulären Diesterase gefangen. Daher korreliert seine Fluoreszenz in erster Linie mit der Konzentration des freien zytosolischen Zinks. Diese Experimente wurden durchgeführt, um die Struktur-Funktions-Beziehung von Zinktransporter 1 (ZnT1), einem Mitglied der ZnT-Familie, zu untersuchen.
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Protocol
1. Zelltransfektion
- Kultur HEK293T Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin/Streptomycin (siehe Materialtabelle) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C/5 % CO2 bis zum Zusammenfluss auf einer 10 cm großen Platte (8,8 x 106 Gesamtzellen).
- Legen Sie ein 13-mm-Deckglas in jede der Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Verdünnen Sie 0,44 x 106 trypsinisierte Zellen aus Schritt 1.1 in 12 ml vollständigem DMEM. Mischen Sie gut, indem Sie drei- bis fünfmal auf und ab pipettieren. Füllen Sie jede Vertiefung mit 1 ml der gemischten Lösung. In einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C/5 % CO2 über Nacht anbauen.
- Ersetzen Sie das vollständige DMEM in jeder Vertiefung durch 1 ml serumfreies DMEM (siehe Materialtabelle) in jeder Vertiefung. Legen Sie die 12-Well-Platte wie in Schritt 1.1 wieder in den befeuchteten Inkubator.
- Verdünnen Sie für jede Transfektionsvertiefung 1 μg pAAV2-Plasmid, das das interessierende Protein enthält, das mit dem fluoreszierenden mCherry-Protein markiert ist (Zusatzdatei 1), in 100 μl serumfreiem DMEM in einem 1,5-ml-Röhrchen.
- Fügen Sie 3 μg Polyethylenimin (PEI, siehe Materialtabelle) zu 100 μl serumfreiem DMEM pro Transfektion hinzu, wobei jede Transfektion in ein anderes 1,5-ml-Röhrchen gegeben wird. Das Plasmid:PEI-Verhältnis sollte 1:3 (μg:μg) betragen.
- Beide Röhrchen aus Schritt 1.4 und Schritt 1.5 10 s lang vortexen und mindestens 5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen.
- Mischen Sie einen Teil (100 μl pro Well) der DNA-Lösung aus Schritt 1.4 mit einem Teil (100 μl pro Well) der PEI-Lösung aus Schritt 1.5. Die endgültige Lösung wird 10 s lang vorgewirbelt und bei Raumtemperatur mindestens 20 Minuten und bis zu 6 Stunden ruhen gelassen.
- Nehmen Sie die 12-Well-Platte aus dem Inkubator. Die endgültige Lösung aus Schritt 1.7 vortexen und 200 μl in jede der Vertiefungen in der 12-Well-Platte aus Schritt 1.3 geben. Legen Sie die 12-Well-Platte wieder in den befeuchteten Inkubator (Schritt 1.1).
- Ersetzen Sie nach 3 Stunden das Medium in jeder Vertiefung durch 1 ml vollständiges DMEM. Legen Sie die 12-Well-Platte wie in Schritt 1.1 wieder in den befeuchteten Inkubator.
- Nach 2 Tagen wird die transfizierte Zellkultur aus dem 37 °C/5 % CO2 -Inkubator entnommen und mit 10-facher Vergrößerung auf ein inverses Fluoreszenzmikroskop gelegt.
- Fokussieren Sie mit dem Fokusrad des Mikroskops auf die Zellen, während Sie Hellfeldlicht verwenden.
- Wechseln Sie zu den fluoreszierenden mCherry-Anregungs- (587 nm) und Emissionswellenlängen (610 nm) und schalten Sie das Hellfeldlicht aus. Überprüfen Sie die Fluoreszenz der Zellen, um die Expression von ZnT1 mCherry zu bestätigen.
- Bereiten Sie die Farbstoffbeladungslösung vor.
- Ein Aliquot von 4 μl Zink-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff (siehe Materialtabelle) in seiner Acetoxymethyl (AM)-Ester-Form, gelöst in DMSO (1 μg/μl), wird aus einem lichtgeschützten Material entnommen, das in einem Gefrierschrank von −20 °C gelagert wird. Diese Form ermöglicht es dem Farbstoff, durch einfache Diffusion durch die Plasmamembran in die Zelle einzudringen.
- 4 μl 10%ige Pluronsäure (oder 2 μl 20%ige Pluronsäure, siehe Materialtabelle) werden zu dem Aliquot aus Schritt 1.13.1 gegeben. Mischen Sie die Lösung gut, indem Sie dreimal auf und ab pipettieren, und geben Sie dann alle 8 μl in ein 1,5-ml-Röhrchen.
- 750 μl Ringer-Lösung (intern hergestellt, siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung), ergänzt mit 1 mg/ml (~0,1 %) Rinderserumalbumin, in das Röhrchen aus Schritt 1.13.2 geben und kräftig vortexen. Fügen Sie weitere 750 μl derselben Lösung hinzu und wirbeln Sie erneut vor, um eine maximale Durchmischung zu gewährleisten.
- 750 μl der endgültigen Lösung aus Schritt 1.13.3 in zwei Vertiefungen in einer neuen 6-Well-Kulturplatte zugeben. Mit Alufolie abdecken.
HINWEIS: Um ein Bleichen zu vermeiden, wird die 6-Well-Platte ab diesem Schritt immer mit Aluminiumfolie abgedeckt. - Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette bis zu vier replizierte Deckgläser von der transfizierten Zellkulturplatte und legen Sie sie in die erste gefüllte Vertiefung (bis zu vier Objektträger pro Vertiefung) der neuen 6-Vertiefungsplatte aus Schritt 1.14. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite gefüllte Mulde.
HINWEIS: Alle Deckgläser in derselben gefüllten Vertiefung müssen aus demselben Zustand stammen. Jede Bohrung kann jedoch unterschiedliche Bedingungen enthalten. - Mit Alufolie abdecken und 15-20 Minuten vorsichtig schütteln.
- Entfernen Sie die Farbstoffbeladungslösung und ersetzen Sie sie durch eine neue Waschlösung aus Ringer-Plus-Albumin, wie in Schritt 1.13.3 verwendet. Mit Alufolie abdecken. Nochmals 20 Min. schütteln lassen. Dies ermöglicht die Spaltung des AM-Esters durch die intrazellulären Esterasen.
2. Vorbereitung des Mikroskops
- Ordnen Sie die erforderlichen Werkzeuge (siehe Materialtabelle) wie erwähnt an: ein inverses Fluoreszenzmikroskop, das GFP- und mCherry-Fluorophore nachweisen kann, ein Perfusionssystem, das den Wechsel zwischen mindestens zwei Lösungen ermöglicht, ein Absaugsystem und eine Perfusionskammer.
- Schalten Sie das Mikroskop, die Lichtquelle und die Kamera ein. Schalten Sie das Absaugsystem ein.
- Waschen Sie das Perfusionssystem. Waschen Sie die erste Kammer mit Ringer-Lösung und die zweite Kammer mit Ringer-Lösung, die 7 μM Zinklösung enthält, ergänzt mit 7 μM Pyrithion (Zinkionophor, siehe Materialtabelle). Um Luftblasen oder Lücken zu vermeiden, lassen Sie etwas Flüssigkeit in jeder Kammer.
HINWEIS: Da beide Behälter mit demselben Schlauch verbunden sind, der mit der Perfusionskammer verbunden ist, stellen Sie immer sicher, dass das gemeinsame Segment mit der Ringer-Lösung gewaschen wird. - Schließen Sie die Wasserhähne und füllen Sie die entsprechenden Kammern mit Ringer-Lösung und Ringer-Zink-Lösung, wie in Schritt 2.3 beschrieben.
3. Probenvorbereitung
- Nehmen Sie die Perfusionskammer und platzieren Sie sie mit der schmalen Seite der Rille nach oben.
HINWEIS: Die Rille ist ein Loch in der Mitte der Perfusionskammer. Es ermöglicht der Perfusionsflüssigkeit den Zugang zu den Zellen. Eine Seite der Nut ist schmal und die gegenüberliegende Seite breit. - Tragen Sie ein Dichtungssilikon (siehe Materialtabelle) um die Nut herum auf. Reinigen Sie das Dichtungssilikon mit einer Pipettenspitze von der Nut.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass um die Nut herum genügend Silikondichtung vorhanden ist, um ein 22-mm-Deckglas abzudichten. - Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette ein Deckglas aus der Waschlösung und legen Sie es mit den Zellen nach unten auf die Rille. Auf diese Weise werden die Zellen während des Experiments der Lösung ausgesetzt, die die Rille durchströmt.
- Legen Sie ein 22-mm-Deckglas auf das 13-mm-Deckglas und ziehen Sie es mit der Pinzette fest. Achten Sie darauf, dass die Deckgläser nicht reißen.
- Drehen Sie die Kammer um und drücken Sie darauf, um alle vorhandenen Flüssigkeiten freizusetzen. Füllen Sie die Nut mit 100 μl der Waschlösung von Ringer und drücken Sie erneut, um sicherzustellen, dass keine Leckagen entstehen.
HINWEIS: Wenn eine Leckage festgestellt wird, tragen Sie ein Dichtmittel an der Stelle der Leckage auf und führen Sie einen erneuten Test durch. - Montieren Sie die Perfusionskammer auf der Plattform und sichern Sie sie. Platzieren Sie die Perfusions- und Saugschläuche, um eine Perfusion über die Zellen in der Rille zu ermöglichen.
- Ändern Sie die Perfusionsrate auf ca. 2 ml/min und schalten Sie die Perfusion der Ringerlösung ein. Stellen Sie sicher, dass das Perfusionssystem ohne Leckagen oder Überschwappen funktioniert.
4. Vorbereitung der Messung
- Öffnen Sie die Imaging-Software (siehe Materialtabelle) mit einem Doppelklick auf das Symbol. Melden Sie sich mit den entsprechenden Anmeldeinformationen an. Wählen Sie die angeschlossene Kamera aus und drücken Sie OK.
- Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops mit der Taste auf der linken Seite des Mikroskops auf 10x ein.
- Wählen Sie die Live-Ansicht und verwenden Sie den Joystick, um die Plattform zu bewegen, um sich auf die Zellen in der Rille zu konzentrieren.
- Schalten Sie während der Perfusion das Licht aus und ändern Sie die Wellenlänge auf mCherry, indem Sie die entsprechende Taste in der Benutzeroberfläche drücken. Stellen Sie den Fokus mit dem Fokussierrad des Mikroskops ein.
- Sobald das Mikroskop auf die Zellen fokussiert ist, bewegen Sie die Plattform mit dem Joystick, um die Auswahl der entsprechenden Zellfelder zu ermöglichen.
HINWEIS: Ein geeigneter Bereich gilt als Bereich mit mindestens 10 Zellen für eine ROI und einem leeren Bereich für den Hintergrund. - Wählen Sie das Dropdown-Menü "ROIs ein-/ausschalten" aus, und wählen Sie " Zirkuläre ROIs zeichnen".
- Zeichnen Sie ROIs von Zellclustern mit den mCherry-exprimierenden Zellen (zeigt die Expression von ZnT1 an).
- Klicken Sie in der gleichen Symbolleiste wie in Schritt 4.6 auf die Schaltfläche Hintergrund-ROIs ein-/ausschalten und passen Sie die Position und Größe der Hintergrund-ROI auf einen Bereich ohne Zellen an.
- Überprüfen Sie die mCherry- und EGFP-Wellenlängen, um sicherzustellen, dass sich keine Zellen im ausgewählten Hintergrund-ROI befinden.
ANMERKUNG: Die Wellenlängen wurden so eingestellt, dass mCherry eine Anregungswellenlänge von 520 nm und eine Emissionswellenlänge von 610 nm und EGFP eine Anregungswellenlänge von 470 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm verwendete.
- Überprüfen Sie die mCherry- und EGFP-Wellenlängen, um sicherzustellen, dass sich keine Zellen im ausgewählten Hintergrund-ROI befinden.
- Wählen Sie die Unterregisterkarte Wellenlänge (λ) aus. Markieren Sie das entsprechende Kontrollkästchen und stellen Sie sicher, dass die GFP-Wellenlänge vorhanden und das Kontrollkästchen aktiviert ist. Wenn nicht, fügen Sie es hinzu und markieren Sie es.
- Wählen Sie die Unterregisterkarte Dauer aus. Definieren Sie das Messintervall als alle 5 s, und ändern Sie die Anzahl der Intervalle entsprechend der Versuchsdauer.
- Klicken Sie im Abschnitt Fokus auf dem Mikroskoppanel unter dem Okular auf die Schaltfläche Ein , um das perfekte Fokussystem (PFS) zu aktivieren.
- Stellen Sie mit dem PFS-Fokusrad den Fokus ein. Stellen Sie in der Softwareschnittstelle unter ND-Erfassung sicher, dass PFS ein aktiviert ist.
- Klicken Sie auf Jetzt ausführen.
5. Experimenteller Ablauf
- Beginnen Sie mit einer 90-Sekunden-Baseline-Periodenmessung mit der Ringer-Lösungsperfusion.
- Schalten Sie nach Ablauf des Ausgangszeitraums die Perfusion der Ringer-Lösung aus und dann die Zinklösungsperfusion des Ringers ein. Markieren Sie den Wechsel der Lösung, indem Sie auf die rote Flagge unten rechts in der Hauptoberfläche klicken. Es wird erwartet, dass ein Anstieg der Fluoreszenz auftritt.
- Sobald der Fluoreszenzanstieg zu sättigen beginnt, wechseln Sie wieder zur Perfusion mit Ringer-Lösung. Schalten Sie die Perfusion der Ringer-Zinklösung aus und dann die Perfusion der Ringer-Lösung.
- Warten Sie, bis die Testzeit abgelaufen ist. Eine spürbare, aber stetige Abnahme der Fluoreszenz ist zu erwarten, wenn das ZnT1 richtig funktioniert.
6. Datenexport
- Um die Daten mit Basisliniensubtraktion zu exportieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Basislinie subtrahieren und sehen Sie sich die Änderungen im "ND-Erfassungsfenster" an.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren in der Softwareoberfläche im "ND-Erfassungsfenster". Es öffnet sich ein Excel-Datenblatt. Speichern Sie am gewünschten Speicherort.
7. Datenanalyse
- Erstellen Sie für jeden ROI eine durchschnittliche Baseline-Fluoreszenz aus den ersten 90 bis 100 Sekunden.
- Geben Sie die für jede ROI berechnete Fluoreszenz als Prozentsatz des Hintergrunds für diese ROI an.
- Erstellen Sie einen Zeilendurchschnitt aller ROIs, und stellen Sie das Ergebnis als Liniendiagramm dar. Dadurch entsteht ein Durchschnitt aller ROIs in Abhängigkeit von der Zeit.
- Wählen Sie mit der linearen Anpassungsfunktion die Anfangsrate für die Abnahme der Fluoreszenz nach dem Waschen mit der Ringer-Lösung. Der Steigungswert der Gleichung korreliert mit der Transportgeschwindigkeit.
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Representative Results
ZnT1 ist ein Zinktransporter von Säugetieren, der sich auf der Zellplasmamembran13 befindet. Es ist ein Mitglied der Familie der Kationendiffusions-Facilitatatoren (CDF), die Zink aus dem Zytosol in das extrazelluläre Millieu extrudieren14. ZnT1 hat eine Zwei-Domänen-Architektur: die Transmembrandomäne, die die Ionen durch die Membran transportiert, und eine C-terminale Domäne14. Im Gegensatz zu anderen bekannten CDF-Proteinen besitzt ZnT1 eine erweiterte unstrukturierte C-terminale Domäne (USCTD). Die Rolle der USCTD ist derzeit nicht bekannt. Wir haben das obige Protokoll verwendet, um ZnT1 WT mit ZnT1 ohne die USCTD zu vergleichen, um seine Beteiligung an der Zinktransportaktivität zu bewerten.
HEK 293T-Zellen wurden mit dem pAAV2-Plasmid, das entweder ZnT1 WT oder ZnT1 ohne den unstrukturierten C-Terminus (ΔUSCTD) enthielt, transfiziert und die Transportaktivitätsrate wie oben beschrieben getestet. Ergänzende Abbildung 1 zeigt, dass beide Versionen von ZnT1 ohne Probleme exprimiert und auf der Plasmamembran lokalisiert werden. Abbildung 1 zeigt die typischen Ergebnisse für ein Beispiel eines solchen Experiments. Ein Anstieg der Fluoreszenz ist das Ergebnis eines Anstiegs der intrazellulären Zn 2+ Konzentration, während eine Abnahme das Ergebnis der Aktivität von ZnT1 ist, das Zn2+ durch die Zellmembran transportiert (einzelne Diagramme, einschließlich Standardfehler, sind in ergänzenden Abbildung 2 und ergänzenden Abbildung 3 zu finden). Aus dieser Abbildung geht hervor, dass ZnT1 WT eine glattere Fluoreszenzkurve aufweist als die Mutante. Dies ist jedoch kein inhärentes Unterscheidungsmerkmal, sondern hängt mit der Variabilität der zellulären Reaktionen auf die Zinkbelastung zusammen, die in früheren Experimenten beobachtet wurde. Abbildung 2 zeigt einen Boxplot, der die Ergebnisse von 15-17 solcher Experimente zusammenfasst. Aus der Abbildung geht hervor, dass ΔUSCTD im Vergleich zu WEA eine größere Streuung der Transportraten aufweist. Dies kann zwar auf die bereits erwähnte Variabilität der zellulären Reaktion zurückgeführt werden, könnte aber auch auf einen funktionellen Unterschied hindeuten. Zum Beispiel kann es implizieren, dass das ZnT1 USCTD-Segment ein Modulator der Transportrate ist. Offensichtlich gibt es keinen sichtbaren Unterschied zwischen den Zn2+ Extrusionsaktivitäten von WT und ΔUSCTD. Basierend auf der statistischen Analyse waren die Daten nicht normalverteilt (WT-Datensatz, Shapiro-Wilk-Test15, Statistik = 0,72404, p-Wert = 0,0004), so dass zwei nicht-parametrische Stichprobentests für Vergleiche zwischen den Datensätzen verwendet wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass es keinen statistischen Unterschied zwischen den Transportraten gab (Mann-Whitney-16-U-Test: U = 132, Z = 0,15105, Asymp. Prob>|U| = 0,87994; Kolmogorov-Smirnov17 Test: D = 0,27059, Z = 0,76384, Exact Prob>|D|= 0,5161).
Aufgrund der erheblichen energetischen Kosten für die Bildung der unstrukturierten Erweiterung (~80 Aminosäuren) ist es vernünftig anzunehmen, dass diese Domäne eine zelluläre Funktion erfüllt. Eine zelluläre Funktion, die mit dieser Domäne in Verbindung steht, konnte bisher jedoch nicht identifiziert werden. Diese Domäne ist einzigartig für ZnT1 und kommt in keinem anderen Mitglied der ZnT-Familie vor. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass sich ZnT1 im Gegensatz zu anderen ZnTs an der Plasmamembran befindet, während alle anderen Mitglieder mit Ausnahme von ZnT10 in inneren Organellen exprimiert werden.
Die hier gezeigten Rohdaten und nachfolgenden Diagramme basieren auf 5-s-Intervallmessungen der Fluoreszenz, die durch den zinkempfindlichen Farbstoff verursacht wird. Das bedeutet, dass in einem relativ kurzen Zeitrahmen (Minuten) eine Visualisierung des zeitabhängigen Zinktransports mit hoher zeitlicher Auflösung erzeugt werden kann. Die Analyse sollte eine Normalisierung der Basisperiode beinhalten, da der Farbstoff vor der Zinkbeladung in die Zellen geladen wird und eine anfängliche intrazelluläre Fluoreszenz aufweisen kann, die durch eine kleine Menge an freiem Zink verursacht wird. Zudem wird der Zinkfarbstoff erst nach der Spaltung durch die intrazelluläre Esterase fluoreszierend aktiv. Daher wird empfohlen, dem Entesterungsprozess für den größten Teil des Farbstoffs etwas Zeit zu lassen, um unregelmäßige Fluoreszenzmuster zu vermeiden, die durch die Spaltung des Farbstoffesters während des gesamten Experiments verursacht werden.
Abbildung 1: Zn2+ Extrusionsaktivitäten von WT und ΔUSCTD unter Verwendung des Zinktransport-Assays. Die x-Achse ist die Zeit in Sekunden. Die y-Achse ist die Fluoreszenzänderung, ausgedrückt als Prozentsatz der Basislinie. Die Liniendiagramme zeigen die Fluoreszenzänderung in Abhängigkeit von der Zeit. Die Daten werden über >10 ROIs gemittelt. Einzelne Diagramme mit Standardfehler sind in den ergänzenden Abbildungen 2 und 3 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vergleich der Aktivitäten von ZnT1 WT und ΔUSCTD in Form eines Boxplots. Jeder Datenpunkt stellt ein einzelnes Experiment dar. Die schwarze Linie zeigt den Medianwert an. Das hohle quadratische Kästchen zeigt den Mittelwert an. Die y-Achse zeigt die Änderung des Basislinienprozentsatzes pro Sekunde an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: HEK 293T-Zellen, transfiziert mit (A) ZnT1 WT oder (B) ZnT1 ΔUSCTD, stimuliert in den mCherry-Anregungs- (520 nm) und Emissionswellenlängen (610 nm). In beiden Fällen gibt es eine Expression und Membranlokalisation der ZnT1-Variante. Die Vergrößerung des Mikroskops beträgt 20x. Die Belichtungszeit beträgt 100 ms. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: ZnT1 WT Zn2+ Transportaktivität mit dem Standardfehler visualisiert. Die x-Achse ist die Zeit in Sekunden. Die y-Achse ist die prozentuale Fluoreszenzänderung gegenüber der Basislinienfluoreszenz. Die schwarze Linie ist die mittlere Fluoreszenzänderung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ Transportaktivität mit dem Standardfehler visualisiert. Die x-Achse ist die Zeit in Sekunden. Die y-Achse ist die prozentuale Fluoreszenzänderung gegenüber der Basislinienfluoreszenz. Die rote Linie ist die mittlere Fluoreszenzänderung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 1: pAAV2-Plasmidsequenz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die oben beschriebene Methode ermöglicht die direkte Messung der intrazellulären Zinkkonzentration mit hoher zeitlicher Auflösung. Im Vergleich zu anderen Methoden kann diese Methode, bei der Veränderungen des intrazellulärenZn2+ überwacht werden, das Hintergrundrauschen erheblich verringern. Darüber hinaus eliminiert die Selektivität des Farbstoffs für Zink mögliche Kreuzwechselwirkungen mit anderen Metallkationen18,19. Schließlich ermöglicht das Fehlen einer unmittelbaren Zytotoxizität die Prüfung lebender zellulärer Prozesse19.
Diese Methode hat jedoch bestimmte Einschränkungen. Erstens kann der Nachweis intrazellulärer Dynamik mit diesem Protokoll relativ schwierig sein, da der bei dieser Methode verwendete Farbstoff so konzipiert ist, dass er in der Zelle gefangen wird, aber nicht auf Regionen oder bestimmte Prozesse gerichtet werden kann. Andere Fluoreszenzfarbstoffe können auf einen bestimmten Bereich in den Zellen gerichtet werden, haben aber leider einen viel geringeren Dynamikbereich20. Zweitens bewirkt die Belichtung des Farbstoffs eine Abnahme der Fluoreszenz aufgrund des Bleichens, was die Zeit der Lichteinwirkung und damit das aktive Fenster für die Durchführung des Experiments einschränkt. Drittens ist die Farbstoffbeladung in diesem Protokoll umständlich und zeitaufwändig im Vergleich zur Verwendung anderer Farbstoffe, insbesondere genetisch kodierter Farbstoffe21. Schließlich tritt der Farbstoff auch nach der Spaltung der Ester aus, was zu einerZn2+-unabhängigen Reduktion der Fluoreszenz22 führt.
Es sollten mehrere Schritte unternommen werden, um den Erfolg des Experiments sicherzustellen. Erstens, da die Transfektion ungleich verteilt sein kann, sollten die ausgewählten Zellen das interessierende Protein enthalten. Um ein Ausbleichen von Farbstoffen zu vermeiden, ist es wichtig, die beladenen Zellen vor Licht zu schützen. Bei der Durchführung des Experiments sollte die Perfusionsrate ausreichen, um das Experiment abzuschließen, ohne dass sich die Zellen vom Deckglas lösen. Bei mehreren Läufen wird empfohlen, die gleichen Reservoirs für die Ringer-Lösung und die Ringer-Zink-Lösung zu halten. Die Farbladezeit und die Waschzeit können nach ersten Versuchen eingestellt werden. Die Zinkbelastung der Zellen durch Perfusion mit Pyrithion kann zwischen 1 min und 5 min dauern, wie durch die Überwachung derZn2+-induzierten Fluoreszenz mit der Zeit festgestellt wird.
Trotz dieser Schwierigkeiten ermöglicht uns diese Methode zum ersten Mal, die Dynamik des Zn2+ Extrusionsprozesses zu untersuchen. Es vereinfacht den Prozess und schafft eine direkte Möglichkeit, kausale Zusammenhänge im Vergleich zu den bisherigen Methoden besser herzustellen23,24.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Raz Zarivach wird von der Israel Science Foundation unterstützt (Grant Nr. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef und Arie Moran werden von der Israel Science Foundation unterstützt (Grant Nr. 2047/20). Wir danken Daniel Gitler und seiner Gruppe an der Ben-Gurion-Universität für die Zusammenarbeit, Unterstützung und Expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
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