Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Decellulariserte Apple-avledede stillaser for beinvevsteknikk in vitro og in vivo

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65226
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4,5, 1,2,6,7
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Biology, University of Ottawa, 3Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa, 4Department of Surgery, University of Ottawa, 5Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 6Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa, 7SymbioticA, School of Human Sciences, University of Western Australia

Summary

I denne studien beskriver vi metoder for decellularisering, fysisk karakterisering, avbildning og in vivo implantasjon av plantebaserte biomaterialer, samt metoder for cellesåing og differensiering i stillasene. De beskrevne metodene tillater evaluering av plantebaserte biomaterialer for beinvevstekniske applikasjoner.

Abstract

Planteavledede cellulosebiomaterialer har blitt brukt i ulike vevstekniske applikasjoner. In vivo-studier har vist den bemerkelsesverdige biokompatibiliteten til stillaser laget av cellulose avledet fra naturlige kilder. I tillegg har disse stillasene strukturelle egenskaper som er relevante for flere vev, og de fremmer invasjon og spredning av pattedyrceller. Nyere forskning ved bruk av decellularisert eplehypanthiumvev har vist likheten av porestørrelsen til trabekulær bein, samt dens evne til effektivt å støtte osteogen differensiering. Denne studien undersøkte videre potensialet til epleavledede cellulosestillas for benvevsteknikk (BTE) applikasjoner og evaluerte deres in vitro og in vivo mekaniske egenskaper. MC3T3-E1 preosteoblaster ble sådd i epleavledede cellulosestillaser som deretter ble vurdert for deres osteogene potensial og mekaniske egenskaper. Alkalisk fosfatase og alizarinrød S-farging bekreftet osteogen differensiering i stillas dyrket i differensieringsmedium. Histologisk undersøkelse viste utbredt celleinvasjon og mineralisering over stillasene. Skanning elektronmikroskopi (SEM) avslørte mineralaggregater på overflaten av stillasene, og energidispersiv spektroskopi (EDS) bekreftet tilstedeværelsen av fosfat- og kalsiumelementer. Til tross for en betydelig økning i Youngs modul etter celledifferensiering, forblir den imidlertid lavere enn for sunt beinvev. In vivo studier viste celleinfiltrasjon og avsetning av ekstracellulær matriks i decellulariserte epleavledede stillaser etter 8 ukers implantasjon i rotte calvaria. I tillegg var kraften som kreves for å fjerne stillasene fra beindefekten lik den tidligere rapporterte bruddbelastningen av innfødt kalvarialbein. Samlet sett bekrefter denne studien at epleavledet cellulose er en lovende kandidat for BTE-applikasjoner. Ulikheten mellom dets mekaniske egenskaper og egenskapene til sunt beinvev kan imidlertid begrense anvendelsen til lavlastbærende scenarier. Ytterligere strukturell rekonstruksjon og optimalisering kan være nødvendig for å forbedre de mekaniske egenskapene til epleavledede cellulosestillas for bærende applikasjoner.

Introduction

Store beindefekter forårsaket av en skade eller sykdom krever ofte biomateriale transplantater for fullstendig regenerering1. Nåværende teknikker utviklet for å forbedre beinvevregenerering bruker regelmessig autologe, allogene, xenogene eller syntetiske transplantater2. For autolog bentransplantasjon, betraktet som "gullstandard" podepraksis for å reparere store beindefekter, blir bein ekstrahert fra pasienten. Imidlertid har denne podeprosedyren flere ulemper, inkludert størrelses- og formbegrensninger, vevstilgjengelighet og sykelighet på prøvetakingsstedet3. Videre er autologe transplantasjonsprosedyrer utsatt for infeksjoner på operasjonsstedet, påfølgende brudd, hematomdannelse på prøvetakingsstedet eller rekonstruert sted og postoperativ smerte4. Benvevsteknikk (BTE) tilbyr et potensielt alternativ til konvensjonelle bentransplanteringsmetoder5. Den kombinerer strukturelle biomaterialer og celler for å bygge nytt funksjonelt beinvev. Når du designer biomaterialer for BTE, er det viktig å kombinere en makroporøs struktur, overflatekjemi som fremmer cellefeste og mekaniske egenskaper som ligner de av innfødt bein6. Tidligere forskning har indikert at den ideelle porestørrelsen og elastiske modulen for biomaterialer som brukes i BTE er henholdsvis ca. 100-200 μm7 og 0,1-20 GPa, avhengig av podestedet8. Dessuten er stillasets porøsitet og poresammenkobling kritiske faktorer som påvirker cellemigrasjon, næringsdiffusjon, og angiogenese8.

BTE har vist lovende resultater med ulike biomaterialer utviklet og evaluert som alternative alternativer til beintransplantater. Noen av disse biomaterialene er osteoinduktive materialer, hybridmaterialer og avanserte hydrogeler8. Osteoinduktive materialer stimulerer utviklingen av nydannede beinstrukturer. Hybridmaterialer består av syntetiske og/eller naturlige polymerer8. Avanserte hydrogeler etterligner den ekstracellulære matriksen (ECM) og er i stand til å levere de nødvendige bioaktive faktorene for å fremme beinvevsintegrasjon8. Hydroksyapatitt er et tradisjonelt materiale og et vanlig valg for BTE på grunn av dets sammensetning og biokompatibilitet9. Bioaktivt glass er en annen type biomateriale for BTE, som har vist seg å stimulere spesifikke celleresponser for å aktivere gener som er nødvendige for osteogenese10,11. Bionedbrytbare polymerer, inkludert poly (glykolsyre) og poly (melkesyre), har også blitt mye brukt i BTE-applikasjoner12. Endelig har naturlige eller naturlig avledede polymerer som kitosan, kitin og bakteriell cellulose også vist oppmuntrende resultater for BTE13. Imidlertid, mens både syntetiske og naturlige polymerer viser potensial for BTE, krever utviklingen av et funksjonelt stillas med ønsket makrostruktur vanligvis omfattende protokoller.

Omvendt kan innfødte makroskopiske cellulosestrukturer lett avledes fra forskjellige planter, og vår forskningsgruppe har tidligere demonstrert anvendeligheten av cellulosebaserte stillaser avledet fra planter til forskjellige vevsrekonstruksjoner. Faktisk, etter en enkel overflateaktiv behandling, utnyttet vi den iboende strukturen til plantematerialet, og fremhevet potensialet som et allsidig biomateriale14. Videre kan disse cellulosebaserte stillasene brukes til in vitro mammalske cellekulturapplikasjoner14, er biokompatible og støtter spontan subkutan vaskularisering 14,15,16,17. Både vår forskningsgruppe og andre har vist at disse stillasene kan fås fra spesifikke anlegg basert på den tiltenkte applikasjonen 14,15,16,17,18,19,20. For eksempel viser den vaskulære strukturen observert i plantestengler og blader en slående likhet med strukturen som finnes i animalsk vev19. I tillegg kan cellulosestillas avledet fra planter lett formes og utsettes for overflatebiokjemiske modifikasjoner for å oppnå de ønskede egenskapene16. I en nylig studie innlemmet vi en saltbuffer under decellulariseringsprosessen, noe som førte til forbedret cellevedlegg observert både in vitro og in vivo-innstillinger 16. I samme studie demonstrerte vi anvendeligheten av planteavledede cellulosestillas i sammensatte biomaterialer ved å støpe hydrogeler på overflaten av stillasene. I nyere studier har funksjonalisering av planteavledede stillaser vist seg å forbedre effektiviteten18. For eksempel viste en studie utført av Fontana et al. (2017) at adhesjonen av humane dermale fibroblaster ble støttet av RGD-belagte decellulariserte stengler, mens ikke-belagte stammer ikke viste samme evne18. Videre viste forfatterne også at modifisert simulert kroppsvæske kunne brukes til kunstig mineralisering av decellulariserte plantestengler. I nyere studier utforsket vi begrepet mekanosensitiv osteogenese i planteavledede cellulosestillas og vurderte potensialet for BTE17,20. Videre brukte Lee et al. (2019) planteavledede stillaser for å dyrke beinlignende vev i en in vitro-setting 21. Gjennom omfattende evalueringer av ulike plantekilder identifiserte forfatterne epleavledede stillaser som de mest optimale for kultur og differensiering av humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs). Videre foreslo forfatterne at de strukturelle og mekaniske egenskapene til de epleavledede stillasene spiller en sentral rolle i deres egnethet for det tiltenkte formålet. Som de første planteavledede stillasene implementert i vevstekniske applikasjoner, har epleavledede stillaser i stor grad vist seg å ha en slående lik arkitektur som menneskelig bein, spesielt når det gjelder deres sammenkoblede porer fra 100 til 200 μm i diameter14,21.

I denne studien undersøkte vi videre potensialet til epleavledede cellulosestillas for BTE og gjennomførte en analyse av deres mekaniske egenskaper både in vitro og in vivo. Selv om det har vært studier på potensialet til epleavledede stillaser for BTE 17,20,21, har deres mekaniske egenskaper blitt undersøkt. Resultatene viste wildspread invasjon og osteogen differensiering av MC3T3-E1 preosteoblaster sådd i stillaser som ble dyrket i differensieringsmedium i 4 uker. Youngs modul av disse stillasene var 192,0 ± 16,6 kPa, noe som var betydelig høyere enn de blanke stillasene (stillas uten sådde celler) (31,6 ± 4,8 kPa) og de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensieringsmedium (24,1 ± 8,8 kPa). Det skal imidlertid bemerkes at Youngs modul av sunt humant beinvev vanligvis faller innenfor området 0,1-2 GPa for trabekulært bein og ca. 15-20 GPa for kortikal bein8. Likevel, etter en 8-ukers implantasjon i en gnagerkalvarial defekt, syntes de cellefrøede stillasene å være godt integrert i det omkringliggende beinet, som demonstrert av en gjennomsnittlig toppkraft på 113,6 N ± 18,2 N i push-out-tester, som ligner den tidligere rapporterte bruddbelastningen av naturlig kalvarialben22. Samlet sett viser resultatene fra denne studien betydelige løfter, spesielt for ikke-bærende applikasjoner. Imidlertid har epleavledede cellulosestillas for øyeblikket ikke de nødvendige mekaniske egenskapene for å matche det omkringliggende beinvevet på et implantatsted. Derfor er det nødvendig med videreutvikling for å utløse det fulle potensialet til disse stillasene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimentelle protokollene ble gjennomgått og godkjent av University of Ottawa Animal Care Committee.

1. Klargjøring av stillas

  1. Bruk en mandolinskive til å skjære McIntosh-epler (Canada Fancy) i 8 mm tykke skiver. Skjær hypanthiumvevet i epleskivene i 5 mm x 5 mm firkanter.
  2. Plasser kvadratprøvene i 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) i 2 dager.
  3. Vask de decellulariserte prøvene med avionisert vann og inkuber dem over natten ved romtemperatur (RT) i 100 mM CaCl2 for å fjerne det gjenværende overflateaktive middelet.
  4. Steriliser prøvene (dvs. stillas) i 70% etanol i 30 minutter, vask dem med avionisert vann og legg dem i en 24-brønns kulturplate før cellesåing.

2. Cellekultur og stillassåing

  1. Vedlikehold MC3T3-E1 Subklon 4-celler i cellekulturbehandlede retter med en diameter på 10 cm i cellekulturer under cellekulturforhold (37 °C i en fuktet atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2).
  2. Forbered cellekulturmedium laget av Eagle's minimum essensielle medium - alfa-modifikasjon (α-MEM) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
  3. Løsne cellene fra kulturskålene ved trypsinisering (0,05% trypsin-EDTA) når de når 80% sammenløp.
  4. Sentrifuger cellesuspensjonen ved ca. 200 x g i 3 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i α-MEM ved 2,5 x 107 celler per ml.
  5. Pipett en 40 μL alikot av cellesuspensjonen på overflaten av stillasene, og la cellene feste seg i 1 time under cellekulturforhold. Deretter tilsettes 2 ml kulturmedium til hver kulturbrønn på kulturplaten.
  6. Fyll på kulturmediet hver 2-3 dager i 14 dager.
  7. Forbered et differensieringsmedium ved å tilsette 50 μg / ml askorbinsyre og 4 mM natriumfosfat til det tidligere beskrevne cellekulturmediet.
  8. Indusere differensiering av MC3T3-E1-celler ved å inkubere stillasene i differensieringsmedium i 4 uker. Fyll på mediet hver 3-4 dag. Parallelt, inkuber stillas i ikke-differensieringskulturmedium (dvs. medium uten kosttilskudd for å indusere differensiering) i samme varighet, med samme mediumendringsplan for å tjene som en negativ kontroll.

3. Pore størrelse målinger ved hjelp av konfokal laser skanning mikroskopi

  1. Vask de decellulariserte epleavledede stillasene med fosfatbufret saltvann (PBS).
  2. Inkuber stillasene i 1 ml 10% (v/v) kalkofluorhvit flekk i 25 minutter i mørket ved RT.
  3. Vask stillasene (n = 3) med PBS og avbilde tre tilfeldig utvalgte områder per stillas med et høyhastighets resonant konfokal laserskanningsmikroskop (CLSM) ved 10x forstørrelse, ved hjelp av en DAPI-kanal, som følger:
    1. Laserfilterkonfigurasjon: 405 nm (laser); 425-475 nm (utslipp)
    2. Juster lasereffekten og detektoren manuelt for å sikre optimal bildeopptak. Skaff deg en z-stabel med 20 bilder med en trinnstørrelse på 5 μm.
  4. Ved hjelp av ImageJ-programvaren kan du behandle og analysere konfokalbildene på følgende måte:
    1. Bruk funksjonen Z-prosjekt til maksimal intensitet for å lage et bilde, og bruk funksjonen Finn kanter for å markere kanten av porene.
    2. Spor porene manuelt ved hjelp av frihåndsmarkeringsverktøyet .
    3. Sett hver pore som en ellipse, måle lengden på hovedaksen, samle alle målingene (totalt 54 i denne studien - 6 i 3 tilfeldig utvalgte områder for hvert stillas), og beregne gjennomsnittlig lengde.

4. Analyse av cellefordeling ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi

  1. Vask de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensierings- eller differensieringsmediet tre ganger med PBS. Fest stillasene med 4% paraformaldehyd i 10 min.
  2. Vask hvert stillas grundig med avionisert vann, permeabiliser cellene med en Triton-X 100-løsning i 5 minutter, og vask igjen med PBS.
  3. Inkuber stillasene i 1 ml 1% periodisk syre i 40 minutter og skyll med avionisert vann14,16.
  4. Inkuber stillasene i 1 ml oppløsning inneholdende 100 mM natriummetabisulfitt og 0,15 M saltsyre, tilsatt 100 μg/ml propidiumjodid. Senk stillasene helt ned i løsningen.
  5. Vask stillasene med PBS og beis cellekjernene ved å inkubere stillasene i en 5 mg/ml DAPI-løsning i 10 minutter i mørket. Vask grundig igjen og oppbevar stillasene i PBS før avbildning.
  6. Bilde tre tilfeldig utvalgte overflater av tre forskjellige cellefrøede stillaser med en høyhastighets resonans CLSM ved 10x forstørrelse, ved hjelp av DAPI og TRITC kanaler, som følger:
    1. Laser-emisjonsfilterkonfigurasjon:
      DAPI: Laser: 405 nm; Utslipp: 425-475 nm
      TRITC: Laser: 561 nm; Utslipp: 570-620 nm
    2. Juster lasereffekten og detektoren manuelt for å sikre optimal bildeopptak. Skaff deg en z-stabel med 20 bilder med en trinnstørrelse på 5 μm.
  7. Bruk ImageJ-programvaren til å behandle konfokalbildene og lage en maksimal projeksjon i z-aksen for bildeanalyse ved hjelp av funksjonen Z-Project til maksimal intensitet .

5. Alkalisk fosfataseanalyse

  1. Vask de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensierings- eller differensieringsmediet tre ganger med PBS. Fest stillasene med 10% nøytral bufret formalin i 30 min. Fest tomme stillaser (stillaser uten frøceller) for å tjene som en negativ kontroll.
  2. Forbered en 5-brom-4-klor-3'-indolyfosfat og nitroblå tetrazolium (BCIP / NBT) fargeløsning ved å oppløse en BCIP / NBT-tablett i 10 ml avionisert vann.
  3. Vask de faste stillasene med en 0,05% mellomløsning og beis med BCIP/NBT-løsningen i 20 min ved RT. Vask de fargede stillasene med en 0,05% mellomløsning og oppbevar dem i PBS før avbildning.
  4. Se for deg de fargede stillasene med et digitalkamera på 12 megapiksler.

6. Analyse av kalsiumavsetning

  1. Vask de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensierings- eller differensieringsmediet tre ganger med PBS. Fest stillasene med 10% nøytral bufret formalin i 30 min. Fest tomme stillaser (stillaser uten frøceller) for å tjene som en negativ kontroll.
  2. Forbered en 2% (w / v) alizarin rød S (ARS) fargeløsning.
  3. Vask de faste stillasene med avionisert vann og beis dem med ARS-løsningen i 1 time ved RT. Vask de fargede stillasene med avionisert vann og oppbevar dem i PBS før avbildning.
  4. Se for deg de fargede stillasene med et digitalkamera på 12 megapiksler.

7. Mineraliseringsanalyse

  1. Vask de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensierings- eller differensieringsmediet tre ganger med PBS. Fest stillasene med 4% paraformaldehyd i 48 timer. Fest tomme stillaser (stillaser uten frøceller) for å tjene som en negativ kontroll.
  2. Dehydrere prøvene i løsninger som inneholder konsentrasjoner av etanol som øker fra 50% til 100%, som tidligere beskrevet23.
  3. Utføre skanning elektronmikroskopi (SEM) og energidispersiv spektroskopi (EDS) for å analysere mineralaggregater som følger:
    1. Tørk prøvene med en kritisk punkttørker, i henhold til produsentens protokoll24.
    2. Påfør et 5 nm gullbelegg på stillasene ved hjelp av en gullsputterfrakk, etter produsentens protokoll25.
    3. Se for deg overflaten på stillasene med et skanningelektronmikroskop satt til 3 kV, ved 85x forstørrelse.
    4. Utfør EDS ved å sette skanningelektronmikroskopet på 15 kV. På tre tilfeldig utvalgte områder per stillas, skaff EDS-spektra for analyse av mineralaggregatsammensetning.

8. Youngs modulmålinger

  1. Fjern de cellefrøede stillasene fra deres respektive inkubasjonsmedium og test prøvene umiddelbart.
  2. Bruk et spesialbygd uniaxialt kompresjonsapparat utstyrt med en 1,5 N lastcelle, komprimer stillasene (n = 3 per tilstand) med en konstant hastighet på 3 mm·min-1 til en maksimal trykkbelastning på 10 % av stillashøyden.
  3. Bestem Youngs modul fra hellingen av den lineære delen av spenningsbelastningskurvene. I denne studien ble modulen bestemt mellom 9% og 10% belastning.

9. Celleinfiltrasjon og mineraliseringsanalyse ved histologi: In vitro stillas

  1. Vask de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensierings- eller differensieringsmedium tre ganger med PBS.
  2. Fest de cellefrøede stillasene med 4% paraformaldehyd i 48 timer før resuspendering i 70% etanol for lagring.
  3. Histologi:
    MERK: I denne studien ble hele det histologiske preparatet (embedding, seksjonering og farging) beskrevet i de neste trinnene utført av Louise Pelletier Histology Core Facility (University of Ottawa).
    1. Etter dehydrering og innebygging i parafin, kutt prøvene i 5 μm tykke serielle seksjoner, start 1 mm inne i stillasene, og monter seksjonene på mikroskoplysbilder.
    2. Flekk seksjonene med hematoksylin og eosin (H&E) eller von Kossa (VK) flekker.
    3. Se for deg snittene med lysbildeskannermikroskop ved 40x forstørrelse (n = 1 stillas i ikke-differensieringsmedium og n = 2 stillaser i differensieringsmedium i denne studien).
    4. Ved hjelp av ImageJ-programvare kan du visuelt evaluere celleinfiltrasjon (H&E-farging) og mineralisering (VK-farging).

10. Rotte calvarial defekt modell

  1. Få eksperimentelle protokoller gjennomgått og godkjent av den lokale dyrepleiekomiteen.
  2. Klargjør sirkulære (5 mm diameter og 1 mm tykkelse) decellulariserte stillaser i henhold til avsnitt 1 beskrevet ovenfor, og bruk en 5 mm biopsistans.
  3. Utfør bilateral kraniotomi etter en etablert protokoll26, som følger:
    1. Bedøv hannrotter av Sprague-Dawley med isofluran, først ved 3% til de er bevisstløse, og deretter ved 2-3% gjennom hele prosedyren.
    2. Eksponer periosteum og kranium ved å kutte den overliggende huden ved hjelp av et skalpellblad. Fjern periosteum.
    3. Opprett bilaterale defekter i begge parietale bein på hver side av sagittal suturen ved hjelp av et tannbor utstyrt med en 5 mm diameter trefin under konstant vanning på 0,9% NaCl.
    4. Rengjør det omkringliggende benet med 0,9% NaCl for å fjerne eventuelle beinfragmenter.
    5. Plasser de sirkulære, decellulariserte stillasene i defektene.
    6. Lukk den overliggende huden med 4-0 suturer.
  4. Gi rottene ubegrenset tilgang til mat og vann og overvåk dem daglig.
  5. Etter 8 uker etter implantasjon, avlive rottene ved CO2 -inhalasjon og thorax perforasjon som et sekundært eutanasimål.
  6. For å avsløre kraniet og hente implantatene, fjern huden som dekker skallen ved hjelp av et skalpellblad.
  7. Klipp skallen på frontale og occipitale bein og på siden av begge parietale bein ved hjelp av en tannbor for å fjerne den øverste delen av skallen helt.

11. Push-out test

  1. Koble en uniaxial komprimeringsenhet (med en 445 N lastcelle) til USB-datainnsamlingsmodulen.
  2. Koble datainnsamlingsmodulen til en datamaskin utstyrt med et datainnsamlingsprogram.
  3. Umiddelbart etter kranialekstraksjon, plasser hver prøve (n = 7 implantater fra 4 dyr i denne studien) på prøveholderen til den uniaxiale kompresjonsanordningen slik at dorsalsiden av benet vender oppover.
  4. Senk stempelet ved 0,5 mm/min til det berører det ekstraherte implantatet litt.
  5. Start testen ved å senke stempelet gjennom implantatet til du er fullstendig utstøtt mens du påfører kompresjon med en konstant hastighet på 0,5 mm/min ved hjelp av datainnsamlingsprogramvaren.
  6. Registrer toppkraften på kraft- vs. forskyvningskurven ved hjelp av datainnsamlingsprogramvaren.

12. Celleinfiltrasjon og mineraliseringsanalyse ved histologi: In vivo stillas

  1. Fest ekstrahert calvaria og implantater i 10% nøytral bufret formalin i 72 timer før resuspensjon i 70% etanol for lagring.
  2. Histologi:
    MERK: I denne studien ble all histologisk forberedelse (innebygging, seksjonering og farging) beskrevet i de neste trinnene utført av Accel Labs (Montreal, QC, Canada).
    1. Klipp prøvene (innebygd i metylmetakrylat) i 6 μm tykke seksjoner på tre forskjellige nivåer (topp, bunn og mot midten) og monter dem på mikroskoplysbilder.
    2. Beis seksjonene med enten H&E eller Masson-Goldners trichrome (MGT).
  3. Se for deg seksjonene med et lysbildeskannermikroskop ved 40x forstørrelse (4 eksplanter fra 2 dyr i denne studien).
  4. Ved hjelp av ImageJ-programvaren kan du visuelt evaluere celleinfiltrasjon (H&E-farging) og kollagenavsetning (MGT-farging).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Porestørrelsesmåling, cellefordeling og in vitro-mineralisering (figur 1 og figur 2)
Fullstendig fjerning av stedegne cellekomponenter i eplevevstillasene ble oppnådd etter behandling av stillasene med SDS og CaCl2 (figur 1A). Stillasene viste en svært porøs struktur, som ble bekreftet ved hjelp av konfokalmikroskopi. Kvantifiseringen av bildene viste en gjennomsnittlig porestørrelse på 154 μm ± 40 μm. Porestørrelsesfordelingen varierte mellom 73 μm og 288 μm. Imidlertid varierte flertallet av porene mellom 100 μm og 200 μm (figur 1C).

Etter en 4 ukers dyrkningsperiode i differensieringsmedium viste de cellesådde stillasene utbredte hvite mineralforekomster (figur 1A). Stillasene som inneholdt celler viste en ugjennomsiktig hvit farge, noe som tyder på mineralisering, som ikke ble observert i de tomme stillasene (stillaser uten frøceller). Videre viste analyse med konfokal laserskanningsmikroskopi en homogen cellefordeling i stillasene (figur 1B).

Stillaser sådd eller ikke med celler ble farget med BCIP/NBT og ARS for å analysere henholdsvis ALP-aktivitet og mineralisering (figur 1D). BCIP/NBT-fargingen viste en betydelig økning i ALP-aktivitet (avbildet med en sterk lilla farge) i de cellefrøede stillasene dyrket i differensieringsmedium, i motsetning til de blanke stillasene eller de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensieringsmedium. På samme måte viste de cellefrøede stillasene dyrket i differensieringsmedium en mer intens rødfarge ved farging med ARS, noe som indikerer større mineralisering sammenlignet med de tomme stillasene eller de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensieringsmedium. Bakgrunnsfarging ble observert i de tomme stillasene, potensielt på grunn av tilstedeværelsen av CaCl2 i decellulariseringsprotokollen.

Farging (H&E og VK) ble utført på stillasene for å analysere celleinfiltrasjon og mineralisering, og SEM og EDS ble brukt for å evaluere mineralisering videre (figur 2). H&E-farging (figur 2A) viste god celleinfiltrasjon i de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensierings- eller differensieringsmedium. Flere kjerner var synlige i periferien og gjennom stillasene. Tilstedeværelsen av kollagen ble også observert i stillasene i blekrosa. I tillegg viste VK-farging utført på stillasene etter 4 ukers dyrkning i differensieringsmedium at poreveggene var farget, mens kalkavleiringer kun ble påvist langs ytterkantene av poreveggene i stillasene dyrket i ikke-differensieringsmedium og kan ha vært et resultat av kalsiumabsorpsjon under decellulariseringsbehandlingen. Lokalisert mineralisering på overflaten av de cellefrøede stillasene dyrket i differensieringsmedium i 4 uker ble observert ved SEM-analyse (figur 2B). Nærmere bestemt ble mineralforekomster som ligner sfæroidaggregater observert i periferien av porene. Derimot ble det ikke observert mineralaggregater på de blanke stillasene eller de cellefrøede stillasene dyrket i 4 uker i ikke-differensieringsmedium. Distinkte karakteristiske topper tilsvarende fosfor (P) og kalsium (Ca) ble observert i EDS-spektrene til de utvalgte interesseområdene, spesielt på mineralforekomstene observert på cellefrøede stillas dyrket i 4 uker i differensieringsmedium (figur 2B).

Biomekanisk in vitro analyse (figur 3)
Youngs modul av de cellefrøede stillasene ble målt etter 4 ukers kultur i enten ikke-differensierings- eller differensieringsmedium (n = 3 for hver eksperimentelle tilstand). Den ble sammenlignet med Youngs modul av de blanke stillasene (stillaser uten sådde celler) (figur 3). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i modulen mellom de blanke stillasene (31,6 kPa ± 4,8 kPa) og de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensieringsmedium (24,1 kPa ± 8,8 kPa; p = 0,88). Derimot ble det observert en signifikant forskjell mellom modulen til de tomme stillasene (31,6 kPa ± 4,8 kPa) og modulen til de cellefrøede stillasene dyrket i differensieringsmedium (192,0 kPa ± 16,6 kPa; p < 0,001). I tillegg ble det observert en signifikant forskjell (p < 0,001) mellom Youngs moduler av cellefrøede stillas dyrket i ikke-differensierings- og differensieringsmedier. Tilleggsfigur 1 viser en typisk spenning-tøyningskurve for Youngs modulberegning.

Biomekanisk ytelse in vivo og benregenerering (figur 4 og figur 5)
Kirurgiske kraniotomier ble utført på totalt 6 Sprague-Dawley-rotter. Bilaterale 5 mm diameterdefekter ble opprettet i begge parietale bein av skallen ved hjelp av en trefinbur, og epleavledede cellulosestillas uten frøceller ble implantert i de kalvariale defektene (figur 4A). Etter 8 ukers implantasjon ble dyrene avlivet, og den øvre delen av hodeskallene ble samlet inn og behandlet for enten mekanisk testing eller histologisk analyse.

Basert på visuell vurdering virket stillasene godt integrert i skallen rundt vev. Mekaniske push-out tester ble utført for å kvantitativt vurdere integrasjonen av stillasene (n = 7) i verten calvaria. Målingene ble utført ved hjelp av en uniaxial kompresjonsanordning (figur 4B) umiddelbart etter avlivning av dyrene. Resultatene viste at toppkraften var 113,6 N ± 18,2 N (tabell 1).

Histologisk analyse ble utført for å vurdere celleinfiltrasjon og avleiring av ekstracellulær matriks i de implanterte stillasene (figur 5). H&E-farging viste cellulær infiltrasjon i stillasporene og tegn på vaskularisering, som vist ved tilstedeværelse av blodkar i stillasene. I tillegg demonstrerte MGT-farging tilstedeværelsen av kollagen i stillasene.

Figure 1
Figur 1: Stillasbilder, porestørrelsesfordeling og in vitro-mineralisering . (A) Representative fotografier av et epleavledet cellulosestillas etter fjerning av de opprinnelige cellene og overflateaktivt middel (venstre) og et stillas sådd med MC3T3-E1-celler etter 4 ukers kultur i osteogent differensieringsmedium (høyre). Skalalinjen representerer 2 mm. (B) Representative konfokale laserskanningsmikroskopbilder som viser sådde celler i epleavledede cellulosestillas etter 4 ukers kultur i ikke-differensieringsmedium ("ND") eller osteogent differensieringsmedium ("D"). Skalastangen representerer 50 μm. Farging ble utført på stillasene for cellulose (rød) med propidiumjodid og for cellekjerner (blå) med DAPI. (C) Porestørrelsesfordeling av decellulariserte epleavledede cellulosestillas, før de blir frøet med MC3T3-E1-celler, fra maksimale projeksjoner i z-aksen til konfokale bilder. Analysen ble utført på totalt 54 porer i 3 forskjellige stillaser (6 porer i 3 tilfeldig utvalgte områder av interesse per stillas). (D) Representative bilder av stillaser farget med 5-brom-4-klor-3'-indolyfosfat og nitroblått tetrazolium (BCIP/NBT) for å vurdere alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet og med alizarinrød S (ARS) for å visualisere kalsiumavsetning, noe som indikerer mineralisering (skala bar = 2 mm - gjelder alle). Stillasene merket som "blanke" (stillas uten frøceller) viste ingen farging med BCIP/NBT, noe som indikerer fravær av ALP-aktivitet. På den annen side viste de cellefrøede stillasene dyrket i differensieringsmedium ("D") høyere ALP-aktivitet, indikert med en mer intens blå farge, sammenlignet med de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensieringsmedium ("ND"). For ARS-farging viste både de blanke stillasene og stillasene dyrket i ikke-differensieringsmedium ("ND") en lysere nyanse av rødt sammenlignet med stillasene dyrket i differensieringsmedium ("D"). Tilstedeværelsen av kalsiumavsetning i stillasene dyrket i differensieringsmedium ("D") ble illustrert av en intens dyp rød farge. Hver analyse ble utført på tre ulike stillaser (n = 3). Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Leblanc Latour (2023) 27. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Histologi, scanning elektronmikroskopi (SEM) og energidispersiv spektroskopi (EDS) analyse av in vitro stillas. (A) Representative bilder av de øverste histologiske tverrsnittene av stillasene. Parafininnebygde stillaser ble skåret i 5 μm tykke seksjoner som ble farget med hematoksylin og eosin (H &E) for å visualisere celleinfiltrasjon, eller med von Kossa (VK) for å visualisere mineralisering i stillasene. Stillasene ble infiltrert med MC3T3-E1-celler, som vist ved blå (kjerner) og rosa (cytoplasma) farging synlig i periferien og gjennom stillasene. Kollagen (blekrosa) var også synlig (innzoomet innfelt av "H&E - D"). Mineralisering ble kun observert i periferien av poreveggene i stillasene dyrket i ikke-differensieringsmedium ("ND"). Poreveggene i stillasene dyrket i differensieringsmedium ("D") var helt farget i svart. Analysen ble utført på ett stillas dyrket i ikke-differensieringsmedium ("ND") og på to stillaser dyrket i differensieringsmedium ("D") (skala bar for nedre forstørrelse bilder = 1 mm, skala bar for høyere forstørrelse bilder = 50 μm). (B) Representative mikrografer oppnådd av SEM samt EDS-spektra. Stillasene gjennomgikk sputterbelegg med gull og ble avbildet ved hjelp av et feltutslippsskanningelektronmikroskop med en spenning på 3,0 kV (skala bar = 100 μm - gjelder alle). EDS-spektra ble anskaffet på hvert stillas. Topper av fosfor (2,013 keV) og kalsium (3,69 keV) er betegnet på hvert EDS-spektrum. Både SEM og EDS ble utført på tre forskjellige stillaser. Blank: stillas uten sådde celler. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Leblanc Latour (2023) 27. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Youngs moduler av in vitro stillas etter 4 ukers kultur i enten ikke-differensieringsmedium ("ND") eller differensieringsmedium ("D"). Data er presentert som gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM) av tre replikasjonsprøver for hver tilstand. Statistisk signifikans (* indikerer p<0,05) ble bestemt ved hjelp av en enveis variansanalyse (ANOVA) og Tukey post-hoc-test. Blank: stillas uten sådde celler. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Leblanc Latour (2023) 27. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Stillasfotografi før implantasjon og push-out test etter 8 ukers implantasjon: (A) Representativt fotografi av et stillas før implantasjon; (B) Uniaxial kompresjonsinnretning som brukes til push-out-testene, med lastcellen angitt med en stjerne (*) og prøven angitt med en pil. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Leblanc Latour (2023) 27. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Histologianalyse av in vitro stillas. Representative bilder av histologiske tverrsnitt fra ikke-sådde stillaser etter 8 ukers implantasjon. Seksjonene ble farget med enten hematoksylin og eosin (H &E) for å visualisere celler eller Masson-Goldners trichrome (MGT) for å visualisere kollagen. Pilen indikerer røde blodlegemer. Tilstedeværelsen av kollagen er synlig (skalastang = 1 mm og 200 μm for henholdsvis venstre og høyre innsats). Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Leblanc Latour (2023) 27. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Utvalg nummer Toppkraft (N)
1 92.8
2 162.7
3 140.3
4 135.7
5 37.7
6 157.8
7 67.9
Bety 113.6
SEM 18.2

Tabell 1: Målt toppkraft fra push-out-tester.

Tilleggsfigur 1: Typisk spenning-tøyningskurve for Youngs modulberegning. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere in vitro og in vivo studier har vist biokompatibiliteten til planteavledet cellulose og dens potensielle bruk i vevsteknikk 14,15,16,18,19,20, mer spesifikt for hosting osteogen differensiering 20,21. Målet med denne studien var å undersøke potensialet til epleavledede cellulosestillas for BTE og å vurdere de mekaniske egenskapene til disse stillasene både in vitro og in vivo.

For in vitro-studier ble preosteoblastceller (MC3T3-E1) sådd i stillasene etter å ha eliminert de opprinnelige cellene fra eplevevet. MC3T3-E1-celler brukes ofte til å undersøke biomineraliseringen av ekstracellulær matrise 28,29,30. Stillas ble deretter dyrket i 4 uker i osteogen differensiering eller ikke-differensieringsmedium. Funnene indikerte at cellene spredte seg og gjennomgikk differensiering i stillasene, spesielt når de ble dyrket i differensieringsmedium, og dermed fremhevet potensialet for cellulosestillas avledet fra epler for å støtte utviklingen av beinvev. Cellekjerner ble observert i stort antall i stillasporene, noe som bekrefter observasjoner rapportert i tidligere studier 14,15,16,17,20,21. Dessuten, i likhet med våre tidligere funn14 og de i en annen gruppe21, var den gjennomsnittlige diameteren av stillasporene ~ 154 μm, med de fleste porene med diametre mellom 100 μm og 200 μm (figur 1C). Disse dimensjonene er i samsvar med det ideelle porestørrelsesområdet (100–200 μm) kjent for å lette beinvekst7.

Fargeanalysen viste høyere ALP-aktivitet etter 4 ukers dyrkningsperiode i differensieringsmedium. Flere kalkavleiringer ble observert på overflaten av de cellefrøede stillasene dyrket i differensieringsmedium sammenlignet med både de blanke stillasene og de cellefrøede stillasene dyrket i ikke-differensieringsmedium. Lignende resultater er observert med differensierte hiPSCer i epleavledede stillas21. Mens tilstedeværelsen av ALP ble kvalitativt vurdert i denne studien, kunne ytterligere analyser utføres for en kvantitativ analyse. Den histologiske evalueringen av stillasene bekreftet videre at de infiltrerte osteoblastene mineraliserte stillasene etter differensiering. Spesielt ble periferien av konstruksjonene dyrket i ikke-differensiert medium også farget med VK. Resterende CaCl2 i stillasene kan ha forårsaket denne uspesifikke fargingen observert i periferien etter decellularisering. En kvalitativ analyse av SEM-bilder ble utført for å vurdere mineralisering ytterligere. Etter dyrkning i differensieringsmedium viste cellefrøede stillaser tegn på ECM-mineralisering. Mineralaggregater var synlige på stillasoverflaten, spesielt ved kantene av porene. Disse observasjonene stemmer overens med tidligere studier med ECM30 og planteavledede stillas21. Disse aggregatene var fraværende på overflaten av stillasene uten frøceller. EDS-analyse av aggregatene viste tilstedeværelsen av høye nivåer av P og Ca, og antydet dermed tilstedeværelsen av apatitt. Merk at mens protokollen beskrevet i denne studien tillater visualisering av cellulær infiltrasjon og tilstedeværelse av mineralisering, tillater det ikke vurdering av deres progresjon over tid. Histologisk analyse på flere tidspunkter vil være nødvendig for å evaluere denne progresjonen fullt ut. I tillegg vil ytterligere analyse være nødvendig for å kvantifisere cellulær infiltrasjon og mineralisering på overflaten, så vel som gjennom hele stillaset. Til slutt, mens den elementære sammensetningen av mineralforekomstene ble bestemt av EDS, kan andre karakteriseringsteknikker, som røntgendiffraksjon (XRD), være nødvendig for å gi informasjon om krystallstrukturen til de observerte forekomstene.

Youngs modul av stillasene var betydelig høyere etter kultur i differensieringsmedium (med omtrent 8 ganger). I motsetning til dette lignet modulen til stillasene dyrket i ikke-differensieringsmedium den til de tomme stillasene (stillas uten frøceller), i likhet med funn rapportert i en tidligere studie med epleavledede stillas20. Til tross for den høyere Youngs modul av stillasene dyrket i differensieringsmedium, forble den mye lavere enn for naturlig ben (0,1 til 2 GPa for trabekulært bein og 15 til 20 GPa for kortikal bein)8, avbrutt allograft (3,78 GPa)31, alloplastiske transplantater laget av polyeter-eter-keton (3,84 GPa)31, titan (50,20 GPa)31 og kobolt-kromlegering (53,15 GPa)31 Implantater. Derfor kan stillasene i deres nåværende formulering ikke være egnet for bærende applikasjoner. Merk at Youngs modul gir informasjon om stivheten til et materiale. Flyteevnen kan imidlertid også vurderes å gi en bredere forståelse av stillasets mekaniske egenskaper.

Decellulariserte eplestillas ble deretter implantert i 5 mm bilaterale kritisk-store calvarial defekter hos rotter (n = 6 dyr). Push-out-tester (på 7 eksplanter), utført for å evaluere integreringen av stillasene i verten calvaria, indikerte at gjennomsnittlig toppkraft var 113,6 N ± 18,2 N, som er lik bruddbelastningen som tidligere er rapportert for kalvarialben (127,1 ± 9,6 N)22, noe som tyder på at stillasene integrerte seg godt i det omkringliggende beinvevet. Det skal imidlertid bemerkes at push-out-testen kun gir informasjon om grensesnittet mellom stillaset og det omkringliggende vevet. Tidligere studier har kombinert push-out-tester med innrykkstester for å gi en bredere forståelse av de mekaniske egenskapene til beinimplantatgrensesnittet og selve stillaset22. I tillegg er bilaterale defekter mer utsatt for feiljustering med stempelet32. Riktig plassering av kranialeksplanten, enkeltfeilmodellen eller ekstra klemmesystem på den universelle testenheten kan potensielt unngå feiljustering32.

Oppsummert bekreftet denne studien at epleavledede cellulosestillaser kunne fremme preosteoblastadhesjon og spredning. I tillegg skjedde mineralisering i de cellefrøede stillasene dyrket i differensieringsmedium, noe som førte til en økning i stillaset Youngs modul. Imidlertid forblir modulen betydelig lavere enn for naturlig bein. Interessant nok var kraften som trengtes for å fortrenge de implanterte epleavledede cellulosestillasene, sammenlignbar med bruddbelastningen i beinveksling og andre typer stillaser som tidligere ble brukt til BTE22. Til slutt, på samme måte som resultatene illustrert i tidligere rapporter, infiltrerte celler de implanterte stillasene og avsatte kollagen. Samlet sett demonstrerer denne studien potensialet for cellulosestillas avledet fra planter for BTE-applikasjoner. Disse funnene er i samsvar med en tidligere studie utført av en annen forskningsgruppe, som ytterligere underbygger egnetheten til planteavledede cellulosestillas for BTE-formål21. Likevel understreker forskjellen i stillasets stivhet sammenlignet med trabekulært eller kortikal bein viktigheten av å utvikle sammensatte biomaterialer som bedre kan matche de mekaniske egenskapene til naturlig bein. Derfor, til tross for den økende interessen for å bruke planteavledede stillaser til BTE-formål, kan bruken av dem forbli begrenset til ikke-bærende applikasjoner. Som vi tidligere har demonstrert16, kan rekonstruksjon av planteavledede cellulosestillas via kjemisk modifikasjon eller utvikling av kompositter med andre biologiske/syntetiske polymerer være avgjørende for bærende applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Interessekonflikterklæring: M.L.L., M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. og A.P. er oppfinnere på patentsøknader innlevert av University of Ottawa og Spiderwort Inc. angående bruk av planteavledet cellulose for BTE-applikasjoner. M.L.L., R.J.H., C.M.C. og A.P. har økonomiske interesser i Spiderwort Inc.

Acknowledgments

Finansiering for dette prosjektet ble gitt av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Discovery Grant) og av Li Ka Shing Foundation. M.L.L. mottok støtte fra Ontario Centers of Excellence TalentEdge-programmet, og RJH ble støttet av et NSERC-stipend og et Ontario Graduate Scholarship (OGS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole ThermoFisher D1306 DAPI
Alizarin red S Sigma-Aldrich A5533 ARS
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403 Cell Culture
Calcium Chloride ThermoFisher AA12316 CaCl2
Calcofluor White Sigma-Aldrich 18909
Dental drill Surgical tool
Ethanol ThermoFisher 615095000
Fetal bovine serum Hyclone Laboratories SH30396 FBS
Formalin Sigma-Aldrich HT501128 10% Formalin
Goldner's trichrome stain Sigma-Aldrich 1.00485 GTC
Hematoxylin and eosin stain Fisher Scientific NC1470670 H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope Nikon Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
ImageJ software National Institutes of Health
Irrigation saline Baxter JF7123 0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells ATCC CRL-2593 Pre-osteoblast cells
McIntosh apples Canada Fancy grade
Methyl methacrylate Sigma-Aldrich M55909 Histological embedding
Minimum Essential Medium ThermoFisher M0894 α-MEM
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042 4%; PFA
Penicillin/Streptomycin Hyclone Laboratories SV30010 Cell Culture
Periodic acid Sigma-Aldrich 375810
Phosphate buffered saline Hyclone Laboratories 2810305 PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide Invitrogen p3566
Scanning electron microscope JEOL JSM-7500F FESEM SEM and EDS
Slide scanner microscope Zeiss AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166 SDS
Sodium metabisulphite Sigma-Aldrich 31448
Sodium phosphate ThermoFisher BP329
Sprague-Dawley rats Charles-River Laboratories 400 Male
Sutures Ethicon J494G 4-0
Trephine ACE Surgical Supply Co 583-0182 5-mm diameter
Triton-X 100 ThermoFisher 807423
Trypsin Hyclone Laboratories SH30236.02 Cell Culture
Tween Fisher Scientific BP337
Universal compression Device CellScale UniVert
Von Kossa stain Sigma-Aldrich 1.00362 Histology

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
  2. Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
  3. Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
  4. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
  5. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  6. Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
  7. Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
  8. Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
  9. Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
  10. Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
  11. Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
  12. Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
  13. Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
  14. Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835 (2014).
  15. Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  16. Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
  17. Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415 (2023).
  18. Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225 (2017).
  19. Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  20. Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030 (2022).
  21. Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194 (2019).
  22. Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
  23. Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
  24. tousimis Critical Point Dryers - Samdri®-PVT-3D. , https://tousimis.com/critical_point_dryers/detail.html?Pid=8755B (2022).
  25. Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-ace200/ (2023).
  26. Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
  27. Leblanc Latour, M. Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , Department of Physics, Faculty of Science, University of Ottawa, Ottawa, Canada. (2023).
  28. Kodama, H. -A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
  29. Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
  30. Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
  31. Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
  32. Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541 (2021).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 204
Decellulariserte Apple-avledede stillaser for beinvevsteknikk <em>in vitro</em> og <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leblanc Latour, M., Tarar, M.,… More

Leblanc Latour, M., Tarar, M., Hickey, R. J., Cuerrier, C. M., Catelas, I., Pelling, A. E. Decellularized Apple-Derived Scaffolds for Bone Tissue Engineering In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (204), e65226, doi:10.3791/65226 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter