Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Microarray Polymer Profiling (MAPP) för glykananalys med hög genomströmning

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65443
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1
1Department of Biology, School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3Department of Plant and Soil Sciences, Faculty of Agriculture, Chiang Mai University

Summary

Microarray polymer profiling (MAPP) är en teknik med hög genomströmning för kompositionsanalys av glykaner i biologiska prover.

Abstract

Microarray polymer profiling (MAPP) är en robust och reproducerbar metod för att systematiskt bestämma sammansättningen och den relativa förekomsten av glykaner och glykokonjugat i en mängd olika biologiska prover, inklusive växt- och algvävnader, livsmedelsmaterial och prover från människor, djur och mikrober. Microarray-tekniken stöder effektiviteten av denna metod genom att tillhandahålla en miniatyriserad, högkapacitetsscreeningsplattform, vilket gör det möjligt att karakterisera tusentals interaktioner mellan glykaner och mycket specifika glykanriktade molekylära sonder samtidigt, med endast små mängder analyter. Ingående glykaner fraktioneras kemiskt och enzymatiskt innan de extraheras sekventiellt från provet och immobiliseras direkt på nitrocellulosamembran. Glykansammansättningen bestäms genom fastsättning av specifika glykanigenkännande molekylära sonder till de utpressade och tryckta molekylerna. MAPP är ett komplement till konventionella glykananalystekniker, såsom monosackarid- och kopplingsanalys och masspektrometri. Molekylära sonder som känner igen glykaner ger dock insikt i de strukturella konfigurationerna av glykaner, vilket kan hjälpa till att belysa biologiska interaktioner och funktionella roller.

Introduction

Glykaner är allestädes närvarande i alla livets domäner och uppvisar oöverträffad mångfald i struktur och funktion jämfört med andra makromolekyler1. Men på grund av deras komplexitet, variabilitet i biosyntes och glykosidbindningar, och bristen på lämpliga metoder för att dissekera glykanstrukturer, är vår förståelse av denna mångfald i strukturer och funktionerrelativt begränsad.

Många glykananalystekniker är destruktiva och kräver nedbrytning av glykaner i deras beståndsdelar monosackarider, vilket kan dölja relevanta tredimensionella och biologiska sammanhang3. Omvänt känner monoklonala antikroppar (mAbs), kolhydratbindningsmoduler (CBM), lektiner, virala agglutininer och mikrobiella adhesiner, kända som glykanigenkännande molekylära sonder (GRMP)4, igen och binder till specifika epitoper och kan användas som verktyg för att detektera och skilja mellan glykaner inom komplexa multiglykanmatriser 5,6.

Här presenterar vi microarray polymer profiling (MAPP), en snabb, mångsidig och icke-destruktiv metod för glykananalys som är tillämplig på ett brett spektrum av biologiska prover. Metoden syftar till att tillhandahålla en robust och högkapacitetsteknik för analys av glykaner från olika biologiska och industriella/kommersiella system. MAPP förenar igenkänningsspecificiteten hos glykanriktade molekylära prober med reproducerbar, högpresterande mikroarrayscreeningsteknik för att möjliggöra att tusentals molekylära interaktioner kan profileras parallellt. Resultatet av detta tillvägagångssätt är diagnostisk insikt i sammansättningen och den relativa förekomsten av glykaner i ett prov eller en vävnad av intresse.

MAPP kan användas som en fristående, fristående metod, eller i kombination med andra biokemiska tekniker, såsom immunofluorescensmikroskopi 7,8,9 och monosackarid- eller bindningsanalys10,11. Tekniken kan också användas för att kartlägga epitopspecificiteter hos nya GRMP, med hjälp av arrayer tryckta med rena och strukturellt väldefinierade oligosackaridstandarder12. En stor fördel med MAPP jämfört med andra metoder, såsom enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA), är dess kompatibilitet med små provvolymer13,14. Dessutom erbjuder MAPP betydligt högre genomströmningsanalys15 och ger en effektiv form av provkonservering, eftersom tryckta prover är torra och stabila när de immobiliseras på nitrocellulosa16.

Bindningen av GRMP är i allmänhet beroende av närvaron av ett antal sammanhängande sockerrester som tillsammans bildar ett bindningsställe (epitop) som är unikt för en viss polysackaridklass (xylan, mannan, xyloglukan, etc.) 17. Däremot kan de enskilda sockerresterna (xylos, mannos, glukos) som kvantifieras med hjälp av de flesta biokemiska tekniker, till exempel monosackaridsammansättning eller metyleringsanalys, vara komponenter i flera polysackaridklasser och därför svåra att klassificera18.

MAPP har utvecklats som svar på ett teknikgap, nämligen förmågan att snabbt analysera flera glykaner från en mängd olika källor med hjälp av små mängder material. MAPP drar nytta av den omfattande repertoar av GRMP som har utvecklats och karakteriserats under de senaste tre decennierna 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 . Utvecklingen av MAPP har varit en iterativ process, där tekniken stadigt förfinats och optimerats. Det finns nu en betydande mängd litteratur som beskriver tillämpningen av MAPP på olika naturliga och industriella system där glykaner spelar centrala roller 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Här beskriver vi det aktuella läget för MAPP.

Protocol

De viktigaste experimentella stadierna av MAPP-metoden sammanfattas i figur 1.

1. Beredning av prover

OBS: Här tillämpas metoden på växtvävnader i illustrativt syfte. Växterna som valdes ut var Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon och flera thailändska mangosorter (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok och Nga). Växterna valdes ut för sin kommersiella betydelse. Bearbetning av dem för mänsklig konsumtion genererar för närvarande underutnyttjat agroindustriellt avfall, vilket kan utgöra en källa till mervärdesprodukter, inklusive rena glykaner. Således användes MAPP för att karakterisera glykansammansättningen av avfallsanläggningens biomassa för bioprospekteringsändamål.

  1. Dela upp växtmaterialet i olika vävnader (t.ex. rot, stam och blad).
  2. Torka växtvävnaderna i varmluftsugn vid 40 °C i 12-24 timmar (minska/öka tiden i enlighet med provet). Alternativt kan du snabbfrysa proverna i flytande kväve och därefter frysa dem i ~4 dagar.
  3. Homogenisera proverna till ett fint pulver med hjälp av en mortelstöt eller en mekanisk vävnadsmätare (se materialtabell) med ett kullager i varje rör.
    OBS: För färsk växtvävnad rekommenderas torkning eller frystorkning före homogenisering. I allmänhet räcker det med homogenisering med en mortelstöt och murbruk för de flesta torra prover. För särskilt motståndskraftiga prover, såsom spannmål, baljväxter och bearbetade livsmedel som pasta, kan snabbfrysning i flytande kväve öka hastigheten och effektiviteten för provhomogenisering. Vi har funnit att mekanisk homogenisering är kompatibel med nästan alla provtyper, är betydligt snabbare och mindre arbetskrävande och effektivt minimerar risken för korskontaminering av prover från upprepad användning av samma utrustning (dvs. mortelstöt och murbruk).

2. Beredning av alkohololösliga återstoder (AIR)

  1. Tillsätt 1,5 ml 70 % (volym/volym) etanol till 50–100 mg lufttorkat och homogeniserat provmaterial.
  2. Blanda ordentligt och centrifugera sedan vid 10 000 x g i 10 minuter i rumstemperatur. Kassera den resulterande supernatanten med en pipett och behåll pelleten.
  3. Tillsätt 1,5 ml metanol och kloroform (1:1 [v/v]) till den återstående pelleten. Vortex, centrifugera och kassera supernatanten enligt steg 2.2.
  4. Tillsätt 1,5 ml 100 % aceton till den återstående pelleten. Vortex, centrifugera och kassera supernatanten enligt steg 2.2.
  5. Placera den resulterande pelleten antingen över natten i ett dragskåp så att kvarvarande aceton kan avdunsta eller i en vakuumcentrifug tills den är torr.
    OBS: AIR-material kan förvaras i rumstemperatur tills det behövs.

3. Glykanextraktion

OBS: Om möjligt, utför alla extraktionssteg i en vävnadslysör med ett kullager i varje rör för att underlätta resuspension. Om en vävnadslysare inte är tillgänglig kan extraktioner utföras istället med kontinuerlig omrörning eller skakning. Det kan vara nödvändigt att förlänga extraktionstiden om detta inte är möjligt.

  1. Tillsätt 30 μL/mg 50 mM cyklohexandiamintetraättiksyra (CDTA ) till 10 mg AIR-material, pH 7,5.
  2. Skaka vid 27 Hz i 2 min, följt av 10 Hz i 2 h.
  3. Centrifugera vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Behåll supernatanten, tillsätt den i ett sterilt mikrocentrifugrör och förvara den vid 4 °C i en roterande skakapparat.
  4. Tillsätt 30 μL/mg 4 M NaOH + 0,1 % (w/v) NaBH4 till restpelleten.
    VARNING: NaBH4 är giftigt vid förtäring. Använd personlig skyddsutrustning (PPE). Hanteras under dragskåp. Undvik dammbildning. Undvik att andas in damm. Låt inte produkten komma i kontakt med vatten.
  5. Upprepa steg 3.2 till 3.3. Tvätta restpelleten två eller tre gånger med dH2O för att ta bort kvarvarande NaOH.
  6. Tillsätt 30 μL/mg cellulas (helst GH5-endo-1,4-β-glukanas, i lämplig enzymbuffert enligt tillverkarens rekommendationer, se materialtabell) till pelleten och inkubera vid enzymets optimala temperatur i 16 timmar.
  7. Centrifugera proverna vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Behåll supernatanten, överför den till rena mikrocentrifugrör och förvara vid 4 °C i en roterande skakapparat. När proverna har extraherats måste de skrivas ut så snart som möjligt.
  8. Centrifugera alla lagrade extrakt igen vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
    OBS: Proverna måste vara fria från partiklar och skräp. Passera genom ett 0,2 μm spinnfilter före mikroarrayutskrift om det behövs. Särskilt viskösa prover är inkompatibla med mikroarrayanalys eftersom mikroarrayerkapillärerna och skrivhuvudet lätt kan bli igensatta. Som en allmän regel bör användarna kunna pipettera alla prover som är avsedda för utskrift med en standardpipett för låg volym.

4. Utarbetande av standarder

  1. Bered 1 mg/ml lösningar av definierade glykanstandarder (tabell 1) i steril dH2O. Om du använder pachyman som standard, lös istället i 4 M NaOH och neutralisera med isättika efter solubilisering.
  2. Förvara den beredda standarden över natten vid 4 °C i en roterande skakapparat för att möjliggöra fullständig upplösning.
  3. Centrifugera alla standarder i 10 minuter vid 10 000 x g vid 4 °C för att pelletera eventuellt skräp. Den resulterande supernatanten används för efterföljande tryckning.

5. Utskrift av mikroarrayer

  1. Bered en 1:20 (v/v) utspädning av svart indiskt bläck/ritbläck i glycerolsystembuffert (GSB; kombinera 47 % glycerol, 52,9 % dH2O, 0,06 % Triton X-100 och 0,04 % biocid [0,15 %-0,17 % kopparnitrat och 1,4 %-2,0 % magnesiumnitrat i vatten] och filtersterilisera) (se materialtabell) och centrifugera i 10 minuter vid 15 000 x g (rumstemperatur).
    OBS: Bläcklösning är nödvändig för att skapa en övre och nedre kant runt de utskrivna proverna, så att de tryckta mikroarrayerna kan detekteras visuellt på membranet. Bläcklösningen kommer dock sannolikt att innehålla sediment. Alla lösningar måste vara fria från partiklar för utskrift, så undvik att störa sedimentet vid pipettering. Kassera och förbered på nytt när detta inte längre är möjligt. Lösningen kan inte enkelt filtreras för att avlägsna partiklar.
  2. Tillsätt 40 μl bläcklösning och GSB till den första delen av den första 384-hålsplattan (figur 2).
  3. Tillsätt 25 μl GSB till alla brunnar med spädning 1 (D1). Tillsätt 40 μl GSB till alla brunnar med spädning 2, 3 och 4 (D2-D4).
  4. Späd de extraherade glykanproverna och definierade glykansubstrat 1:1 (v/v) med GSB genom att tillsätta 25 μl extraherat glykanprov till D1-brunnarna i ordning.
  5. Späd varje prov i serie fyra gånger genom att ta 10 μl av provet från D1-brunnen och tillsätta det till D2-brunnen. Andas försiktigt med en pipett för att blanda.
  6. Upprepa processen genom att ta 10 μL prov från D2-brunnen och tillsätt det till D3-brunnen.
  7. Upprepa för D4-brunnen. Efter blandning kasseras 10 μl från D4-brunnen så att varje brunn innehåller en slutlig volym på 40 μl.
  8. Tillsätt 40 μl bläcklösning och GSB till slutplattans slutblock.
  9. Täck plattorna med ett självhäftande plattskydd och centrifugera i 10 minuter vid 3 000 x g (rumstemperatur). Se till att inga bubblor finns kvar efter centrifugeringen och upprepa vid behov.
  10. Använd en beröringsfri piezoelektrisk mikroarrayutskriftsrobot och skriv ut proverna på nitrocellulosamembranet (se materialförteckning) genom att följa stegen nedan.
    Nedan rekommenderas åtgärder för optimal utskriftskvalitet. De specifika parametrar som krävs kommer dock i slutändan att bero på vilket instrument som används. Vi rekommenderar att användare kontaktar instrumenttillverkaren för att diskutera lämpliga anpassningar och utskriftsinställningar som krävs för deras enhet.
    1. Töm avfallsbuffertbehållaren före utskrift och fyll den rena buffertbehållaren med ren GSB vid behov. Slå på instrumentet och låt det stabiliseras i >10 minuter om det har ett integrerat fukt- och temperaturkontrollsystem. Slå på mikroarrayern och initiera systemet.
      OBS: Vi rekommenderar att du kör ett test för att bestämma instrumentets inre tryck. Om trycket är för lågt kan det vara nödvändigt att utföra en högtrycksrensning. Återigen, kontakta instrumenttillverkaren för att diskutera den specifika användningen av det specifika instrumentet.
    2. Rensa skrivhuvudet och kapillärerna flera gånger med GSB för att ta bort skräp och potentiella föroreningar. Utför en testutskrift genom att antingen ladda en platta med GSB ensam eller ställa in instrumentet för att skriva ut direkt från den rena buffertbehållaren, förbi sample aspiration från en laddad platta.
      OBS: Det är inte nödvändigt att utföra testutskriften med ett nitrocellulosamembran; Rena mikroskopglas är tillräckliga och ger fördelen att punktstorleken, formen och kvaliteten kan bedömas visuellt före provutskrift.
    3. När du skriver ut extraherade glykanprover, programmera systemet så att det spolas med ren GSB mellan varje sample.
      OBS: Vanligtvis är provvolymen per utskriven fläck 100 pL till 10 nL, och punktstorleken varierar från 20 μm till 100 μm, beroende på vilken sample volym som valts. Att skriva ut 100 mikroarrayer från en 384-brunnars plåt tar cirka 40 minuter, inklusive systemspolning. De resulterande mikroarrayerna kommer att vara cirka 1 cm2 stora. Ytterligare plattor kommer att öka längden på matrisen med cirka 1 cm per platta. En schematisk bild av den tryckta mikroarraydesignen visas i figur 3. När mikroarrayerna har skrivits ut är de redo att användas omedelbart och kan lagras i flera år. Om utskriftsjobbet av någon anledning måste upprepas, på grund av potentiell avdunstning av samples under utskrift, rekommenderas att en ny sample plåt laddas och den ursprungliga plåten kasseras.
    4. Rengör skrivhuvudet och kapillärerna noggrant en gång i veckan. Gör detta genom att ladda en 384-brunn som innehåller en 1:20-utspädning av koncentrerad NaOH i GSB och utför en 40 min till 1 timmes utskrift på mikroskopglas. Användare bör se till att denna rengöringslösning är kompatibel med deras instrument innan de fortsätter.
  11. Spara den unika rutnätsfilen (.gal-filen) som producerats för den utskrivna mikroarrayen redo för nedströmsanalys.

6. Sondering av mikroarrayer

  1. Klipp ut individuella, identiska tryckta mikroarrayer från nitrocellulosamembranet och placera dem i ett kärl av lämplig storlek för sondering (t.ex. en 12- eller 24-håls mikrotiterplatta) (se materialförteckning). Matrisen ska ligga platt på fartygets botten. En mikroarray krävs per sond och representerar ett tekniskt replikat.
  2. För att minska icke-specifik bindning, inkubera mikroarrayerna i 1 timme i MP-TBST-blockerande buffert (1x Tris-buffrad koksaltlösning, pH 7,5, + 0,1 % [v/v] TWEEN 20 [TBST] och kompletterat med 5 % [w/v] skummjölkspulver; se materialtabell) på en roterande skakapparat. Se till att volymen är tillräcklig för att sänka hela matrisen.
  3. Efter inkubationen avlägsnas MP-TBST och ersätts med en ny volym MP-TBST.
  4. Inkubera matriserna med monoklonala antikroppar (mAbs) eller His-märkta CBM, eller andra GRMP (t.ex. lektiner), utspädda 1:10-1:1 000 (enligt tillverkarens specifikation, se materialtabell) i MP-TBST i 2 timmar på en roterande/gungande skakapparat.
  5. Efter inkubationen, ta bort den molekylära sondlösningen och täck matriserna i ren TBST, se till att matriserna är helt nedsänkta. För att ta bort kvarvarande sondlösning, ta omedelbart bort TBST och ersätt med en ny volym. Placera matriserna på en roterande/gungande shaker i 5 min. Efter 5 minuter, ta bort TBST, byt ut den mot en ny volym och lägg den på en roterande/gungande shaker i 5 minuter.
    OBS: Denna process bör upprepas tre gånger, exklusive det första tillägget och omedelbar borttagning av TBST.
  6. Inkubera arrayerna med alkaliska fosfataskonjugerade sekundära antikroppar (anti-mus, anti-råtta, anti-kanin, anti-HIS, beroende på vad som är lämpligt; se Materialtabell) utspädda 1:1 000 i MP-TBST i 2 timmar på en gungande/roterande skakapparat.
    OBS: Pepparrotsperoxidaskonjugerade sekundära antikroppar är också lämpliga och används tillsammans med tetrametylbensidin (TMB)/väteperoxidsubstrat för färgutveckling.
  7. Efter inkubationen upprepas tvättproceduren enligt steg 6.5 för att avlägsna ospecifikt bundna sekundära antikroppar.
  8. Täck matriserna med nitroblått tetrazolium (NBT)/5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP) färgutvecklingslösning (se materialtabell) för kromogen detektion av antikroppsbindning. Låt stå tills lila utfällningsfläckar utvecklas vid antigenbindningsställena (vanligtvis 5-30 minuter, men arrayerna bör övervakas noga för att undvika övermättnad, eftersom reaktionen kan ske snabbt).
    VARNING: BCIP är skadligt vid hudkontakt och kan orsaka irritation i luftvägarna. Använd personlig skyddsutrustning. Undvik dammbildning. Undvik att andas in damm.
  9. För att avsluta reaktionen, sänk ner matriserna i rent kranvatten och tvätta noggrant.
  10. Placera matriserna mellan läskpapper över natten i rumstemperatur för att torka.
  11. Kassera matriserna med uppenbara defekter och upprepa sonderingsprotokollet i sådana fall (figur 4).

7. Analys och kvantifiering

  1. Skanna de utvecklade matriserna med en upplösning på 2 400 punkter per tum (dpi) med hjälp av en skrivbordsskanner. Konvertera bilderna till TIFF-filer och sedan till negativ.
  2. Använd programvara för mikroarrayanalys (se Materialförteckning) och lägg över den unika .gal-rutnätsfilen på varje mikroarraybild för att beräkna färgintensiteten hos den punkt som produceras vid varje antigenbindningsställe och subtrahera den lokala bakgrunden.
  3. Exportera tabelldata som en .txt fil. Dessa kan sedan manuellt importeras till ett Excel-ark för analys.
  4. Generera ett medelvärde för spotsignalintensiteten för varje prov genom att beräkna medelvärdet av spotintensiteten först över varje provutspädning och sedan över eventuella biologiska replikat som ingår.
  5. Tilldela ett värde på 100 till den högsta genomsnittliga spotsignalintensiteten och normalisera återstående data i enlighet med detta.
    OBS: Normaliserade medelintensiteter för spotsignaler kan sedan presenteras som en värmekarta över relativ förekomst av glykanepitoper med hjälp av funktionen för villkorlig formatering i Excel33, eller med hjälp av funktionen geom_tile i R ggplot2-paket40,41.

Representative Results

MAPP användes för att bestämma glykansammansättningen i biomassaavfall från jordbruket, bestående av mangoskal från flera nordthailändska sorter, Coffea arabica-körsbärsmassa och bearbetningsavfall från kaffebönor samt rot-, stam- och bladvävnad från thailändsk svart vitlök, Allium sativum var. ophioscorodon. Flera växtbaserade polysackarider används inom livsmedelsindustrin som funktionella ingredienser42,43. Syftet med detta experiment var därför att härleda om dessa rikliga och för närvarande underutnyttjade agroindustriella avfallsmaterial kan utgöra en källa till rena polysackarider med mervärde.

AIR-material används rutinmässigt för att bereda prover avsedda för glykananalys44. Det finns flera fördelar med att använda AIR. Behandling med lösningsmedel avlägsnar effektivt endogena CAZymer, metaboliter, små sackarider, lipider och pigment, vilket resulterar i prover berikade med polysackarider och strukturella proteiner34. Att producera AIR är dessutom ett snabbt och effektivt sätt att öka provets livslängd, eftersom det är termostabilt och kan lagras i flera år.

Tre blandade fraktioner av ingående glykaner extraherades sekventiellt från växtens AIR-material med hjälp av CDTA, NaOH och cellulas. CDTA-kelaterat Ca2+ -joner, som gör det möjligt att avlägsna Ca2+ tvärbundna avförestrade pektiner från växtcellväggar45. Alkaliska förhållanden gör att huvudsakligen hemicellulosa, såsom mannan, xylan och β-glukan, frigörs på grund av störning av vätebindning och förtvålning av esterbindningar mellan cellulosamikrofibriller och hemicellulosa, respektive lignin och hemicellulosa46. Ett rekombinant endo-1,4-β-glukanas från Bacillus spp. användes för att bryta ned amorfa regioner i de strukturella cellulosamikrofibrillerna och frigöra kvarvarande glykaner bundna till cellulosa i cellväggarna47. Även om denna metod effektivt separerar glykaner i dessa tre breda grupper, bör det noteras att proverna inte är rena; På grund av extraktionsmetodens själva natur kommer hemicellulosa, om den finns i provet, oundvikligen att extraheras och därefter detekteras i varierande grad i CDTA- och cellulasfraktionerna. På samma sätt kommer en del pektin att detekteras i NaOH-extraktionen om det finns i sample.

En beröringsfri, piezoelektrisk mikroarrayutskriftsrobot användes för att immobilisera extraherade glykanfraktioner på nitrocellulosa via icke-kovalent bindning11, vilket bildade 300 identiska mikroarrayer. Definierade glykanstandarder (tabell 1) inkluderades också i de utskrivna mikroarrayerna som positiva kontroller (figur 5). Den MAPP-bindningsprofil som erhålls för de valda glykanstandarderna motsvarar tidigare rapporterade epitopspecificiteter. Till exempel uppvisade LM21 stark bindning till flera mannpolysackarider (galaktomannan och glukomannan), medan LM22 endast uppvisade svag bindning till galaktomannan25. På liknande sätt binder LM19 företrädesvis till avförestrade homogalacturonan48 och LM15 binder till tamarindfröxyloglukan23.

Den relativa förekomsten av 16 epitoper, diagnostiska av icke-cellulosabaserade växtcellväggspolysackarider, detekterades genom bindning av glykanriktade monoklonala antikroppar (tabell 2) till tryckta extrakt (figur 6). Majoriteten av extraherade glykaner detekterades inom den alkaliska NaOH-fraktionen. Starka bindningssignaler registrerades för mAbs LM10 och LM11, som representerar xylan/arabinoxylan, i skalen på alla testade mangosorter. I vitlöksproverna band LM10 och LM11 företrädesvis till rotvävnadsextrakt (vitlök R) och uppvisade endast svag bindning till bladvävnadsextraktet (vitlök L). LM19, som representerar delvis metylförestrade eller icke-förestrade homogalakturonan, starkt bundet till vissa mangosortsextrakt (Aokrong och Talabnak), men endast svagt, eller dess bindning var odetekterbar, i andra sorter (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok och Nga). Dessutom band LM19 endast till kaffemassafraktionerna och band inte till avfallsmaterialet från bearbetning av kaffebönor, som tidigare troddes bestå av halvrenat kaffepektin (opublicerade data).

Figure 1
Figur 1: Större experimentella steg i MAPP-metoden. (A) Proverna homogeniseras för att bilda fina pulver. B) De homogeniserade proverna bearbetas för att isolera deras AIR. (C) De ingående glykanerna extraheras sekventiellt med hjälp av en skräddarsydd extraktionsregim. (D) De extraherade glykanfraktionerna, bläcket och GSB överförs till 384-hålsplåtar, beroende på klichélayouten, för tryckning på nitrocellulosa. (E) De utskrivna mikroarrayerna sondas med utvalda GRMP:er. (F) GRMP-bindningen till de utskrivna glykanfraktionerna kvantifieras och analyseras innan data presenteras som en värmekarta. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Exempel på en 384-håls plattlayout för prov-, bläck- och GSB-laddning med fyra utspädningar per extraherat glykanprov/standard. Olika färger betecknar prover som härrör från olika extraktionsreagenser, medan olika nyanser representerar serieutspädningar. Den första siffran i koden representerar provnumret, medan slutnumret representerar utspädningstalet (D1 betecknar utspädning ett, D2 betecknar utspädning två och så vidare). Till exempel representerar en brunn märkt "12D3" glykanprov 12, utspädning tre. Brunnsplattor bör delas upp i åtta identiska sektioner bestående av sex kolumner och åtta rader. Den första delen av den första plåten ska endast innehålla bläck och buffert och likna exempelplåtlayouten. Extraherade glykanprover kan sedan laddas i efterföljande plattsektioner enligt plattlayouten. Olika extraktionsreagenser bör inte laddas i samma plattsektion. Om det inte finns tillräckligt med prover för att fylla en hel sektion, fyll alla återstående brunnar i den sektionen med buffert. Lämna inga brunnar tomma. Om flera plåtar krävs ska nästa sektion efter att alla prover har laddats innehålla tre alternerande kolumner med bläck och GSB - detta kanske inte är sektion åtta, beroende på antalet prover som skrivs ut. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Schematisk representation av tryckt mikroarraydesign. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Representativa mikroarrayer. (A) Ingen bindning. (B) Bindningssignalen är skymd av hög bakgrundssignal. (C) Generaliserad blå/lila färgning på grund av övermättnad med NBT/BCIP. (D) Defekt sondering på grund av hög substratkoncentration. (E) Defekt utskrift på grund av det orena skrivhuvudet. (F) Stark bindning till få prover. (G) Stark bindning till många prover. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Monoklonal antikroppsbindning till definierade glykanstandarder, inkluderad för att validera tryck- och sonderingsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: MAPP för glykaner som utvunnits ur biomassaavfall från jordbruket. Proverna inkluderar avfall från kaffemassa (kaffemassa och kaffepektin), mangoskal från flera thailändska sorter (AO, Aokrong; KO, Kam; RD, Rad; CH, Chokanan; Fil.mag., Mamkamdang; TL, Talabnak; MH, Mahachanok; NG, Nga) och svarta vitlöksblad (vitlök L), stjälk (vitlök S), lök (vitlök BG) och rötter (vitlök R), med CDTA, NaOH och cellulas (Bacillus spp. cellulas 5A). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Definierade kommersiella polysackaridstandarder som används i MAPP-analys som positiva kontroller. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Glykanriktade monoklonala antikroppar selekterade för undersökning av extraherade växtglykanmikroarrayer. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

MAPP-tekniken som beskrivs här är nu en väletablerad metod för glykananalys. De grundläggande principerna beskrevs första gången 200711, men tekniken har genomgått kontinuerlig utveckling för att dra nytta av de senaste innovationerna inom mikroarrayteknik, molekylär sondutveckling och framsteg i vår förståelse av glykanbiokemi. I allmänhet är glykaner, särskilt polysackarider, mer utmanande att analysera än proteiner och nukleotider på grund av deras strukturella komplexitet och heterogenitet45, samt det faktum att de inte lätt kan sekvenseras eller syntetiseras1. I många fall kan ingen enskild teknik dechiffrera glykankomplexitet slutgiltigt; därför används MAPP ofta med andra metoder. Detta är en av anledningarna till att AIR-beredning vanligtvis väljs som utgångspunkt för MAPP, eftersom AIR är kompatibel med de flesta andra glykananalysmetoder34, vilket underlättar den efterföljande jämförelsen av datauppsättningar.

På grund av homogenisering av provet före AIR-beredning går viss rumslig information alltid förlorad. Men eftersom polysackarider frisätts sekventiellt från prover, ger närvaron av epitoper i de erhållna fraktionerna information om den molekylära arkitekturen och sammansättningen av det provet17. Att välja en lämplig extraktionsregim är därför avgörande för metodens framgång. Flera parametrar avgör extraktionsmetodens lämplighet: cellstruktur, tid, temperatur, pH, tryck, lösningsmedlets jonstyrka och finheten hos det fasta partikelprovet49. Det rekommenderas att en rad allt mer aggressiva lösningsmedel används för att maximera sannolikheten för att framgångsrikt extrahera ingående glykaner och bygga upp en representativ sammansättningsbild av provet. För de flesta prover är CDTA, NaOH och cellulas tillräckliga för att avlägsna växtbaserade lagrings- och cellväggspolysackarider 33,50,51,52. För vissa vävnadsprover har en hybridextraktionsregim som även inkluderar CaCl2, HCl och Na2CO3 visat sig vara framgångsrik53, medan marina mikroalgprover kan kräva tillsats av etylendiamintetraättiksyra (EDTA)10.

Mikroarrayer bör innehålla en rad rena, definierade glykanstandarder som ska användas som positiva kontroller5. Inkluderade standarder bör modifieras beroende på provets karaktär. När de har skrivits ut måste lämpliga GRMP:er väljas. Genereringen av hybridom-mAbs till polysackaridstrukturer är utmanande54; Glykanbindande antikroppar är svåra att höja och kan ha låg affinitet55. Lyckligtvis kan gensekvensinformation för CBM erhållas relativt enkelt för rekombinant uttryck4 och för att modifiera deras bindningsspecificiteter56,57. Även om en imponerande katalog över GRMP har utvecklats, och de flesta nu finns tillgängliga från kommersiella källor, har endast en liten andel producerats och framgångsrikt karakteriserats58 i förhållande till den mångfald av glykanstrukturer som finns i naturen. Detta kan begränsa möjligheten att upptäcka och skilja mellan vissa strukturer. Det är tillrådligt att utföra ett inledande sonderingsexperiment med en eller två sonder som är representativa för varje större glykanstruktur som förväntas finnas, för vilken bindningsspecificiteten är väl karakteriserad. I efterföljande sonderingsexperiment kan sondlistan utökas till att omfatta ett bredare spektrum av glykaner och fördjupa sig i finstrukturer.

Även om det är vardagligt, är det grundläggande att se till att mikroarrayer tvättas noggrant efter varje inkubationssteg för att sonderingsproceduren ska lyckas. Det ineffektiva avlägsnandet av icke-specifikt bundna sonder kommer sannolikt att skymma resultatet genom att orsaka en hög bakgrundssignal efter färgutvecklingen. I det här fallet är det nödvändigt att upprepa sonderingsproceduren och börja med en ny mikroarray. Dessutom bör arrayer vidröras sparsamt och endast genom att hålla i kanterna med pincett; Nitrocellulosamembranet är sprött och skadas lätt. Färgutvecklingslösningen samlas i sprickor och veck, vilket orsakar övermättnad, vilket hindrar matrisanalys.

MAPP är snabbt, anpassningsbart och bekvämt. Denna metod är kompatibel med djur-, mikrobiella eller växtglykaner som härrör från alla biologiska eller industriella system, så länge de kan extraheras och immobiliseras på nitrocellulosa, och för vilka man har lämpliga molekylära sonder. De data som genereras ger detaljerad, semikvantitativ, kompositionell insikt, som inte lätt kan erhållas via andra glykananalysmetoder.

Disclosures

Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Författarna vill tacka ArrayJet för deras expertråd om mikroarrayrobotik. SS och JS vill tacka för stödet från Fundamental Fund 2022 (FF65/004), Chiang Mai University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) Megazyme P-LICHN
1,4-β-D-Mannan Megazyme P-MANCB
384-well microtiter plate Greiner Bio-One M1686
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) Melford B74100-1.0
Acetone Sigma 270725
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 112-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag Jackson ImmunoResearch 300-055-240
Arabinoxylan (wheat) Megazyme P-WAXYL
Array-Pro Analyzer Software Media Cybernetics Version 6.3
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) NZYTech CZ0564
BAM antibodies SeaProbes Various
Black drawing ink (indian ink) Winsor & Newton GWD030
Carbohydrate binding modules NZYTech Various
CCRC antibodies CarboSource Various
CDTA Sigma 319945
Chloroform Sigma PHR1552
Ethanol Sigma 1.11727
Galactan (potato) Megazyme P-GALPOT
Galactomannan (carob) Megazyme P-GALML
Glycerol solution Sigma 49781-5L
Gum tragacanth (legumes) Sigma-Aldrich G1128
INCh antibodies INRA Various
LM and JIM antibodies PlantProbes Various
Marathon Argus Microarray Printer ArrayJet
Methanol Sigma  34860
Monoclonal antibodies Biosupplies Australia Various
NaBH4 Sigma 452882
NaOH Sigma S5881
Nitro-blue tetrazolium (NBT) Melford N66000-1.0
Nitrocellulose membrane Thermo Fisher Scientific 88018
Pectin (degree of methyl esterification 46%) Danisco NA
ProClin 200 Sigma 48171-U
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) Megazyme P-RHAGN
Rotating mixer Fisher Scientific 88-861-050
Rotating/rocking Shaker Cole-Parmer
Skimmed milk powder Marvel
Spin filter Costar Spin-X 8160
Stainless steel beads Qiagen 69989
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris Sigma 93362
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Xylan (beechwood) Megazyme P-XYLNBE
Xyloglucan (tamarind) Megazyme P-XYGLN
β-Glucan (oat) Megazyme P-BGOM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amicucci, M. J., et al. A nonenzymatic method for cleaving polysaccharides to yield oligosaccharides for structural analysis. Nature Communications. 11 (1), 3963 (2020).
  2. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Evolution of glycan diversity. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  3. Willats, W. G. T., McCartney, L., Knox, J. P. Pectin cell biology: complexity in context. Advances in Pectin and Pectinase Research. , Springer. Netherlands. 147-157 (2003).
  4. Cummings, R. D., et al. Glycan-recognizing probes as tools. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  5. Bakshani, C. R., et al. Analysis of glycans in a Burnt-on/Baked-on (BoBo) model food soil using Microarray Polymer Profiling (MAPP) and immunofluorescence microscopy. Food Chemistry. 410, 135379 (2023).
  6. Salmeán, A. A., Willats, W. G. T., Ribeiro, S., Andersen, T. J., Ellegaard, M. Over 100-year preservation and temporal fluctuations of cell wall polysaccharides in marine sediments. Frontiers in Plant Science. 13, 785902 (2022).
  7. Cid, M., et al. Recognition of the helical structure of β-1,4-galactan by a new family of carbohydrate-binding modules. Journal of Biological Chemistry. 285 (46), 35999-36009 (2010).
  8. Runavot, J. -L., et al. Non-cellulosic polysaccharides from cotton fibre are differently impacted by textile processing. PLoS One. 9 (12), e115150 (2014).
  9. Ahl, L. I., et al. Analyses of aloe polysaccharides using carbohydrate microarray profiling. Journal of AOAC International. 101 (6), 1720-1728 (2018).
  10. Vidal-Melgosa, S., et al. Diatom fucan polysaccharide precipitates carbon during algal blooms. Nature Communications. 12 (1), 1150 (2021).
  11. Moller, I., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant Journal. 50 (6), 1118-1128 (2007).
  12. Ruprecht, C., et al. A synthetic glycan microarray enables epitope mapping of plant cell wall glycan-directed antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  13. Cummings, R. D., et al. Principles of glycan recognition. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  14. Gao, C., et al. Glycan microarrays as chemical tools for identifying glycan recognition by immune proteins. Frontiers in Chemistry. 7, 833 (2019).
  15. Vidal-Melgosa, S., et al. A new versatile microarray-based method for high throughput screening of carbohydrate-active enzymes. Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9020-9036 (2015).
  16. Willats, W. G. T., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: A novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  17. Sørensen, I., et al. The charophycean green algae provide insights into the early origins of plant cell walls. The Plant Journal. 68 (2), 201-211 (2011).
  18. Liu, D., Tang, W., Yin, J. -Y., Nie, S. -P., Xie, M. -Y. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development. Food Hydrocolloids. 116, 106641 (2021).
  19. Pattathil, S., et al. A comprehensive toolkit of plant cell wall glycan-directed monoclonal antibodies. Plant Physiology. 153 (2), 514-525 (2010).
  20. Verhertbruggen, Y., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. The Plant Journal. 59 (3), 413-425 (2009).
  21. Rydahl, M. G., et al. Development of novel monoclonal antibodies against starch and ulvan - implications for antibody production against polysaccharides with limited immunogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 9326 (2017).
  22. McCartney, L., Marcus, S. E., Knox, J. P. Monoclonal antibodies to plant cell wall xylans and arabinoxylans. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (4), 543-546 (2005).
  23. Marcus, S. E., et al. Pectic homogalacturonan masks abundant sets of xyloglucan epitopes in plant cell walls. BMC Plant Biology. 8, 60 (2008).
  24. Pedersen, H. L., et al. Versatile high resolution oligosaccharide microarrays for plant glycobiology and cell wall research. The Journal of Biological Chemistry. 287 (47), 39429-39438 (2012).
  25. Marcus, S. E., et al. Restricted access of proteins to mannan polysaccharides in intact plant cell walls. The Plant Journal. 64 (2), 191-203 (2010).
  26. Smallwood, M., Martin, H., Knox, J. P. An epitope of rice threonine-and hydroxyproline-rich glycoprotein is common to cell wall and hydrophobic plasma-membrane glycoproteins. Planta. 196 (3), 510-522 (1995).
  27. Smallwood, M., Yates, E. A., Willats, W. G. T., Martin, H., Knox, J. P. Immunochemical comparison of membrane-associated and secreted arabinogalactan-proteins in rice and carrot. Planta. 198 (3), 452-459 (1996).
  28. Wisniewski, J. P., Rathbun, E. A., Knox, J. P., Brewin, N. J. Involvement of diamine oxidase and peroxidase in insolubilization of the extracellular matrix: implications for pea nodule initiation by Rhizobium leguminosarum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13 (4), 413-420 (2000).
  29. Jones, L., Seymour, G. B., Knox, J. P. Localization of pectic galactan in tomato cell walls using a monoclonal antibody specific to (1[->]4)-β-D-galactan. Plant Physiology. 113 (4), 1405-1412 (1997).
  30. Willats, W. G., Marcus, S. E., Knox, J. P. Generation of a monoclonal antibody specific to (1→5)-α-L-arabinan. Carbohydrate Research. 308 (15), 149-152 (1998).
  31. Cornuault, V., et al. LM6-M: a high avidity rat monoclonal antibody to pectic α-1, 5-L-arabinan. BioRxiv. , 161604 (2017).
  32. Sutherland, P., Hallett, I., Jones, M. Probing cell wall structure and development by the use of antibodies: a personal perspective. New Zealand Journal of Forestry Science. 39, 197-205 (2009).
  33. Mikkelsen, M. D., et al. Ancient origin of fucosylated xyloglucan in charophycean green algae. Communications Biology. 4 (1), 754 (2021).
  34. Fangel, J. U., Jones, C. Y., Ulvskov, P., Harholt, J., Willats, W. G. T. Analytical implications of different methods for preparing plant cell wall material. Carbohydrate Polymers. 261, 117866 (2021).
  35. Moore, J. P., et al. Analysis of plant cell walls using high-throughput profiling techniques with multivariate methods. The Plant Cell Wall: Methods and Protocols. , Springer. New York. 327-337 (2020).
  36. Gao, Y., Fangel, J. U., Willats, W. G. T., Moore, J. P. Tracking polysaccharides during white winemaking using glycan microarrays reveals glycoprotein-rich sediments. Food Research International. 123, 662-673 (2019).
  37. Solden, L. M., et al. Interspecies cross-feeding orchestrates carbon degradation in the rumen ecosystem. Nature Microbiology. 3 (11), 1274-1284 (2018).
  38. Fangel, J. U., et al. Tracking polysaccharides through the brewing process. Carbohydrate Polymers. 196, 465-473 (2018).
  39. Mravec, J., et al. Pea border cell maturation and release involve complex cell wall structural dynamics. Plant Physiology. 174 (2), 1051-1066 (2017).
  40. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. New York. NY. (2009).
  41. Gu, Z. Complex heatmap visualization. iMeta. 1 (3), 43 (2022).
  42. Nasrollahzadeh, M., Nezafat, Z., Shafiei, N., Soleimani, F. Polysaccharides in Food Industry. , Elsevier. Iran. (2021).
  43. Shao, P., et al. Recent advances in improving stability of food emulsion by plant polysaccharides. Food Research International. 137, 109376 (2020).
  44. Sanz, M. L., Martínez-Castro, I. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates. Journal of Chromatography. A. 1153 (1-2), 74-89 (2007).
  45. Bethke, G., Glazebrook, J. Cyclohexane diamine tetraacetic acid (CDTA) extraction of plant cell wall pectin. Bio-Protocol. 4 (24), e1357 (2014).
  46. Lu, Y., He, Q., Fan, G., Cheng, Q., Song, G. Extraction and modification of hemicellulose from lignocellulosic biomass: A review. Green Processing and Synthesis. 10 (1), 779-804 (2021).
  47. Jayasekara, S., Ratnayake, R. Microbial cellulases: an overview and applications. Cellulose. 22, 92 (2019).
  48. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., Ordaz-Ortiz, J. J., Knox, J. P. An extended set of monoclonal antibodies to pectic homogalacturonan. Carbohydrate Research. 344 (14), 1858-1862 (2009).
  49. Villares, A., Mateo-Vivaracho, L., Guillamón, E. Structural features and healthy properties of polysaccharides occurring in mushrooms. Agriculture. 2 (4), 452-471 (2012).
  50. Kračun, S. K., et al. Carbohydrate microarray technology applied to high-throughput mapping of plant cell wall glycans using comprehensive microarray polymer profiling (CoMPP). Methods in Molecular Biology. 1503, 147-165 (2017).
  51. Rajasundaram, D., et al. Understanding the relationship between cotton fiber properties and non-cellulosic cell wall polysaccharides. PLoS One. 9 (11), e112168 (2014).
  52. Michalak, L., et al. Microbiota-directed fibre activates both targeted and secondary metabolic shifts in the distal gut. Nature Communications. 11 (1), 5773 (2020).
  53. Salmeán, A. A., Hervé, C., Jørgensen, B., Willats, W. G., Mravec, J. Microarray glycan profiling reveals algal fucoidan epitopes in diverse marine metazoans. Frontiers in Marine Science. 4, 293 (2017).
  54. Knox, J. P. Revealing the structural and functional diversity of plant cell walls. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 308-313 (2008).
  55. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17-23 (2007).
  56. Stephen, P., Tseng, K. -L., Liu, Y. -N., Lyu, P. -C. Circular permutation of the starch-binding domain: inversion of ligand selectivity with increased affinity. Chemical Communications. 48 (20), 2612-2614 (2012).
  57. Gunnarsson, L. C., Dexlin, L., Karlsson, E. N., Holst, O., Ohlin, M. Evolution of a carbohydrate binding module into a protein-specific binder. Biomolecular Engineering. 23 (2-3), 111-117 (2006).
  58. Moller, I., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchical clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25 (1), 37-48 (2008).

Tags

Microarray Polymer Profiling (MAPP) Glykananalys med hög genomströmning Glykaner Glykokonjugat Biologiska prover Växtvävnader Algvävnader Livsmedelsmaterial Mänskliga prover Djurprover Mikrobiella prover Microarray-teknik Screeningplattform Glykanriktade molekylära sonder Analyter Kemisk fraktionering Enzymatisk fraktionering Nitrocellulosamembran Glykansammansättning Glykanigenkännande molekylära sonder Konventionella glykananalystekniker Monosackaridanalys Kopplingsanalys masspektrometri
Microarray Polymer Profiling (MAPP) för glykananalys med hög genomströmning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bakshani, C. R., Sangta, J.,… More

Bakshani, C. R., Sangta, J., Sommano, S., Willats, W. G. T. Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis. J. Vis. Exp. (199), e65443, doi:10.3791/65443 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter