Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mikroarray-polymerprofilering (MAPP) for glykananalyse med høy gjennomstrømning

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65443
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1
1Department of Biology, School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3Department of Plant and Soil Sciences, Faculty of Agriculture, Chiang Mai University

Summary

Microarray polymer profiling (MAPP) er en høy gjennomstrømningsteknikk for komposisjonsanalyse av glykaner i biologiske prøver.

Abstract

Mikroarraypolymerprofilering (MAPP) er en robust og reproduserbar tilnærming for systematisk å bestemme sammensetningen og den relative overflod av glykaner og glykokonjugater i en rekke biologiske prøver, inkludert plante- og algevev, matmaterialer og prøver fra mennesker, dyr og mikrobier. Microarray-teknologi underbygger effekten av denne metoden ved å tilby en miniatyrisert, høy gjennomstrømningsscreeningsplattform, slik at tusenvis av interaksjoner mellom glykaner og svært spesifikke glykanrettede molekylære prober kan karakteriseres samtidig, ved bruk av bare små mengder analytter. Glykanbestanddeler fraksjoneres kjemisk og enzymatisk, før de ekstraheres sekvensielt fra prøven og immobiliseres direkte på nitrocellulosemembraner. Glykansammensetningen bestemmes ved vedlegg av spesifikke glykangjenkjennende molekylære prober til de utpressede og trykte molekylene. MAPP er komplementær til konvensjonelle glykananalyseteknikker, som monosakkarid og koblingsanalyse og massespektrometri. Glykangjenkjennende molekylære prober gir imidlertid innsikt i strukturelle konfigurasjoner av glykaner, noe som kan hjelpe til med å belyse biologiske interaksjoner og funksjonelle roller.

Introduction

Glykaner er allestedsnærværende i alle livets domener og viser uovertruffen mangfold i struktur og funksjon sammenlignet med andre makromolekyler1. På grunn av deres kompleksitet, variasjon i biosyntese og glykosidiske bindinger, og mangelen på passende metoder for dissekering av glykanstrukturer, er vår forståelse av dette mangfoldet i strukturer og funksjoner imidlertid relativt begrenset2.

Mange glykananalyseteknikker er destruktive og nødvendiggjør nedbrytning av glykaner i deres bestanddeler monosakkarider, noe som kan skjule relevante tredimensjonale og biologiske sammenhenger3. Omvendt gjenkjenner og binder monoklonale antistoffer (mAbs), karbohydratbindende moduler (CBM), lektiner, virale agglutininer og mikrobielle adhesiner, kjent kollektivt som glykangjenkjennende molekylære prober (GRMPs)4, til spesifikke epitoper og kan brukes som verktøy for å oppdage og diskriminere mellom glykaner i komplekse multiglykanmatriser 5,6.

Her presenterer vi mikroarraypolymerprofilering (MAPP), en rask, allsidig og ikke-destruktiv metode for glykananalyse som kan brukes på et bredt spekter av biologiske prøver. Metoden har som mål å gi en robust teknologi med høy gjennomstrømning for analyse av glykaner fra ulike biologiske og industrielle/kommersielle systemer. MAPP forener anerkjennelsesspesifisiteten til glykanrettede molekylære prober med reproduserbar, høyytelses mikroarray-screeningsteknologi for å tillate at tusenvis av molekylære interaksjoner kan profileres parallelt. Resultatet av denne tilnærmingen er diagnostisk innsikt i sammensetningen og den relative overflod av glykaner i en prøve eller vev av interesse.

MAPP kan brukes som en selvstendig, frittstående metode, eller sammen med andre biokjemiske teknikker, som immunfluorescensmikroskopi 7,8,9 og monosakkarid eller koblingsanalyse10,11. Teknikken kan også brukes til å kartlegge epitopspesifisiteter av nye GRMPer, ved hjelp av matriser trykt med rene og strukturelt veldefinerte oligosakkaridstandarder12. En stor fordel med MAPP over andre metoder, for eksempel enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA), er dens kompatibilitet med små prøvevolumer13,14. Videre tilbyr MAPP betydelig høyere gjennomstrømningsanalyse15 og gir en effektiv form for prøvebevaring, da trykte prøver er tørre og stabile når de immobiliseres på nitrocellulose16.

Bindingen av GRMP er generelt avhengig av tilstedeværelsen av en rekke sammenhengende sukkerrester som samlet danner et bindingssted (epitop) som er unikt for en bestemt polysakkaridklasse (xylan, mannan, xyloglukan, etc.) 17. I motsetning til dette kan de enkelte sukkerrester (xylose, mannose, glukose) som kvantifiseres ved hjelp av de fleste biokjemiske teknikker, for eksempel monosakkaridsammensetning eller metyleringsanalyse, være komponenter av flere polysakkaridklasser og dermed vanskelig å tildele18.

MAPP er utviklet som svar på et teknologigap, nemlig evnen til raskt å analysere flere glykaner fra en rekke kilder ved hjelp av små mengder materiale. MAPP drar nytte av det omfattende repertoaret av GRMP-er som har blitt utviklet og karakterisert de siste tre tiårene: 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Utviklingen av MAPP har vært en iterativ prosess, hvor teknikken stadig blir raffinert og optimalisert. Det finnes nå en betydelig litteratur som beskriver anvendelsen av MAPP på ulike naturlige og industrielle systemer hvor glykaner spiller sentrale roller 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Her beskriver vi den nåværende toppmoderne for MAPP.

Protocol

De viktigste eksperimentelle stadiene av MAPP-metoden er oppsummert i figur 1.

1. Fremstilling av prøver

MERK: Her brukes metoden på plantevev for illustrasjonsformål. Plantene som ble valgt var Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon, og flere thailandske mangovarianter (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok, og Nga). Plantene ble valgt for sin kommersielle betydning. Deres behandling til konsum genererer for tiden underutnyttet agroindustrielt avfall, noe som kan gi en kilde til verdiskapende produkter, inkludert rene glykaner. Dermed ble MAPP brukt for å karakterisere glykansammensetningen av avfallsanleggets biomasse for bioprospektering.

  1. Separer plantematerialet i forskjellige vev (f.eks. rot, stamme og blader).
  2. Tørk plantevevet i varmluftsovn ved 40 °C i 12-24 timer (reduser/øk tiden i henhold til prøven). Alternativt kan du snap fryse prøvene i flytende nitrogen og deretter lyofilisere i ~ 4 dager.
  3. Homogeniser prøvene til et fint pulver ved hjelp av en pistol og mørtel eller en mekanisk vevslyser (se materialtabell) med et kulelager i hvert rør.
    MERK: For ferskt plantevev anbefales tørking eller lyofilisering før homogenisering. Generelt er homogenisering med en pestle og mørtel tilstrekkelig for de fleste tørre prøver. For spesielt elastiske prøver, som korn, belgfrukter og bearbeidede matvarer som pasta, kan snapfrysing i flytende nitrogen øke hastigheten og effektiviteten av prøvehomogenisering. Vi har funnet ut at mekanisk homogenisering er kompatibel med nesten alle prøvetyper, er betydelig raskere og mindre arbeidskrevende, og effektivt minimerer risikoen for krysskontaminering av prøver fra gjentatt bruk av samme utstyr (dvs. støt og mørtel).

2. Fremstilling av alkohol uoppløselige rester (AIR)

  1. Tilsett 1,5 ml 70% (v/v) etanol til 50-100 mg lufttørket og homogenisert prøvemateriale.
  2. Vortex grundig å blande og deretter sentrifugere ved 10.000 x g i 10 min ved romtemperatur. Kast den resulterende supernatanten med en pipette og behold pelleten.
  3. Til den gjenværende pelleten, tilsett 1,5 ml metanol og kloroform (1: 1 [v / v]). Vortex, sentrifuge og kast supernatanten i henhold til trinn 2.2.
  4. Til den gjenværende pelleten, tilsett 1,5 ml 100% aceton. Vortex, sentrifuge og kast supernatanten i henhold til trinn 2.2.
  5. Plasser den resulterende pelleten enten over natten i en avtrekkshette for å la den gjenværende acetonen fordampe eller i en vakuumsentrifuge til den er tørr.
    MERK: AIR-materiale kan lagres ved omgivelsestemperatur til det er nødvendig.

3. Glykan-ekstraksjon

MERK: Hvis mulig, utfør alle ekstraksjonstrinnene i en vevslyser med et kulelager i hver slange for å hjelpe til med resuspensjon. Hvis en vevslyser ikke er tilgjengelig, kan ekstraksjoner utføres i stedet med kontinuerlig omrøring eller risting. Det kan være nødvendig å forlenge utvinningstiden hvis dette ikke er mulig.

  1. Til 10 mg AIR-materiale, tilsett 30 μL/mg av 50 mM cykloheksanediamintetraeddiksyre (CDTA; se materialtabell), pH 7,5.
  2. Rist ved 27 Hz i 2 minutter, etterfulgt av 10 Hz i 2 timer.
  3. Sentrifuge ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Behold den resulterende supernatanten, tilsett den i et sterilt mikrosentrifugerør og oppbevar den ved 4 °C på en roterende rister.
  4. Til restpelleten tilsettes 30 μL/mg 4 M NaOH + 0,1 % (w/v) NaBH4.
    FORSIKTIG: NaBH4 er giftig ved svelging. Bruk personlig verneutstyr (PPE). Håndtak under en avtrekkshette. Unngå støvdannelse. Unngå å puste inn støv. Ikke la produktet komme i kontakt med vann.
  5. Gjenta trinn 3.2 til 3.3. Vask restpelleten to eller tre ganger med dH2O for å fjerne gjenværende NaOH.
  6. Tilsett 30 μL / mg cellulase (fortrinnsvis GH5 endo-1,4-β-glukanase, i passende enzymbuffer - som anbefalt av produsenten; se materialtabell) til pelleten og inkuber ved enzymets optimale temperatur i 16 timer.
  7. Sentrifuger prøvene ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Behold supernatanten, overfør til rene mikrosentrifugerør og oppbevar ved 4 °C på en roterende rister. Når de er trukket ut, må prøvene skrives ut så snart som mulig.
  8. Sentrifuger alle lagrede ekstrakter igjen ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    MERK: Prøvene må være fri for partikler og rusk. Pass gjennom et 0,2 μm spinnfilter før mikromatriseutskrift om nødvendig. Spesielt viskøse prøver er uforenlige med mikroarray-analyse, da mikromatrisekapillærene og skrivehodet lett kan tettes. Som en generell regel skal brukerne kunne pipette alle prøvene som er beregnet for utskrift med en standard pipette med lavt volum.

4. Utarbeidelse av standarder

  1. Klargjør 1 mg/ml oppløsninger av definerte glykanstandarder (tabell 1) i sterildH2O. Hvis du bruker pachyman som standard, oppløses i 4 M NaOH i stedet og nøytraliser med iseddik etter oppløsning.
  2. Oppbevar de tilberedte standardene over natten ved 4 °C på en roterende shaker for fullstendig oppløsning.
  3. Sentrifuge alle standarder i 10 minutter ved 10 000 x g ved 4 °C for å pelletere eventuelle rusk. Den resulterende supernatanten brukes til senere utskrift.

5. Mikroarray-utskrift

  1. Forbered en 1:20 (v / v) fortynning av svart indisk blekk / tegneblekk i glyserolsystembuffer (GSB; kombiner 47% glyserol, 52,9% dH2O, 0,06% Triton X-100 og 0,04% biocid [0,15% -0,17% koppriknitrat og 1,4% -2,0% magnesiumnitrat i vann] og filtrer sterilisering) (se materialfortegnelse) og sentrifuge i 10 minutter ved 15 000 x g (romtemperatur).
    MERK: Blekkløsning er nødvendig for å lage en topp- og bunnkant rundt de trykte prøvene, slik at de trykte mikromatrisene kan oppdages visuelt på membranen. Imidlertid vil blekkløsningen sannsynligvis inneholde sediment. Alle oppløsninger må være fri for partikler for utskrift, så unngå å forstyrre sedimentet ved pipettering. Kast og tilbered fersk når dette ikke lenger er mulig. Løsningen kan ikke enkelt filtreres for å fjerne partikler.
  2. Tilsett 40 μL blekkløsning og GSB til den første delen av den første 384-brønnplaten (figur 2).
  3. Tilsett 25 μl GSB til alle fortynningsbrønner 1 (D1). Tilsett 40 μL GSB til alle fortynningsbrønner 2, 3 og 4 (D2-D4).
  4. Fortynn de ekstraherte glykanprøvene og definerte glykansubstrater 1: 1 (v / v) med GSB ved å tilsette 25 μL ekstrahert glykanprøve til D1-brønnene i rekkefølge.
  5. Seriell fortynn hver prøve fire ganger ved å ta 10 μL av prøven fra D1-brønnen og legge til D2-brønnen. Aspirer forsiktig med en pipette for å blande.
  6. Gjenta prosessen ved å ta 10 μL prøve fra D2-brønnen og legge den til D3-brønnen.
  7. Gjenta for D4 godt. Etter blanding kastes 10 μL fra D4-brønnen slik at hver brønn inneholder et endelig volum på 40 μL.
  8. Tilsett 40 μL blekkløsning og GSB til den endelige blokken på den endelige platen.
  9. Dekk platene med et selvklebende platedeksel og sentrifuge i 10 minutter ved 3000 x g (romtemperatur). Forsikre deg om at ingen bobler forblir etter sentrifugering og gjenta om nødvendig.
  10. Bruk en berøringsfri piezoelektrisk mikroarray-utskriftsrobot til å skrive ut prøvene på nitrocellulosemembranen (se materialfortegnelsen) ved å følge trinnene nedenfor.
    MERK: Nedenfor er handlinger som anbefales for optimal utskriftskvalitet; Imidlertid vil de spesifikke parametrene som kreves, til slutt avhenge av instrumentet som brukes. Vi anbefaler at brukere kontakter instrumentprodusenten for å diskutere passende tilpasninger og utskriftsinnstillinger som kreves for enheten.
    1. Før utskrift må du tømme avfallsbufferbeholderen og fylle det rene bufferreservoaret med ren GSB etter behov. Slå på instrumentet og la det stabilisere seg i >10 minutter hvis det har et integrert fuktighets- og temperaturkontrollsystem. Slå på mikromatrisen og initialiser systemet.
      MERK: Det anbefales å kjøre en test for å bestemme instrumentets indre trykk. Hvis trykket er for lavt, kan det være nødvendig å utføre en høytrykksrensing. Igjen, kontakt instrumentprodusenten for å diskutere den spesifikke driften av det spesifikke instrumentet.
    2. Rens skrivehodet og kapillærene flere ganger med GSB for å fjerne rusk og potensielle forurensninger. Utfør en testutskrift ved enten å legge i en plate med GSB alene eller sette instrumentet opp til å skrive ut direkte fra det rene bufferreservoaret, og omgå prøveaspirasjon fra en lastet plate.
      MERK: Det er ikke nødvendig å utføre testutskriften ved hjelp av en nitrocellulosemembran; Rene lysbilder med mikroskop er tilstrekkelig og har den fordelen at spotstørrelsen, formen og kvaliteten kan vurderes visuelt før prøveutskrift.
    3. Når du skriver ut ekstraherte glykanprøver, programmer systemet til å skylle med ren GSB mellom hver prøve.
      MERK: Vanligvis er prøvevolumet per trykt punkt 100 pL til 10 nL, og spotstørrelsen varierer fra 20 μm til 100 μm, avhengig av valgt prøvevolum. Utskrift av 100 mikromatriser fra en 384-brønnsplate tar omtrent 40 minutter, inkludert systemspyling. De resulterende mikromatrisene vil være omtrent 1 cm2 i størrelse. Ytterligere plater vil øke lengden på matrisen med omtrent 1 cm per plate. Et skjema over den trykte mikroarray-designen er vist i figur 3. Når de er skrevet ut, er mikromatrisene klare til bruk umiddelbart og kan lagres i flere år. Hvis utskriftsjobben må gjentas av en eller annen grunn, på grunn av potensiell fordampning av prøver under utskrift, anbefales det at en ny prøveplate lastes og originalplaten kastes.
    4. En gang i uken, rengjør skrivehodet og kapillærene grundig. Gjør dette ved å laste en 384-brønn som inneholder en 1:20 fortynning av konsentrert NaOH i GSB og utføre en 40 min til 1 t utskriftskjøring på mikroskoplysbilder. Brukere bør forsikre seg om at denne rengjøringsløsningen er kompatibel med instrumentet før de fortsetter.
  11. Lagre den unike rutenettfilen (.gal-filen) som er produsert for den trykte mikromatrisen, klar for nedstrømsanalyse.

6. Microarray sondering

  1. Klipp ut individuelle, identiske trykte mikromatriser fra nitrocellulosemembranen og plasser dem i en passende størrelse beholder for sondering (f.eks. En 12- eller 24-brønns mikrotiterplate) (se materialfortegnelse). Arrayet skal ligge flatt på bunnen av fartøyet. En mikroarray kreves per sonde og representerer en teknisk replikasjon.
  2. For å redusere uspesifikk binding, inkuber mikromatrisene i 1 time i MP-TBST blokkeringsbuffer (1x Tris-bufret saltvann, pH 7,5, + 0,1% [v / v] TWEEN 20 [TBST] og supplert med 5% [w / v] skummetmelkpulver; se materialfortegnelse) på en roterende / gyngende shaker. Kontroller at volumet er tilstrekkelig til å senke hele matrisen.
  3. Etter inkubasjon, fjern MP-TBST og erstatt den med et nytt volum MP-TBST.
  4. Inkuber matrisene med monoklonale antistoffer (mAbs) eller His-merkede CBM, eller andre GRMPs (f.eks. lektiner), fortynnet 1: 10-1: 1,000 (som spesifisert av produsenten; se materialfortegnelse) i MP-TBST i 2 timer på en roterende / gyngende shaker.
  5. Etter inkubasjon, fjern den molekylære sondeløsningen og dekk arrayene i ren TBST, slik at arrayene er helt nedsenket. For å fjerne gjenværende sondeoppløsning, fjern umiddelbart TBST og erstatt med et nytt volum. Plasser matrisene på en roterende/gyngende shaker i 5 min. Etter 5 min, fjern TBST, erstatt med et nytt volum, og legg på en roterende / gyngende shaker i 5 min.
    MERK: Denne prosessen bør gjentas tre ganger, ikke inkludert den første tilsetningen og umiddelbar fjerning av TBST.
  6. Inkuber matrisene med alkalisk-fosfatase-konjugerte sekundære antistoffer (anti-mus, anti-rotte, antikanin, anti-His, etter behov; se materialfortegnelse) fortynnet 1:1,000 i MP-TBST i 2 timer på en gyngende / roterende shaker.
    MERK: Pepperrotperoksidase-konjugerte sekundære antistoffer er også egnet, brukt sammen med tetrametylbenzidin (TMB) / hydrogenperoksidsubstrat for fargeutvikling.
  7. Etter inkubasjon, gjenta vaskeprosedyren, i henhold til trinn 6.5, for å fjerne ikke-spesifikt bundne sekundære antistoffer.
  8. Dekk matrisene i nitroblå tetrazolium (NBT)/5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP) fargeutviklingsløsning (se materialfortegnelse) for kromogen påvisning av antistoffbinding. La ligge til lilla bunnfall flekker utvikles på antigenbindingsstedene (vanligvis 5-30 minutter, men arrayene bør overvåkes nøye for å unngå overmetning, da reaksjonen kan oppstå raskt).
    FORSIKTIG: BCIP er skadelig når den kommer i kontakt med huden og kan forårsake irritasjon i luftveiene. Bruk PPE. Unngå støvdannelse. Unngå å puste inn støv.
  9. For å avslutte reaksjonen, senk arrayene i rent vann fra springen og vask mye.
  10. Plasser matrisene mellom blottpapir over natten ved omgivelsestemperatur for å tørke.
  11. Kast matrisene med åpenbare feil og gjenta sonderingsprotokollen i slike tilfeller (figur 4).

7. Analyse og kvantifisering

  1. Skann de utviklede matrisene med en oppløsning på 2 400 punkter per tomme (ppt) ved hjelp av en stasjonær skanner. Konverter bildene til TIFF-filer og deretter til negativer.
  2. Ved hjelp av mikromatriseanalyseprogramvare (se Materialfortegnelse) legger du den unike .gal-rutenettfilen på hvert mikromatrisebilde for å beregne fargeintensiteten til stedet som produseres på hvert antigenbindingssted og trekke fra den lokale bakgrunnen.
  3. Eksporter rutenettdataene som en .txt-fil. Disse kan deretter importeres manuelt til et Excel-ark for analyse.
  4. Generer en gjennomsnittlig punktsignalintensitetsverdi for hver prøve ved å beregne gjennomsnittet av punktintensiteten først over hver prøvefortynning og deretter på tvers av eventuelle biologiske replikater som er inkludert.
  5. Tilordne en verdi på 100 til den høyeste gjennomsnittlige spotsignalintensiteten og normaliser de gjenværende dataene tilsvarende.
    MERK: Normaliserte gjennomsnittlige punktsignalintensiteter kan deretter presenteres som et varmekart over relativ glykanepitopmengde ved hjelp av funksjonen for betinget formatering i Excel33, eller ved hjelp av geom_tile-funksjonen i R ggplot2-pakke40,41.

Representative Results

MAPP ble brukt for å bestemme glykansammensetningen av landbruksbiomasseavfall, bestående av mangoskall fra flere nordlige thailandske varianter, Coffea arabica kirsebærmasse og kaffebønnebehandlingsavfall, og rot-, stamme- og bladvev fra thailandsk svart hvitløk, Allium sativum var. ophioscorodon. Flere planteavledede polysakkarider brukes i næringsmiddelindustrien som funksjonelle ingredienser 42,43. Dermed var målet med dette eksperimentet å utlede om disse rikelig og for tiden underutnyttede agroindustrielle avfallsmaterialene kan gi en kilde til verdiskapende rene polysakkarider.

AIR-materiale brukes rutinemessig til å fremstille prøver beregnet for glykananalyse44. Det er flere fordeler med å bruke AIR; behandling med løsningsmidler fjerner effektivt endogene CAZymes, metabolitter, små sakkarider, lipider og pigmenter, noe som resulterer i prøver beriket med polysakkarider og strukturelle proteiner34. Videre er produksjon av AIR en rask og effektiv måte å øke prøvens levetid på, da den er termostabil og kan lagres i flere år.

Tre blandede fraksjoner av bestanddeler glykaner ble sekvensielt ekstrahert fra plante AIR-materiale ved bruk av CDTA, NaOH og cellulase. CDTA-chelater Ca2+ ioner, som tillater fjerning av Ca2+ tverrbundne de-esterifiserte pektiner fra plantecellevegger45. Alkaliske forhold tillater overveiende hemicelluloser, som mannan, xylan og β-glukan, å frigjøres på grunn av forstyrrelsen av hydrogenbinding og forsåpning av esterbindinger mellom cellulosemikrofibriller og hemicellulose, og henholdsvis lignin og hemicellulose46. En rekombinant endo-1,4-β-glukanase fra Bacillus spp. ble brukt til å nedbryte amorfe regioner av strukturelle cellulosemikrofibriller, og frigjøre gjenværende glykaner bundet til cellulose i celleveggene47. Selv om denne metoden effektivt skiller glykaner i disse tre brede gruppene, bør det bemerkes at prøvene ikke er rene; Av selve ekstraksjonsmetodens natur vil hemicellulose, hvis den er tilstede i prøven, uunngåelig bli ekstrahert og deretter detektert i varierende grad i CDTA- og cellulasefraksjonene. På samme måte vil noe pektin bli påvist i NaOH-ekstraksjonen hvis det er tilstede i prøven.

En ikke-kontakt, piezoelektrisk mikroarray-utskriftsrobot ble brukt til å immobilisere ekstraherte glykanfraksjoner på nitrocellulose via ikke-kovalent vedlegg11, og dannet 300 identiske mikromatriser. Definerte glykanstandarder (tabell 1) ble også inkludert i de trykte mikromatrisene som positive kontroller (figur 5). MAPP-bindingsprofilen oppnådd for de valgte glykanstandardene tilsvarer tidligere rapporterte epitopspesifisiteter. For eksempel viste LM21 sterk binding til flere mannanpolysakkarider (galaktomannan og glucomannan), mens LM22 bare viste svak binding til galaktomannan25. På samme måte er LM19 fortrinnsvis bundet til de-esterifisert homogalakturonan48 og LM15 bundet til tamarindfrø xyloglukan23.

Den relative forekomsten av 16 epitoper, diagnostiske for ikke-cellulose plantecelleveggpolysakkarider, ble påvist ved festing av glykanrettede monoklonale antistoffer (tab 2) til trykte ekstrakter (figur 6). Flertallet av ekstraherte glykaner ble detektert innenfor den alkaliske NaOH-fraksjonen. Sterke bindingssignaler ble registrert for mAbs LM10 og LM11, som representerer xylan/arabinoxylan, innenfor skallet av alle de testede mangovariantene. Innenfor hvitløksprøvene bundet LM10 og LM11 fortrinnsvis til rotvevekstrakt (hvitløk R) og viste bare svak binding til bladvevekstraktet (hvitløk L). LM19, som representerer delvis metylesterifisert eller ikke-esterifisert homogalakturonan, bundet sterkt til noen mangosortekstrakter (Aokrong og Talabnak), men bundet bare svakt, eller bindingen var umulig å oppdage, i andre varianter (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok, og Nga). I tillegg bundet LM19 bare til kaffemassefraksjonene og bandt seg ikke til kaffebønnebehandlingsavfallet, tidligere antatt å bestå av halvrenset kaffepektin (upubliserte data).

Figure 1
Figur 1: Store eksperimentelle trinn i MAPP-metoden. (A) Prøvene homogeniseres for å danne fine pulver. (B) De homogeniserte prøvene behandles for å isolere deres AIRs. (C) De bestanddelene glykaner ekstraheres sekvensielt ved hjelp av et skreddersydd ekstraksjonsregime. (D) De ekstraherte glykanfraksjonene, blekk og GSB overføres til 384-brønnplater, i henhold til plateoppsettet, for utskrift på nitrocellulose. (E) De trykte mikromatrisene undersøkes med utvalgte GRMP-er. (F) GRMP-binding til de trykte glykanfraksjonene kvantifiseres og analyseres før data presenteres som et varmekart. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på et 384-brønns plateoppsett for prøve-, blekk- og GSB-belastning med fire fortynninger per ekstrahert glykanprøve / standard. Ulike farger angir prøver som oppstår fra forskjellige ekstraksjonsreagenser, mens forskjellige nyanser representerer serielle fortynninger. Det første tallet i koden representerer prøvenummeret, mens sluttnummeret representerer fortynningstallet (D1 angir fortynning én, D2 angir fortynning to og så videre). For eksempel representerer en brønn merket '12D3' glykanprøve 12, fortynning tre. Brønnplater skal deles inn i åtte identiske seksjoner bestående av seks kolonner og åtte rader. Den første delen av den første platen skal bare inneholde blekk og buffer og ligne eksempelplateoppsettet. Ekstraherte glykanprøver kan deretter lastes inn i påfølgende plateseksjoner i henhold til plateoppsettet. Ulike ekstraksjonsreagenser skal ikke lastes inn i samme plateseksjon. Hvis det ikke er nok prøver til å fylle en hel seksjon, fyll alle gjenværende brønner i den seksjonen med buffer; Ikke la noen brønner stå tomme. Hvis det kreves flere plater, bør neste seksjon etter at alle prøvene er lastet, inneholde tre vekslende kolonner med blekk og GSB - dette kan ikke være seksjon åtte, avhengig av antall prøver som skrives ut. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk fremstilling av trykt microarray design. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative mikromatriser. (A) Ingen binding. (B) Bindingssignalet er skjult av høyt bakgrunnssignal. (C) Generalisert blå/lilla farging på grunn av overmetning med NBT/BCIP. (D) Defekt sondering på grunn av høy substratkonsentrasjon. (E) Defekt utskrift på grunn av det urene skrivehodet. (F) Sterk binding til få prøver. (G) Sterk binding til mange prøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Monoklonalt antistoffbinding til definerte glykanstandarder, inkludert for å validere utskrifts- og sonderingsprosessen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: MAPP av glykaner ekstrahert fra landbruksbiomasseavfall. Prøvene inkluderer kaffemasseavfall (kaffemasse og kaffepektin), mangoskall fra flere thailandske varianter (AO, Aokrong; KO, Kam; RD, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; TL, Talabnak; MH, Mahachanok; NG, Nga) og svarte hvitløkblader (hvitløk L), stamme (hvitløk S), pære (hvitløk BG) og røtter (hvitløk R), ved hjelp av CDTA, NaOH og cellulase (Bacillus spp. cellulase 5A). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Definerte kommersielle polysakkaridstandarder brukt i MAPP-analyse som positive kontroller. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Glykanrettede monoklonale antistoffer valgt for undersøkelse av ekstraherte planteglykanmikromatriser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

MAPP-teknikken beskrevet her er nå en veletablert metode for glykananalyse. De grunnleggende prinsippene ble først beskrevet i 200711, men teknikken har gjennomgått kontinuerlig utvikling for å kapitalisere på de nyeste innovasjonene innen mikroarray-teknologi, molekylær sondeutvikling og fremskritt i vår forståelse av glykanbiokjemi. Generelt er glykaner, spesielt polysakkarider, mer utfordrende å analysere enn proteiner og nukleotider på grunn av deres strukturelle kompleksitet og heterogenitet45, samt det faktum at de ikke lett kan sekvenseres eller syntetiseres1. I mange tilfeller kan ingen enkelt teknikk dechiffrere glykankompleksiteten avgjørende; Dermed brukes MAPP ofte med andre metoder. Dette er en av grunnene til at AIR-preparat vanligvis velges som utgangspunkt for MAPP, siden AIR er kompatibel med de fleste andre glykananalysemetoder34, noe som letter den påfølgende sammenligningen av datasett.

På grunn av homogenisering av prøven før AIR-forberedelse, går noe romlig informasjon alltid tapt. Imidlertid, da polysakkarider frigjøres sekvensielt fra prøver, gir tilstedeværelsen av epitoper i de oppnådde fraksjonene informasjon om molekylær arkitektur og sammensetning av prøven17. Dermed er valg av et passende ekstraksjonsregime avgjørende for metodens suksess. Flere parametere bestemmer egnetheten til ekstraksjonsmetoden: cellulær struktur, tid, temperatur, pH, trykk, ionstyrke av løsningsmidlet og finhet av den faste partikkelprøven49. Det anbefales at en rekke stadig mer aggressive løsningsmidler brukes til å maksimere sannsynligheten for vellykket ekstrahering av bestanddeler glykaner og bygge et representativt komposisjonsbilde av prøven. For de fleste prøver er CDTA, NaOH og cellulase tilstrekkelig til å fjerne planteavledet lagring og celleveggpolysakkarider 33,50,51,52. For noen vevsprøver har et hybridekstraksjonsregime som også inkluderer CaCl2, HCl og Na2CO3 vist seg å være vellykket53, mens marine mikroalgeprøver kan kreve tilsetning av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) 10.

Mikromatriser bør inneholde en rekke rene, definerte glykanstandarder som skal brukes som positive kontroller5. Inkluderte standarder bør endres i henhold til prøvens art. Når de er skrevet ut, må riktige GRMP-er velges. Genereringen av hybridoma mAbs til polysakkaridstrukturer er utfordrende54; Glykanbindende antistoffer er vanskelige å heve og kan ha lav affinitet55. Heldigvis kan gensekvensinformasjon for CBM oppnås relativt enkelt for rekombinant uttrykk4 og engineering deres bindingsspesifisiteter56,57. Mens en imponerende katalog over GRMP-er har blitt utviklet, med de fleste nå tilgjengelige fra kommersielle kilder, i forhold til mangfoldet av glykanstrukturer som eksisterer i naturen, har bare en liten andel blitt produsert og vellykket karakterisert58. Dette kan begrense muligheten til å oppdage og diskriminere mellom visse strukturer. Det anbefales å utføre et innledende sonderingseksperiment ved å bruke en eller to sonder som er representative for hver hovedglykanstruktur som forventes å være til stede, for hvilken bindingsspesifisiteten er godt karakterisert. I etterfølgende sonderingseksperimenter kan sondelisten utvides til å dekke et bredere spekter av glykaner og dykke dypere inn i fine strukturer.

Selv om det er dagligdags, er det grunnleggende å sikre at mikromatriser vaskes grundig etter hvert inkubasjonstrinn. Den ineffektive fjerningen av ikke-spesifikt bundne sonder vil sannsynligvis skjule resultatet ved å forårsake et høyt bakgrunnssignal etter fargeutvikling. I dette tilfellet er det nødvendig å gjenta sonderingsprosedyren, og starte med en ny mikromatrise. Videre bør arrays berøres sparsomt og bare ved å holde kantene med tang; Nitrocellulosemembranen er sprø og lett skadet. Fargeutviklingsløsningen samler seg i sprekker og bretter, noe som forårsaker overmetning, noe som hindrer matriseanalyse.

MAPP er rask, tilpasningsdyktig og praktisk. Denne metoden er kompatibel med dyre-, mikrobielle- eller planteglykaner avledet fra ethvert biologisk eller industrielt system, så lenge de kan ekstraheres og immobiliseres på nitrocellulose, og for hvilken man har passende molekylære prober. Dataene som genereres gir detaljert, semi-kvantitativ, kompositorisk innsikt, som ikke lett kan oppnås via andre glykananalysemetoder.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne ArrayJet for deres ekspertråd om microarray robotikk. SS og JS ønsker å anerkjenne støtten fra Fundamental Fund 2022 (FF65/004), Chiang Mai University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) Megazyme P-LICHN
1,4-β-D-Mannan Megazyme P-MANCB
384-well microtiter plate Greiner Bio-One M1686
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) Melford B74100-1.0
Acetone Sigma 270725
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 112-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag Jackson ImmunoResearch 300-055-240
Arabinoxylan (wheat) Megazyme P-WAXYL
Array-Pro Analyzer Software Media Cybernetics Version 6.3
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) NZYTech CZ0564
BAM antibodies SeaProbes Various
Black drawing ink (indian ink) Winsor & Newton GWD030
Carbohydrate binding modules NZYTech Various
CCRC antibodies CarboSource Various
CDTA Sigma 319945
Chloroform Sigma PHR1552
Ethanol Sigma 1.11727
Galactan (potato) Megazyme P-GALPOT
Galactomannan (carob) Megazyme P-GALML
Glycerol solution Sigma 49781-5L
Gum tragacanth (legumes) Sigma-Aldrich G1128
INCh antibodies INRA Various
LM and JIM antibodies PlantProbes Various
Marathon Argus Microarray Printer ArrayJet
Methanol Sigma  34860
Monoclonal antibodies Biosupplies Australia Various
NaBH4 Sigma 452882
NaOH Sigma S5881
Nitro-blue tetrazolium (NBT) Melford N66000-1.0
Nitrocellulose membrane Thermo Fisher Scientific 88018
Pectin (degree of methyl esterification 46%) Danisco NA
ProClin 200 Sigma 48171-U
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) Megazyme P-RHAGN
Rotating mixer Fisher Scientific 88-861-050
Rotating/rocking Shaker Cole-Parmer
Skimmed milk powder Marvel
Spin filter Costar Spin-X 8160
Stainless steel beads Qiagen 69989
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris Sigma 93362
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Xylan (beechwood) Megazyme P-XYLNBE
Xyloglucan (tamarind) Megazyme P-XYGLN
β-Glucan (oat) Megazyme P-BGOM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amicucci, M. J., et al. A nonenzymatic method for cleaving polysaccharides to yield oligosaccharides for structural analysis. Nature Communications. 11 (1), 3963 (2020).
  2. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Evolution of glycan diversity. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  3. Willats, W. G. T., McCartney, L., Knox, J. P. Pectin cell biology: complexity in context. Advances in Pectin and Pectinase Research. , Springer. Netherlands. 147-157 (2003).
  4. Cummings, R. D., et al. Glycan-recognizing probes as tools. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  5. Bakshani, C. R., et al. Analysis of glycans in a Burnt-on/Baked-on (BoBo) model food soil using Microarray Polymer Profiling (MAPP) and immunofluorescence microscopy. Food Chemistry. 410, 135379 (2023).
  6. Salmeán, A. A., Willats, W. G. T., Ribeiro, S., Andersen, T. J., Ellegaard, M. Over 100-year preservation and temporal fluctuations of cell wall polysaccharides in marine sediments. Frontiers in Plant Science. 13, 785902 (2022).
  7. Cid, M., et al. Recognition of the helical structure of β-1,4-galactan by a new family of carbohydrate-binding modules. Journal of Biological Chemistry. 285 (46), 35999-36009 (2010).
  8. Runavot, J. -L., et al. Non-cellulosic polysaccharides from cotton fibre are differently impacted by textile processing. PLoS One. 9 (12), e115150 (2014).
  9. Ahl, L. I., et al. Analyses of aloe polysaccharides using carbohydrate microarray profiling. Journal of AOAC International. 101 (6), 1720-1728 (2018).
  10. Vidal-Melgosa, S., et al. Diatom fucan polysaccharide precipitates carbon during algal blooms. Nature Communications. 12 (1), 1150 (2021).
  11. Moller, I., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant Journal. 50 (6), 1118-1128 (2007).
  12. Ruprecht, C., et al. A synthetic glycan microarray enables epitope mapping of plant cell wall glycan-directed antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  13. Cummings, R. D., et al. Principles of glycan recognition. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  14. Gao, C., et al. Glycan microarrays as chemical tools for identifying glycan recognition by immune proteins. Frontiers in Chemistry. 7, 833 (2019).
  15. Vidal-Melgosa, S., et al. A new versatile microarray-based method for high throughput screening of carbohydrate-active enzymes. Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9020-9036 (2015).
  16. Willats, W. G. T., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: A novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  17. Sørensen, I., et al. The charophycean green algae provide insights into the early origins of plant cell walls. The Plant Journal. 68 (2), 201-211 (2011).
  18. Liu, D., Tang, W., Yin, J. -Y., Nie, S. -P., Xie, M. -Y. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development. Food Hydrocolloids. 116, 106641 (2021).
  19. Pattathil, S., et al. A comprehensive toolkit of plant cell wall glycan-directed monoclonal antibodies. Plant Physiology. 153 (2), 514-525 (2010).
  20. Verhertbruggen, Y., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. The Plant Journal. 59 (3), 413-425 (2009).
  21. Rydahl, M. G., et al. Development of novel monoclonal antibodies against starch and ulvan - implications for antibody production against polysaccharides with limited immunogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 9326 (2017).
  22. McCartney, L., Marcus, S. E., Knox, J. P. Monoclonal antibodies to plant cell wall xylans and arabinoxylans. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (4), 543-546 (2005).
  23. Marcus, S. E., et al. Pectic homogalacturonan masks abundant sets of xyloglucan epitopes in plant cell walls. BMC Plant Biology. 8, 60 (2008).
  24. Pedersen, H. L., et al. Versatile high resolution oligosaccharide microarrays for plant glycobiology and cell wall research. The Journal of Biological Chemistry. 287 (47), 39429-39438 (2012).
  25. Marcus, S. E., et al. Restricted access of proteins to mannan polysaccharides in intact plant cell walls. The Plant Journal. 64 (2), 191-203 (2010).
  26. Smallwood, M., Martin, H., Knox, J. P. An epitope of rice threonine-and hydroxyproline-rich glycoprotein is common to cell wall and hydrophobic plasma-membrane glycoproteins. Planta. 196 (3), 510-522 (1995).
  27. Smallwood, M., Yates, E. A., Willats, W. G. T., Martin, H., Knox, J. P. Immunochemical comparison of membrane-associated and secreted arabinogalactan-proteins in rice and carrot. Planta. 198 (3), 452-459 (1996).
  28. Wisniewski, J. P., Rathbun, E. A., Knox, J. P., Brewin, N. J. Involvement of diamine oxidase and peroxidase in insolubilization of the extracellular matrix: implications for pea nodule initiation by Rhizobium leguminosarum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13 (4), 413-420 (2000).
  29. Jones, L., Seymour, G. B., Knox, J. P. Localization of pectic galactan in tomato cell walls using a monoclonal antibody specific to (1[->]4)-β-D-galactan. Plant Physiology. 113 (4), 1405-1412 (1997).
  30. Willats, W. G., Marcus, S. E., Knox, J. P. Generation of a monoclonal antibody specific to (1→5)-α-L-arabinan. Carbohydrate Research. 308 (15), 149-152 (1998).
  31. Cornuault, V., et al. LM6-M: a high avidity rat monoclonal antibody to pectic α-1, 5-L-arabinan. BioRxiv. , 161604 (2017).
  32. Sutherland, P., Hallett, I., Jones, M. Probing cell wall structure and development by the use of antibodies: a personal perspective. New Zealand Journal of Forestry Science. 39, 197-205 (2009).
  33. Mikkelsen, M. D., et al. Ancient origin of fucosylated xyloglucan in charophycean green algae. Communications Biology. 4 (1), 754 (2021).
  34. Fangel, J. U., Jones, C. Y., Ulvskov, P., Harholt, J., Willats, W. G. T. Analytical implications of different methods for preparing plant cell wall material. Carbohydrate Polymers. 261, 117866 (2021).
  35. Moore, J. P., et al. Analysis of plant cell walls using high-throughput profiling techniques with multivariate methods. The Plant Cell Wall: Methods and Protocols. , Springer. New York. 327-337 (2020).
  36. Gao, Y., Fangel, J. U., Willats, W. G. T., Moore, J. P. Tracking polysaccharides during white winemaking using glycan microarrays reveals glycoprotein-rich sediments. Food Research International. 123, 662-673 (2019).
  37. Solden, L. M., et al. Interspecies cross-feeding orchestrates carbon degradation in the rumen ecosystem. Nature Microbiology. 3 (11), 1274-1284 (2018).
  38. Fangel, J. U., et al. Tracking polysaccharides through the brewing process. Carbohydrate Polymers. 196, 465-473 (2018).
  39. Mravec, J., et al. Pea border cell maturation and release involve complex cell wall structural dynamics. Plant Physiology. 174 (2), 1051-1066 (2017).
  40. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. New York. NY. (2009).
  41. Gu, Z. Complex heatmap visualization. iMeta. 1 (3), 43 (2022).
  42. Nasrollahzadeh, M., Nezafat, Z., Shafiei, N., Soleimani, F. Polysaccharides in Food Industry. , Elsevier. Iran. (2021).
  43. Shao, P., et al. Recent advances in improving stability of food emulsion by plant polysaccharides. Food Research International. 137, 109376 (2020).
  44. Sanz, M. L., Martínez-Castro, I. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates. Journal of Chromatography. A. 1153 (1-2), 74-89 (2007).
  45. Bethke, G., Glazebrook, J. Cyclohexane diamine tetraacetic acid (CDTA) extraction of plant cell wall pectin. Bio-Protocol. 4 (24), e1357 (2014).
  46. Lu, Y., He, Q., Fan, G., Cheng, Q., Song, G. Extraction and modification of hemicellulose from lignocellulosic biomass: A review. Green Processing and Synthesis. 10 (1), 779-804 (2021).
  47. Jayasekara, S., Ratnayake, R. Microbial cellulases: an overview and applications. Cellulose. 22, 92 (2019).
  48. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., Ordaz-Ortiz, J. J., Knox, J. P. An extended set of monoclonal antibodies to pectic homogalacturonan. Carbohydrate Research. 344 (14), 1858-1862 (2009).
  49. Villares, A., Mateo-Vivaracho, L., Guillamón, E. Structural features and healthy properties of polysaccharides occurring in mushrooms. Agriculture. 2 (4), 452-471 (2012).
  50. Kračun, S. K., et al. Carbohydrate microarray technology applied to high-throughput mapping of plant cell wall glycans using comprehensive microarray polymer profiling (CoMPP). Methods in Molecular Biology. 1503, 147-165 (2017).
  51. Rajasundaram, D., et al. Understanding the relationship between cotton fiber properties and non-cellulosic cell wall polysaccharides. PLoS One. 9 (11), e112168 (2014).
  52. Michalak, L., et al. Microbiota-directed fibre activates both targeted and secondary metabolic shifts in the distal gut. Nature Communications. 11 (1), 5773 (2020).
  53. Salmeán, A. A., Hervé, C., Jørgensen, B., Willats, W. G., Mravec, J. Microarray glycan profiling reveals algal fucoidan epitopes in diverse marine metazoans. Frontiers in Marine Science. 4, 293 (2017).
  54. Knox, J. P. Revealing the structural and functional diversity of plant cell walls. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 308-313 (2008).
  55. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17-23 (2007).
  56. Stephen, P., Tseng, K. -L., Liu, Y. -N., Lyu, P. -C. Circular permutation of the starch-binding domain: inversion of ligand selectivity with increased affinity. Chemical Communications. 48 (20), 2612-2614 (2012).
  57. Gunnarsson, L. C., Dexlin, L., Karlsson, E. N., Holst, O., Ohlin, M. Evolution of a carbohydrate binding module into a protein-specific binder. Biomolecular Engineering. 23 (2-3), 111-117 (2006).
  58. Moller, I., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchical clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25 (1), 37-48 (2008).

Tags

Mikroarray-polymerprofilering (MAPP) høykapasitets glykananalyse glykaner glykokonjugater biologiske prøver plantevev algevev matmaterialer humane prøver dyreprøver mikrobielle prøver mikromatriseteknologi screeningplattform glykanrettede molekylære prober analytter kjemisk fraksjonering enzymatisk fraksjonering nitrocellulosemembraner glykansammensetning glykangjenkjennende molekylære prober konvensjonelle glykananalyseteknikker monosakkaridanalyse Koblingsanalyse massespektrometri
Mikroarray-polymerprofilering (MAPP) for glykananalyse med høy gjennomstrømning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bakshani, C. R., Sangta, J.,… More

Bakshani, C. R., Sangta, J., Sommano, S., Willats, W. G. T. Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis. J. Vis. Exp. (199), e65443, doi:10.3791/65443 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter