Summary
Questo protocollo delinea i passaggi per l'utilizzo della piattaforma automatizzata Lustro per eseguire la caratterizzazione ad alto rendimento dei sistemi optogenetici nel lievito.
Abstract
L'optogenetica offre un controllo preciso sul comportamento cellulare utilizzando proteine sensibili alla luce geneticamente codificate. Tuttavia, l'ottimizzazione di questi sistemi per ottenere la funzionalità desiderata richiede spesso più cicli di progettazione-costruzione-test, che possono richiedere molto tempo e manodopera. Per affrontare questa sfida, abbiamo sviluppato Lustro, una piattaforma che combina la stimolazione della luce con l'automazione di laboratorio, consentendo uno screening efficiente ad alto rendimento e la caratterizzazione dei sistemi optogenetici.
Lustro utilizza una stazione di lavoro di automazione dotata di un dispositivo di illuminazione, un dispositivo di scuotimento e un lettore di piastre. Impiegando un braccio robotico, Lustro automatizza il movimento di una piastra a micropozzetti tra questi dispositivi, consentendo la stimolazione di ceppi optogenetici e la misurazione della loro risposta. Questo protocollo fornisce una guida passo-passo sull'utilizzo di Lustro per caratterizzare i sistemi optogenetici per il controllo dell'espressione genica nel lievito in gemmazione Saccharomyces cerevisiae. Il protocollo copre la configurazione dei componenti Lustro, compresa l'integrazione del dispositivo di illuminazione con la workstation di automazione. Fornisce inoltre istruzioni dettagliate per la programmazione del dispositivo di illuminazione, del lettore di piastre e del robot, garantendo un funzionamento regolare e l'acquisizione dei dati durante tutto il processo sperimentale.
Introduction
L'optogenetica è una potente tecnica che utilizza proteine sensibili alla luce per controllare il comportamento delle cellule con elevata precisione 1,2,3. Tuttavia, la prototipazione di costrutti optogenetici e l'identificazione delle condizioni di illuminazione ottimali possono richiedere molto tempo, rendendo difficile l'ottimizzazione dei sistemi optogenetici 4,5. I metodi ad alto rendimento per lo screening e la caratterizzazione rapida dell'attività dei sistemi optogenici possono accelerare il ciclo di progettazione-costruzione-test per la prototipazione dei costrutti e l'esplorazione della loro funzione.
La piattaforma Lustro è stata sviluppata come tecnica di automazione di laboratorio progettata per lo screening e la caratterizzazione ad alto rendimento di sistemi optogenetici. Integra un lettore di micropiastre, un dispositivo di illuminazione e un dispositivo di scuotimento con una workstationdi automazione 6. Lustro combina la coltura automatizzata e la stimolazione luminosa delle cellule in piastre a micropozzetti (Figura 1 e Figura 1 supplementare), consentendo lo screening rapido e il confronto di diversi sistemi optogenetici. La piattaforma Lustro è altamente adattabile e può essere generalizzata per funzionare con altri robot di automazione di laboratorio, dispositivi di illuminazione, lettori di piastre, tipi di cellule e sistemi optogenici, compresi quelli che rispondono a diverse lunghezze d'onda della luce.
Questo protocollo dimostra l'impostazione e l'uso di Lustro per la caratterizzazione di un sistema optogenetico. Il controllo optogenetico dei fattori di trascrizione divisi nel lievito è utilizzato come sistema di esempio per illustrare la funzione e l'utilità della piattaforma sondando la relazione tra gli input luminosi e l'espressione di un gene reporter fluorescente, mScarlet-I7. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono semplificare l'ottimizzazione dei sistemi optogenetici e accelerare la scoperta di nuove strategie per il controllo dinamico dei sistemi biologici.
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Protocol
I ceppi di lievito utilizzati in questo studio sono documentati nella Tabella dei Materiali. Queste varietà mostrano una crescita robusta nell'intervallo di temperatura compreso tra 22 °C e 30 °C e possono essere coltivate in vari substrati di lievito standard.
1. Configurazione della postazione di lavoro di automazione
- Dotare la stazione di lavoro automatizzata di un braccio di presa robotico (RGA, vedere la tabella dei materiali) in grado di spostare le piastre per micropozzetti (Figura 1).
- Installare un agitatore riscaldatore per micropiastre (vedere Tabella dei materiali) nella stazione di lavoro automatizzata (Figura 1(1)) con un meccanismo di bloccaggio automatico della piastra che fornisce l'accesso RGA.
- Posizionare un lettore di micropiastre adiacente alla workstation automatizzata (Figura 1(2)), garantendo l'accessibilità RGA.
- Incorporare un dispositivo di illuminazione per micropiastre (Figura 1(3)) che consenta un comodo accesso RGA. Ne sono un esempio l'optoPlate8 (utilizzato in questo studio) o il LITOS9 (vedi Tabella dei materiali).
2. Preparazione del dispositivo di illuminazione
- Costruire e calibrare l'optoPlate (o il dispositivo di illuminazione alternativo) seguendo i metodistabiliti 8,10,11.
- Utilizzare un adattatore sul dispositivo di illuminazione per abilitare l'accesso RGA.
- Programmare l'optoPlate utilizzando un foglio di calcolo10 o un'interfaccia grafica12. Seguire il passaggio 3 per eseguire i programmi di stimolazione della luce.
3. Progettare un programma di stimolazione della luce
- Determinare le condizioni di luce desiderate per l'esperimento.
- Immettere le condizioni di luce desiderate, tra cui l'intensità della luce, l'ora di inizio della luce, la durata dell'impulso, il numero di impulsi e la durata dell'interimpulso, in un foglio di calcolo.
NOTA: Eseguire il flashing di queste informazioni su optoPlate seguendo le istruzioni fornite nel repository GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Tenere presente che la piastra del campione non si illuminerà mentre si trova nel lettore per micropiastre o nell'agitatore riscaldatore. La durata e la frequenza di questi eventi possono richiedere un'ottimizzazione in base a specifiche esigenze sperimentali. - Includi condizioni di oscurità per ogni ceppo per consentire misurazioni di fondo adeguate.
- Per gli esperimenti di caratterizzazione iniziale per valutare la funzionalità del trasformante, utilizzare un'elevata intensità luminosa.
NOTA: L'intensità della luce deve essere ottimizzata per esperimenti più sensibili, poiché una luce eccessiva può essere fototossica per il lievito13.
4. Preparazione del lettore di micropiastre
- Configurare il lettore di micropiastre per misurare la quantità di interesse desiderata prima di condurre gli esperimenti.
NOTA: In questo esempio, il lettore per micropiastre è stato configurato per misurare la fluorescenza da un reporter espressa dal ceppo di interesse. Altre uscite, come la luminescenza o la densità ottica, possono essere utilizzate a seconda dei requisiti sperimentali. - Coltivare il ceppo di interesse (insieme a un controllo non fluorescente) in terreni sintetici completi (SC)14 (o in un altro terreno a bassa fluorescenza) (vedere la tabella dei materiali) fino alla massima densità cellulare da misurare. Trasferire le colture in una piastra per micropozzetti con fondo in vetro e pareti nere (vedere Tabella dei materiali) e misurarle per determinare le impostazioni ottimali del lettore per micropiastre.
NOTA: Garantire letture accurate inserendo correttamente le dimensioni della piastra e misurando la piastra dal basso. - Fare riferimento a un database di proteine fluorescenti (ad esempio, fpbase.org) per ottenere spettri approssimativi di assorbimento ed emissione per la proteina fluorescentetarget 15.
- Determinare il valore z (distanza tra la piastra e il lettore) eseguendo una scansione z su pozzetti contenenti i ceppi fluorescenti e non fluorescenti. Selezionare il valore z che produce il rapporto segnale/rumore più elevato.
- Ottimizza gli spettri di assorbimento ed emissione conducendo scansioni di assorbimento ed emissione sui ceppi fluorescenti e non fluorescenti per determinare il rapporto segnale/rumore ottimale.
- Misurare la deformazione fluorescente con il guadagno impostato al livello ottimale, determinando il guadagno ottico più alto che può essere utilizzato senza causare un errore di misurazione del trabocco.
NOTA: Questo guadagno ottico deve essere impostato manualmente in modo coerente in tutti gli esperimenti che coinvolgono lo stesso ceppo per garantire la coerenza dei risultati. - Preparare uno script di misura (fare riferimento alla Figura 2) nel software del lettore per micropiastre. Questo script configura lo strumento per misurare la densità ottica delle colture e gli spettri di fluorescenza di qualsiasi proteina fluorescente da misurare.
NOTA: Misurare la densità ottica dei ceppi a 600 nm, a meno che non esprimano proteine fluorescenti rosse. Per i ceppi che esprimono proteine fluorescenti rosse, misurare la densità ottica a 700 nm per evitare distorsioni16. - Impostare lo script di misurazione per mantenere una temperatura di incubazione interna di 30 °C durante le misurazioni.
- Configurare lo script di misurazione per esportare i dati in un foglio di calcolo o in file ASCII, in base alle preferenze.
5. Programmazione del robot
- Configurare la definizione del piano di lavoro nel software della workstation automatizzata in base alla disposizione fisica dei supporti (ad esempio, agitatori riscaldanti, piattaforme nest, dispositivi di illuminazione) e del materiale da laboratorio (ad esempio, la piastra a 96 pozzetti) (vedere la tabella dei materiali). Creare uno script nel software della workstation di automazione per eseguire l'induzione della luce e le misurazioni (Figura 3), seguendo i passaggi seguenti.
- Disabilitare qualsiasi fonte di illuminazione interna per prevenire l'attivazione di fondo dei sistemi optogeneti.
- Impostare lo scuotitore del riscaldatore in modo che mantenga una temperatura di 30 °C. Quando la piastra non è sullo scuotitore del riscaldatore, sarà a temperatura ambiente (22 °C).
- Utilizza i cicli, un timer e una variabile di conteggio dei cicli per ripetere i passaggi di induzione e misurazione delle cellule a intervalli regolari.
- Prima di registrare le misurazioni, agitare la piastra del campione per garantire la corretta sospensione di tutte le cellule. Un scuotimento di 60 s a 1.000 giri/min con un orbitale di 2 mm è generalmente sufficiente per risospendere le cellule di S288C S. cerevisiae ed evitare distorsioni di misurazione.
- Spostare la piastra del campione sul lettore di micropiastre utilizzando il braccio robotico e rimuovere il coperchio (se applicabile) per evitare distorsioni nella misurazione della densità ottica. Il software di controllo rimuoverà e sostituirà automaticamente il coperchio nella posizione designata se la definizione del supporto del lettore per micropiastre è impostata su non consentire i coperchi.
- Eseguire lo script di misurazione del lettore di micropiastre come descritto al punto 4.
- Riposizionare il coperchio sulla piastra del campione e spostare la piastra sul dispositivo di illuminazione utilizzando il braccio robotico.
- Impostare lo script in modo che attenda che il timer raggiunga l'intervallo di tempo specificato (ad esempio, 30 minuti moltiplicati per la variabile di conteggio del ciclo) e quindi ripetere l'intero ciclo per il numero desiderato di iterazioni (ad esempio, 48 volte per un esperimento di 24 ore).
- Risolvi i potenziali errori e garantisci il corretto funzionamento delle definizioni del supporto e del materiale da laboratorio, nonché la capacità dell'RGA di prelevare e posizionare con precisione la piastra eseguendo più volte una piastra vuota attraverso il ciclo di script.
- Configurare gli avvisi utente per notificare all'utente eventuali modifiche o errori di stato dello strumento che possono verificarsi durante l'esecuzione del protocollo.
6. Impostazione della piastra campione
- Coltiva ceppi di lievito su piastre ricche di mezzi, come l'agar YPD17 (vedi Tabella dei materiali). Includere un controllo non fluorescente (negativo).
- Selezionare le colonie dalle piastre e inocularle in 3 mL di terreno SC14 (o un altro terreno a bassa fluorescenza, come LFM18) in provette di coltura di vetro. Incubare le colture per una notte a 30 °C su un tamburo a rulli, tenendole al buio o in condizioni di luce non reattiva (ad esempio, luce rossa per sistemi sensibili alla luce blu).
- Misurare la densità ottica delle colture notturne diluendo 200 μL di ciascuna coltura in 1 mL di terreno SC e registrando la densità ottica a 600 nm (OD600) utilizzando uno spettrofotometro o un lettore di micropiastre.
- Diluire ogni coltura notturna a un OD600 di 0,1 in provette di vetro. Per test di deformazione a maggiore produttività, eseguire diluizioni automatiche in piastre a micropozzetti.
- Pipettare le colture diluite nella piastra a 96 pozzetti. Includere pozzetti triplicati per ogni condizione (cioè tre pozzetti identici con la stessa deformazione e condizione di luce) per tenere conto della variazione tecnica. Includere pozzetti con terreni vergini e celle non fluorescenti come controlli negativi per misurare la fluorescenza di fondo e la densità ottica.
- Incubare la piastra a 30 °C agitando per 5 ore prima di iniziare l'esperimento di induzione della luce. Regolare le quantità di diluizione e i tempi di incubazione secondo necessità per ottimizzare ceppi specifici e condizioni sperimentali.
7. Esecuzione dell'esperimento
- Posizionare la piastra campione sull'agitatore del riscaldatore e avviare lo script di automazione come descritto al punto 5.
- Iniziare il programma di stimolazione della luce come descritto al punto 3 una volta registrata la misurazione iniziale sul lettore di piastre.
- Se la postazione di lavoro di automazione non si trova in una stanza buia, coprirla con una tenda oscurante per evitare l'illuminazione di fondo.
8. Analisi dei dati
- Creare un foglio di calcolo per l'esperimento, riflettendo il layout 8 x 12 della piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che la mappa includa i nomi delle deformazioni misurate in una griglia e le descrizioni delle condizioni di luce utilizzate in un'altra griglia.
- Utilizzare uno script Python o un altro linguaggio di programmazione preferito per analizzare i dati esportati. Importare il foglio di calcolo della mappa in un array, associando i nomi dei ceppi e dei nomi delle condizioni a ciascun pozzetto della piastra.
NOTA: Il codice di esempio per l'analisi è disponibile all'indirizzo: https://github.com/mccleanlab/Lustro. In alternativa, è possibile utilizzare un'applicazione per analizzare i dati provenienti da vari lettori di lastre19. - Leggere i dati dal foglio di calcolo dell'esperimento esportato in un'altra matrice.
- Generare grafici dei valori di densità ottica e dei valori di fluorescenza per ogni ceppo e condizione nel tempo, come illustrato nella Figura 4.
- Esaminare i grafici di densità ottica per determinare gli stadi di crescita esponenziale o saturazione nelle colture. Queste informazioni aiuteranno a selezionare i punti temporali appropriati per confrontare le misure di fluorescenza tra ceppi o condizioni, come illustrato nella Figura 5.
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Representative Results
La Figura 4A mostra i valori di fluorescenza nel tempo per un ceppo optogenetico che esprime un reporter fluorescente controllato da un fattore di trascrizione diviso inducibile dalla luce. Le diverse condizioni di luce utilizzate nell'esperimento sono riflesse dalle variazioni del ciclo di lavoro, che rappresenta la percentuale di tempo in cui la luce è accesa. Si osserva che il livello complessivo di fluorescenza è proporzionale al ciclo di lavoro della stimolazione luminosa. La Figura 4B mostra i corrispondenti valori OD700 per lo stesso esperimento. La coerenza delle letture della densità ottica in diverse condizioni di luce suggerisce che la tecnica sperimentale non influisce in modo significativo sul tasso di crescita dei ceppi in condizioni di luce variabili.
Misurando la fluorescenza e la densità ottica nel tempo, è possibile ottenere una comprensione più profonda di come i sistemi optogenetici rispondono a diversi programmi di stimolazione luminosa rispetto alle tecniche che catturano l'output solo in un singolo punto temporale. Questi dati sull'andamento temporale sono preziosi per selezionare punti temporali specifici per confrontare diversi ceppi e condizioni. La Figura 5 illustra un singolo punto temporale (misurato a 10 ore dall'inizio dell'induzione della luce) per due distinti ceppi optogenetici indotti da diversi programmi di stimolazione luminosa. Entrambi i ceppi impiegano un fattore di trascrizione diviso inducibile dalla luce per guidare l'espressione di un reporter fluorescente. Le variazioni nell'intensità dell'impulso luminoso, nel periodo e nel ciclo di lavoro suscitano risposte diverse in questi ceppi.
Figura 1: Layout del piano di lavoro e flusso di lavoro sperimentale. Screenshot di un layout di piano di lavoro di esempio, che indica il movimento della piastra campione in Lustro. La piastra viene spostata dal braccio robotico da un agitatore riscaldante (1) al lettore di micropiastre (2) e quindi al dispositivo di illuminazione (3). Le fotografie sono fornite nella Figura 1 supplementare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Script di misura del lettore di piastre. Screenshot di esempio di uno script per lettore di piastre che imposta il lettore di micropiastre per l'incubazione a 30 °C e la registrazione delle misure di fluorescenza e densità ottica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Script per workstation automatizzata. Screenshot di esempio di uno script per workstation automatizzato per Lustro. Lo script avvia un timer, si assicura che la luce interna sia spenta, imposta una variabile di conteggio dei loop su un valore iniziale di 0 e imposta l'agitatore del riscaldatore per l'incubazione a 30 °C. All'interno di ogni ciclo, la piastra viene bloccata, agitata per 1 minuto, spostata sul lettore di piastre, misurata, quindi spostata sul dispositivo di illuminazione e il robot viene impostato per attendere il resto dell'intervallo di 30 minuti. Al termine di questo tempo, la variabile contatore del ciclo viene aumentata di uno e il ciclo viene ripetuto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Corso del tempo di induzione. Campioni di dati del corso temporale di induzione della luce da un ceppo di fattore di trascrizione diviso Gal4BD-eMagA/eMagB-Gal4AD con un reporter pGAL1-mScarlet-I (yMM17346). La fluorescenza di mScarlet-I7 è misurata a 563 nm di eccitazione e 606 nm di emissione con un guadagno ottico di 130. L'intensità della luce è di 125 μW/cm2 e le barre di errore rappresentano l'errore standard dei campioni triplicati. La linea tratteggiata rossa verticale indica quando le impostazioni cultura raggiungono la saturazione. (A) Valori di fluorescenza della deformazione nel tempo. I modelli di luce (come indicato) sono stati ripetuti per l'intera durata dell'esperimento mostrato. Il riquadro mostra che i tempi degli impulsi di luce sono intervallati da tempi di interimpulso di buio, ripetuti durante l'indagine. (B) Valori di densità ottica (misurata a 700 nm) per l'esperimento di cui al punto (A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Confronto tra diversi sistemi optogenetici. Confronto di diversi programmi di induzione della luce tra i ceppi di fattore di trascrizione diviso CRY2(535)/CIB1 ed eMagA/eMagBM con reporter pGAL1-mScarlet-I (yMM1763 e yMM17656, rispettivamente). La fluorescenza di mScarlet-I7 è misurata a 563 nm di eccitazione e 606 nm di emissione con un guadagno ottico di 130. L'intensità luminosa utilizzata è di 125 μW/cm2, salvo diversa indicazione. Le barre di errore rappresentano l'errore standard dei campioni triplicati (indicati come punti). I valori di fluorescenza mostrati sono stati registrati 10 ore dopo l'inizio dell'induzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 1 supplementare: Immagini rappresentative dei dispositivi utilizzati in Lustro. Immagine della configurazione Lustro e immagini ingrandite dei dispositivi utilizzati. Il braccio robotico sposta la piastra del campione dall'agitatore riscaldante al lettore di piastre e quindi al dispositivo di illuminazione in un ciclo per tutta la durata dell'esperimento. I componenti sono numerati con una legenda sul lato. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
Il protocollo Lustro qui presentato automatizza i processi di coltivazione, illuminazione e misurazione, consentendo lo screening e la caratterizzazione ad alto rendimento dei sistemi optogenetici6. Ciò si ottiene integrando un dispositivo di illuminazione, un lettore di micropiastre e un dispositivo di scuotimento in una stazione di lavoro di automazione. Questo protocollo dimostra in modo specifico l'utilità di Lustro per lo screening di diversi costrutti optogenetici integrati nel lievito S. cerevisiae e per il confronto dei programmi di induzione della luce.
Diversi passaggi cruciali sottolineati in questo protocollo sono essenziali per l'utilizzo efficace di Lustro. È necessaria un'attenta progettazione di programmi di illuminazione personalizzati che si allineino con la cinetica del costrutto optogenetico in esame. Inoltre, la calibrazione precisa del lettore di piastre è fondamentale per ottenere misurazioni affidabili. Per garantire che lo script funzioni senza intoppi, sono fondamentali un'accurata prova degli esperimenti sul robot, comprese le regolazioni necessarie per garantire una corretta sincronizzazione con i programmi di illuminazione.
Il protocollo di esempio qui fornito descrive il confronto di un fattore di trascrizione diviso inducibile dalla luce che guida l'espressione di un reporter fluorescente con un controllo non fluorescente in varie condizioni di stimolazione luminosa. Le misurazioni della fluorescenza vengono effettuate da ciascun pozzetto della piastra a intervalli di 30 minuti, precedute da 1 minuto di agitazione sull'agitatore riscaldatore prima della misurazione. Come dimostrato in questo protocollo, Lustro è adatto per l'uso con sistemi optogenetici sensibili alla luce blu integrati in tipi di cellule non aderenti, inclusi batteri e altri lieviti. Tuttavia, con piccole modifiche, il protocollo può essere facilmente esteso a diversi tipi di cellule, sistemi optogenici e disegni sperimentali. Le regolazioni delle impostazioni del lettore di piastre consentirebbero la misurazione di uscite diverse dalla fluorescenza, come la bioluminescenza. Per le applicazioni che richiedono una risoluzione temporale più fine, le misurazioni possono essere eseguite più frequentemente. L'incubazione sull'agitatore riscaldatore può essere ripetuta più spesso quando è fondamentale per specifici tipi di cellule che richiedono agitazione e controllo della temperatura. L'incorporazione del gas e il controllo ambientale, ad esempio attraverso un hotel incubato, consentirebbero l'inclusione di linee cellulari di mammifero. Mentre l'iterazione di Lustro qui descritta utilizza una strumentazione specifica, la piattaforma Lustro può essere facilmente adattata per funzionare con altri robot di automazione di laboratorio o lettori di micropiastre. I dispositivi di illuminazione, come l'LPA20 o il LITOS9, potrebbero sostituire l'optoPlate per stimolare diversi sistemi optogenetici. Una futura modifica della piattaforma Lustro potrebbe comportare l'incorporazione della manipolazione dei liquidi per facilitare le diluizioni automatizzate per le applicazioni di coltura continua. Ciò consentirebbe anche di adattare Lustro per il controllo del feedback cibergenetico, in cui le misurazioni in tempo reale informano sui cambiamenti nelle condizioni di luce o coltura per ottenere o mantenere una risposta desiderata 5,21,22.
Le tecniche ad alto rendimento sono fondamentali per ottimizzare e sfruttare la natura dinamica dei sistemi optogeneti. Lustro supera molti limiti dei protocolli esistenti. Ad esempio, mentre le tecniche di optogenetica basate su bioreattori consentono una lettura costante e condizioni di coltivazione, soffrono di una bassa produttività23,24,25,26. Il dispositivo optoPlateReader27 è promettente per gli esperimenti di optogenetica in tempo reale nelle piastre a micropozzetti, ma attualmente ha una bassa produttività a causa della necessità di un numero elevato di repliche per ottenere risultati affidabili e non fornisce l'accesso alla coltura continua. Lustro, d'altra parte, consente lo screening ad alto rendimento dei sistemi optogenetici per caratterizzare la loro attività dinamica. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni al protocollo Lustro. L'agitazione intermittente in Lustro provoca un piccolo ritardo di crescita per le cellule di lievito6, ma questo potrebbe essere risolto adattando un dispositivo di illuminazione per incorporare l'agitazione. Un'altra limitazione del sistema Lustro è che la piastra del campione non viene incubata mentre è sul dispositivo di illuminazione e viene mantenuta a temperatura ambiente (22 °C). Sebbene il volume ridotto di ciascun campione consenta di ottenere schermi ad alto rendimento, potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione delle fasi di illuminazione quando si passa a volumi di reazione più grandi per la bioproduzione o altre applicazioni28,29.
Nel complesso, Lustro facilita lo sviluppo rapido e la sperimentazione di sistemi optogenetici attraverso uno screening ad alto rendimento e un controllo preciso della luce. Questo approccio automatizzato consente una caratterizzazione e un confronto efficienti di diversi costrutti optogenetici in varie condizioni di induzione, portando a un'iterazione e a un perfezionamento più rapidi di questi sistemi. Con la sua adattabilità a diversi tipi di cellule, agli strumenti optogenici e alle configurazioni di automazione, Lustro apre la strada ai progressi nel campo dell'optogenetica, facilitando l'esplorazione del controllo dinamico dell'espressione genica e ampliando le possibilità di studio delle reti biologiche e dell'ingegneria del comportamento cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Institutes of Health R35GM128873 e dalla sovvenzione della National Science Foundation 2045493 (assegnata al M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. detiene un premio alla carriera presso lo Scientific Interface del Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. è stato supportato da una sovvenzione di formazione NHGRI per il programma di formazione in scienze genomiche 5T32HG002760. Riconosciamo le fruttuose discussioni con i membri del laboratorio McClean e, in particolare, siamo grati a Kieran Sweeney per aver fornito commenti sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
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