Summary
يحدد هذا البروتوكول خطوات استخدام المنصة الآلية Lustro لإجراء توصيف عالي الإنتاجية للأنظمة الوراثية البصرية في الخميرة.
Abstract
يوفر علم البصريات الوراثي تحكما دقيقا في السلوك الخلوي من خلال استخدام البروتينات الحساسة للضوء المشفرة وراثيا. ومع ذلك ، فإن تحسين هذه الأنظمة لتحقيق الوظيفة المطلوبة غالبا ما يتطلب دورات متعددة لاختبار التصميم والبناء ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة. ولمواجهة هذا التحدي، قمنا بتطوير منصة لوسترو، وهي منصة تجمع بين التحفيز الضوئي وأتمتة المختبرات، مما يتيح الفحص الفعال عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصريات الوراثية.
تستخدم Lustro محطة عمل أتمتة مزودة بجهاز إضاءة وجهاز اهتزاز وقارئ ألواح. من خلال استخدام ذراع روبوتية ، يقوم Lustro بأتمتة حركة لوحة microwell بين هذه الأجهزة ، مما يسمح بتحفيز سلالات البصريات الجينية وقياس استجابتها. يوفر هذا البروتوكول دليلا تفصيليا حول استخدام Lustro لتوصيف أنظمة البصريات الوراثية للتحكم في التعبير الجيني في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae. يغطي البروتوكول إعداد مكونات Lustro ، بما في ذلك دمج جهاز الإضاءة مع محطة عمل الأتمتة. كما يوفر تعليمات مفصلة لبرمجة جهاز الإضاءة وقارئ اللوحات والروبوت ، مما يضمن التشغيل السلس والحصول على البيانات طوال العملية التجريبية.
Introduction
علم البصريات الوراثي هو تقنية قوية تستخدم البروتينات الحساسة للضوء للتحكم في سلوك الخلايا بدقةعالية 1،2،3. ومع ذلك ، فإن النماذج الأولية للتركيبات الوراثية البصرية وتحديد ظروف الإضاءة المثلى يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، مما يجعل من الصعب تحسين أنظمة البصرياتالوراثية 4,5. يمكن للطرق عالية الإنتاجية لفحص وتوصيف نشاط الأنظمة الوراثية البصرية بسرعة تسريع دورة اختبار التصميم والبناء لاختبار تركيبات النماذج الأولية واستكشاف وظيفتها.
تم تطوير منصة Lustro كتقنية أتمتة للمختبرات مصممة لفحص وتوصيف أنظمة البصريات الوراثية عالية الإنتاجية. إنه يدمج قارئ الصفائح الدقيقة وجهاز الإضاءة وجهاز الاهتزاز مع محطة عمل الأتمتة6. يجمع Lustro بين الزراعة الآلية والتحفيز الضوئي للخلايا في ألواح microwell (الشكل 1 والشكل التكميلي 1) ، مما يتيح الفحص والمقارنة السريعة لأنظمة البصريات الوراثية المختلفة. منصة Lustro قابلة للتكيف بدرجة كبيرة ويمكن تعميمها للعمل مع روبوتات أتمتة المختبرات الأخرى ، وأجهزة الإضاءة ، وقارئات الألواح ، وأنواع الخلايا ، وأنظمة علم البصريات الوراثية ، بما في ذلك تلك التي تستجيب لأطوال موجية مختلفة من الضوء.
يوضح هذا البروتوكول إعداد واستخدام Lustro لتوصيف نظام البصريات الوراثي. يستخدم التحكم البصري الوراثي لعوامل النسخ المنقسمة في الخميرة كمثال على النظام لتوضيح وظيفة وفائدة المنصة من خلال التحقيق في العلاقة بين مدخلات الضوء والتعبير عن جين مراسل الفلورسنت ، mScarlet-I7. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين تبسيط تحسين أنظمة البصريات الوراثية وتسريع اكتشاف استراتيجيات جديدة للتحكم الديناميكي في الأنظمة البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم توثيق سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد. تظهر هذه السلالات نموا قويا في نطاق درجة الحرارة من 22 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية ويمكن زراعتها في مختلف وسائط الخميرة القياسية.
1. إعداد محطة عمل الأتمتة
- جهز محطة العمل الآلية بذراع قابض روبوتي (RGA ، انظر جدول المواد) قادر على تحريك ألواح microwell (الشكل 1).
- قم بتركيب شاكر سخان الألواح الدقيقة (انظر جدول المواد) في محطة العمل الآلية (الشكل 1 (1)) باستخدام آلية قفل اللوحة التلقائية التي توفر الوصول إلى RGA.
- ضع قارئ الألواح الدقيقة بجوار محطة العمل الآلية (الشكل 1 (2)) ، مما يضمن إمكانية الوصول إلى RGA.
- قم بدمج جهاز إضاءة microplate (الشكل 1 (3)) الذي يسمح بالوصول المريح إلى RGA. ومن الأمثلة على ذلك لوحة البصر8 (كما هي مستخدمة في هذه الدراسة) أو LITOS9 (انظر جدول المواد).
2. إعداد جهاز الإضاءة
- قم ببناء ومعايرة لوحة البصر (أو جهاز الإضاءة البديل) باتباع الطرق المعمول بها8،10،11.
- استخدم محولا على جهاز الإضاءة لتمكين الوصول إلى RGA.
- قم ببرمجة optoPlate باستخدام إدخال جدول بيانات10 أو واجهة رسومية12. اتبع الخطوة 3 لتنفيذ برامج تحفيز الضوء.
3. تصميم برنامج التحفيز الضوئي
- حدد ظروف الإضاءة المطلوبة للتجربة.
- أدخل ظروف الإضاءة المطلوبة، بما في ذلك شدة الضوء ووقت بدء الضوء وطول النبضة ورقم النبضة ومدة النبضة البينية في جدول بيانات.
ملاحظة: قم بتحديث هذه المعلومات على لوحة البصر باستخدام الإرشادات المتوفرة في مستودع GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. تذكر أن لوحة العينة لن تضيء أثناء وجودها في قارئ الصفيحة الدقيقة أو على شاكر السخان. قد تتطلب مدة وتواتر هذه الأحداث التحسين بناء على متطلبات تجريبية محددة. - قم بتضمين الظروف المظلمة لكل سلالة لتمكين قياسات الخلفية المناسبة.
- لتجارب التوصيف الأولية لتقييم وظائف التحويل ، استخدم شدة ضوء عالية.
ملاحظة: يجب تحسين شدة الضوء لإجراء تجارب أكثر حساسية ، حيث يمكن أن يكون الضوء الزائد ساما للضوء للخميرة13.
4. إعداد قارئ الصفائح الدقيقة
- قم بتكوين قارئ الصفائح الدقيقة لقياس الكمية المطلوبة من الاهتمام قبل إجراء التجارب.
ملاحظة: في هذا المثال ، تم تكوين قارئ الصفائح الدقيقة لقياس التألق من مراسل يعبر عنه إجهاد الاهتمام. يمكن استخدام مخرجات أخرى ، مثل التلألؤ أو الكثافة الضوئية ، اعتمادا على المتطلبات التجريبية. - قم بزراعة سلالة الاهتمام (جنبا إلى جنب مع عنصر تحكم غير فلوري) في الوسائط الاصطناعية الكاملة (SC)14 (أو وسائط مضان منخفضة أخرى) (انظر جدول المواد) إلى أعلى كثافة خلية ليتم قياسها. انقل الثقافات إلى لوحة ميكروويل ذات قاع زجاجي أسود الجدران (انظر جدول المواد) وقم بقياسها لتحديد إعدادات قارئ الصفائح الدقيقة المثلى.
ملاحظة: تأكد من قراءات دقيقة عن طريق إدخال أبعاد اللوحة بشكل صحيح وقياس اللوحة من الأسفل. - الرجوع إلى قاعدة بيانات البروتين الفلوري (على سبيل المثال ، fpbase.org) للحصول على أطياف الامتصاص والانبعاث التقريبية للبروتين الفلوريالمستهدف 15.
- حدد قيمة z (المسافة بين اللوحة والقارئ) عن طريق إجراء مسح z على الآبار التي تحتوي على سلالات الفلورسنت وغير الفلورسنت. حدد قيمة z التي تنتج أعلى نسبة إشارة إلى ضوضاء.
- تحسين أطياف الامتصاص والانبعاث عن طريق إجراء عمليات مسح الامتصاص والانبعاث على سلالات الفلورسنت وغير الفلورسنت لتحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى.
- قم بقياس إجهاد الفلورسنت مع ضبط الكسب على المستوى الأمثل ، وتحديد أعلى كسب بصري يمكن استخدامه دون التسبب في خطأ في قياس الفائض.
ملاحظة: يجب ضبط هذا الكسب البصري يدويا بشكل متسق عبر التجارب التي تتضمن نفس الإجهاد لضمان اتساق النتائج. - قم بإعداد برنامج نصي للقياس (راجع الشكل 2) في برنامج قارئ الألواح الدقيقة. يقوم هذا البرنامج النصي بتكوين الأداة لقياس الكثافة الضوئية للمزارع والأطياف الفلورية لأي بروتينات فلورية ليتم قياسها.
ملاحظة: قم بقياس الكثافة البصرية للسلالات عند 600 نانومتر ما لم تعبر عن بروتينات الفلورسنت الحمراء. بالنسبة للسلالات التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت الحمراء ، قم بقياس الكثافة البصرية عند 700 نانومتر لتجنب التحيز16. - اضبط البرنامج النصي للقياس للحفاظ على درجة حرارة حضانة داخلية تبلغ 30 درجة مئوية أثناء القياسات.
- قم بتكوين البرنامج النصي للقياس لتصدير البيانات إلى جدول بيانات أو ملفات ASCII ، وفقا للتفضيل.
5. برمجة الروبوت
- قم بتكوين تعريف طاولة العمل في برنامج محطة العمل الآلي بناء على التخطيط المادي للناقلات (على سبيل المثال ، هزازات السخان ، ومنصات العش ، وأجهزة الإضاءة) وأدوات المختبر (أي لوحة 96 بئرا) (انظر جدول المواد). قم بإنشاء برنامج نصي في برنامج محطة عمل الأتمتة لتنفيذ تحريض الضوء والقياسات (الشكل 3) ، باتباع الخطوات التالية.
- قم بتعطيل أي مصادر إضاءة داخلية لمنع تنشيط الخلفية للأنظمة البصرية الوراثية.
- اضبط شاكر السخان للحفاظ على درجة حرارة 30 درجة مئوية. عندما لا تكون اللوحة على شاكر السخان ، ستكون في درجة الحرارة المحيطة (22 درجة مئوية).
- استخدم الحلقات والمؤقت ومتغير عد الحلقة لتكرار خطوات تحفيز الخلايا وقياسها على فترات منتظمة.
- قبل تسجيل القياسات ، هز لوحة العينة لضمان التعليق المناسب لجميع الخلايا. اهتزاز 60 ثانية عند 1000 دورة في الدقيقة مع مدار 2 مم يكفي بشكل عام لإعادة تعليق خلايا S288C S. cerevisiae وتجنب تحيز القياس.
- انقل لوحة العينة إلى قارئ الصفيحة الدقيقة باستخدام ذراع الروبوت وقم بإزالة الغطاء (إن أمكن) لمنع التحيز في قياس الكثافة البصرية. سيقوم برنامج التحكم تلقائيا بإزالة الغطاء واستبداله إلى الموضع المحدد إذا تم ضبط تعريف حامل قارئ الصفيحة الدقيقة على عدم السماح بالغطاء.
- قم بتنفيذ البرنامج النصي لقياس قارئ الصفائح الدقيقة كما هو موضح في الخطوة 4.
- استبدل الغطاء الموجود على لوحة العينة وانقل اللوحة إلى جهاز الإضاءة باستخدام ذراع الروبوت.
- اضبط البرنامج النصي على الانتظار حتى يصل المؤقت إلى الفاصل الزمني المحدد (على سبيل المثال ، 30 دقيقة مضروبة في متغير عد الحلقة) ثم كرر الحلقة بأكملها للعدد المطلوب من التكرارات (على سبيل المثال ، 48 مرة لتجربة 24 ساعة).
- استكشاف الأخطاء المحتملة وإصلاحها وضمان الأداء السليم لتعريفات الناقل والأدوات المعملية ، بالإضافة إلى قدرة RGA على التقاط اللوحة ووضعها بدقة عن طريق تشغيل لوحة فارغة عبر حلقة البرنامج النصي عدة مرات.
- قم بتكوين تنبيهات المستخدم لإعلام المستخدم بأي تغييرات أو أخطاء في حالة الأداة قد تحدث أثناء تنفيذ البروتوكول.
6. إعداد لوحة العينة
- تنمو سلالات الخميرة على ألواح الوسائط الغنية ، مثل YPD agar17 (انظر جدول المواد). قم بتضمين عنصر تحكم غير فلوري (سلبي).
- حدد المستعمرات من الألواح وقم بتلقيحها في 3 مل من وسائط SC14 (أو وسائط مضان منخفضة أخرى ، مثل LFM18) في أنابيب الثقافة الزجاجية. احتضان الثقافات طوال الليل عند 30 درجة مئوية على أسطوانة دوارة مع إبقائها في الظلام أو في ظل ظروف الإضاءة غير المستجيبة (على سبيل المثال ، الضوء الأحمر للأنظمة المستجيبة للضوء الأزرق).
- قم بقياس الكثافة البصرية للمزارع الليلية عن طريق تخفيف 200 ميكرولتر من كل مزرعة إلى 1 مل من وسائط SC وتسجيل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو قارئ الصفيحة الدقيقة.
- تمييع كل ثقافة بين عشية وضحاها إلىOD 600 من 0.1 في أنابيب الثقافة الزجاجية. لاختبار إجهاد الإنتاجية الأعلى ، قم بإجراء التخفيفات الآلية في ألواح microwell.
- ماصة الثقافات المخففة في لوحة 96 بئرا. قم بتضمين الآبار الثلاثية لكل حالة (أي ثلاثة آبار متطابقة بنفس السلالة وحالة الضوء) لمراعاة التباين الفني. قم بتضمين الآبار ذات الوسائط الفارغة والخلايا غير الفلورية كعناصر تحكم سلبية لقياس مضان الخلفية والكثافة البصرية.
- احتضان اللوحة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة 5 ساعات قبل البدء في تجربة الحث الضوئي. اضبط كميات التخفيف وأوقات الحضانة حسب الضرورة لتحسين سلالات وظروف تجريبية محددة.
7. إجراء التجربة
- ضع لوحة العينة على شاكر السخان وابدأ البرنامج النصي للأتمتة كما هو موضح في الخطوة 5.
- ابدأ برنامج تحفيز الضوء كما هو موضح في الخطوة 3 بمجرد تسجيل القياس الأولي على قارئ اللوحة.
- إذا لم تكن محطة عمل الأتمتة في غرفة مظلمة ، فقم بتغطيتها بستارة معتمة لتجنب إضاءة الخلفية.
8. تحليل البيانات
- قم بإنشاء خريطة جدول بيانات للتجربة ، تعكس تخطيط 8 × 12 للوحة 96 بئرا. تأكد من أن الخريطة تتضمن أسماء السلالات التي يتم قياسها في شبكة واحدة وأوصاف ظروف الإضاءة المستخدمة في شبكة أخرى.
- استخدم برنامج Python النصي أو لغة برمجة مفضلة أخرى لتحليل البيانات المصدرة. قم باستيراد جدول بيانات الخريطة إلى صفيف ، مع ربط أسماء السلالات وأسماء الشروط بكل بئر من اللوحة.
ملاحظة: يمكن العثور على نموذج التعليمات البرمجية للتحليل على: https://github.com/mccleanlab/Lustro. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام تطبيق لتحليل البيانات من قارئات اللوحات المختلفة19. - اقرأ البيانات من جدول بيانات التجربة المصدر إلى صفيف آخر.
- قم بإنشاء مخططات لقيم الكثافة الضوئية وقيم التألق لكل سلالة وحالة بمرور الوقت ، كما هو موضح في الشكل 4.
- فحص مخططات الكثافة الضوئية لتحديد مراحل النمو الأسي أو التشبع في الثقافات. ستساعد هذه المعلومات في اختيار النقاط الزمنية المناسبة لمقارنة قياسات التألق بين السلالات أو الظروف ، كما هو موضح في الشكل 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 4 أ قيم التألق بمرور الوقت لسلالة بصرية وراثية تعبر عن مراسل فلوري يتحكم فيه عامل نسخ انقسام مستحث للضوء. تنعكس ظروف الإضاءة المختلفة المستخدمة في التجربة من خلال الاختلافات في دورة العمل ، والتي تمثل النسبة المئوية للوقت الذي يكون فيه الضوء مضاء. لوحظ أن مستوى التألق الكلي يتناسب مع دورة عمل التحفيز الضوئي. يعرض الشكل 4B قيم OD700 المقابلة لنفس التجربة. يشير اتساق قراءات الكثافة الضوئية عبر ظروف الإضاءة المختلفة إلى أن التقنية التجريبية لا تؤثر بشكل كبير على معدل نمو السلالات في ظل ظروف الإضاءة المختلفة.
من خلال قياس التألق والكثافة الضوئية بمرور الوقت ، يمكن اكتساب فهم أعمق لكيفية استجابة أنظمة البصريات الوراثية لبرامج تحفيز الضوء المختلفة مقارنة بالتقنيات التي تلتقط المخرجات فقط في نقطة زمنية واحدة. تعد بيانات الدورة الزمنية هذه ذات قيمة لاختيار نقاط زمنية محددة لمقارنة السلالات والظروف المختلفة. يوضح الشكل 5 نقطة زمنية واحدة (تقاس عند 10 ساعات في الحث الضوئي) لسلالتين بصريتين متميزتين تسبهما برامج تحفيز الضوء المختلفة. تستخدم كلتا السلالتين عامل نسخ مقسم مستحث للضوء لدفع تعبير مراسل الفلورسنت. تثير الاختلافات في شدة نبضة الضوء والفترة ودورة العمل استجابات مختلفة في هذه السلالات.
الشكل 1: تخطيط طاولة العمل وسير العمل التجريبي. لقطة شاشة لنموذج تخطيط طاولة العمل ، تشير إلى حركة لوحة العينة في Lustro. يتم نقل اللوحة بواسطة الذراع الروبوتية من شاكر السخان (1) إلى قارئ الصفيحة الدقيقة (2) ، ثم إلى جهاز الإضاءة (3). وترد الصور في الشكل التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نص قياس قارئ اللوحة. لقطة شاشة نموذجية لنص برمجي لقارئ الألواح يقوم بإعداد قارئ الصفيحة الدقيقة لاحتضانه عند 30 درجة مئوية وتسجيل التألق وقياسات الكثافة الضوئية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: البرنامج النصي لمحطة العمل الآلي. نموذج لقطة شاشة لبرنامج نصي لمحطة عمل تلقائية ل Lustro. يبدأ البرنامج النصي مؤقتا ، ويضمن إيقاف تشغيل الضوء الداخلي ، ويضبط متغير عد الحلقة على قيمة أولية تبلغ 0 ، ويضبط شاكر السخان على الاحتضان عند 30 درجة مئوية. داخل كل حلقة ، يتم قفل اللوحة ، واهتزازها لمدة 1 دقيقة ، ونقلها إلى قارئ اللوحة ، وقياسها ، ثم نقلها إلى جهاز الإضاءة ، ويتم تعيين الروبوت لانتظار ما تبقى من فترة حلقة 30 دقيقة. في نهاية هذا الوقت ، يتم زيادة متغير عداد الحلقة بمقدار واحد ، وتتكرر الحلقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: دورة وقت التعريف. عينة من بيانات دورة وقت الحث الضوئي من سلالة عامل النسخ المنقسم Gal4BD-eMagA / eMagB-Gal4AD مع مراسل pGAL1-mScarlet-I (yMM17346). يتم قياس مضان mScarlet-I7 عند إثارة 563 نانومتر وانبعاث 606 نانومتر مع كسب بصري يبلغ 130. شدة الضوء هي 125 μW / سم2 وتمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للعينات الثلاثية. يظهر الخط المنقط الأحمر العمودي عندما تصل الثقافات إلى التشبع. أ: قيم التألق الناتجة عن الإجهاد بمرور الزمن. تم تكرار أنماط الضوء (كما هو موضح) طوال مدة التجربة الموضحة. يظهر Inset أن أوقات النبض الخفيف تتخللها أوقات نبضات مظلمة ، تتكرر طوال التحقيق. (ب) قيم الكثافة البصرية (المقاسة عند 700 نانومتر) للتجربة الموضحة في (أ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقارنة بين أنظمة البصريات الوراثية المختلفة. مقارنة بين برامج الحث الضوئي المختلفة بين سلالات عامل النسخ المقسم CRY2 (535) / CIB1 و eMagA / eMagBM مع مراسلي pGAL1-mScarlet-I (yMM1763 و yMM17656 ، على التوالي). يتم قياس مضان mScarlet-I7 عند إثارة 563 نانومتر وانبعاث 606 نانومتر مع كسب بصري يبلغ 130. شدة الضوء المستخدمة هي 125 μW / سم2 ، ما لم يذكر خلاف ذلك. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للعينات الثلاثية (المشار إليها بالنقاط). تم تسجيل قيم التألق الموضحة بعد 10 ساعات من الحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: صور تمثيلية للأجهزة المستخدمة في Lustro. صورة لإعداد Lustro وصور مكبرة للأجهزة المستخدمة. تنقل الذراع الروبوتية لوحة العينة من شاكر السخان إلى قارئ اللوحة ثم إلى جهاز الإضاءة في دورة طوال التجربة. يتم ترقيم المكونات مع وسيلة إيضاح على الجانب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعمل بروتوكول Lustro المعروض هنا على أتمتة عمليات الزراعة والإضاءة والقياس ، مما يتيح الفحص عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصرياتالوراثية 6. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج جهاز الإضاءة وقارئ الألواح الدقيقة وجهاز الاهتزاز في محطة عمل الأتمتة. يوضح هذا البروتوكول على وجه التحديد فائدة Lustro لفحص تركيبات البصريات الجينية المختلفة المدمجة في الخميرة S. cerevisiae ومقارنة برامج الحث الضوئي.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تم التأكيد عليها في هذا البروتوكول ضرورية للاستخدام الفعال ل Lustro. من الضروري التصميم الدقيق لبرامج الإضاءة المخصصة التي تتوافق مع حركية البنية البصرية الجينية قيد التحقيق. بالإضافة إلى ذلك ، تعد المعايرة الدقيقة لقارئ اللوحة أمرا بالغ الأهمية للحصول على قياسات موثوقة. تعد عمليات التشغيل الجاف الشامل للتجارب على الروبوت ، بما في ذلك التعديلات اللازمة لضمان التزامن المناسب مع برامج الإضاءة ، أمرا بالغ الأهمية لضمان تشغيل البرنامج النصي بسلاسة.
يصف نموذج البروتوكول المقدم هنا مقارنة عامل النسخ المقسم المستحث للضوء الذي يقود تعبير مراسل الفلورسنت إلى عنصر تحكم غير فلوري في ظل ظروف تحفيز الضوء المختلفة. يتم أخذ قياسات مضان من كل بئر في اللوحة على فترات 30 دقيقة ، يسبقها 1 دقيقة من الاهتزاز على شاكر السخان قبل القياس. كما هو موضح في هذا البروتوكول ، فإن Lustro مناسب للاستخدام مع أنظمة علم البصريات المستجيبة للضوء الأزرق المدمجة في أنواع الخلايا غير الملتصقة ، بما في ذلك البكتيريا والخمائر الأخرى. ومع ذلك ، مع تعديلات طفيفة ، يمكن توسيع البروتوكول بسهولة ليشمل أنواع مختلفة من الخلايا وأنظمة علم البصريات الوراثي والتصاميم التجريبية. ستسمح التعديلات على إعدادات قارئ اللوحة بقياس المخرجات بخلاف التألق ، مثل التلألؤ الحيوي. بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب دقة زمنية أدق ، يمكن إجراء القياسات بشكل متكرر. يمكن تكرار الحضانة على شاكر السخان في كثير من الأحيان عندما تكون حرجة لأنواع معينة من الخلايا تتطلب الاهتزاز والتحكم في درجة الحرارة. إن دمج الغاز والتحكم البيئي ، مثل من خلال فندق محتضن ، سيمكن من إدراج خطوط خلايا الثدييات. بينما يستخدم تكرار Lustro الموصوف هنا أجهزة محددة ، يمكن تكييف منصة Lustro بسهولة للعمل مع روبوتات أتمتة المختبرات الأخرى أو قارئات الألواح الدقيقة. يمكن لأجهزة الإضاءة ، مثل LPA20 أو LITOS9 ، أن تحل محل لوحة البصريات لتحفيز أنظمة البصريات الوراثية المختلفة. يمكن أن يتضمن التعديل المستقبلي لمنصة Lustro دمج معالجة السوائل لتسهيل التخفيفات الآلية لتطبيقات الاستزراع المستمر. وهذا من شأنه أيضا أن يمكن من تكييف Lustro للتحكم في التغذية المرتدة السيبرانية ، حيث تبلغ القياسات في الوقت الفعلي عن التغييرات في ظروف الضوء أو الثقافة لتحقيق أو الحفاظ على الاستجابة المطلوبة5،21،22.
تعد التقنيات عالية الإنتاجية ضرورية لتحسين وتسخير الطبيعة الديناميكية للأنظمة البصرية الوراثية. يتغلب Lustro على العديد من قيود البروتوكولات الحالية. على سبيل المثال ، في حين أن تقنيات علم البصريات الوراثية القائمة على المفاعل الحيوي تتيح القراءة المستمرة وظروف الاستزراع ، فإنها تعاني من إنتاجية منخفضة 23،24،25،26. يبشر جهاز optoPlateReader27 بتجارب علم البصريات الوراثية في الوقت الفعلي في لوحات microwell ، ولكنه يتمتع حاليا بإنتاجية منخفضة بسبب الحاجة إلى عدد كبير من النسخ المتماثلة للحصول على نتائج موثوقة ولا يوفر الوصول إلى الزراعة المستمرة. من ناحية أخرى ، يتيح Lustro فحصا عالي الإنتاجية للأنظمة الوراثية البصرية لتوصيف نشاطها الديناميكي. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على بروتوكول Lustro. يتسبب الاهتزاز المتقطع في Lustro في تأخر نمو صغير لخلايا الخميرة6 ، ولكن يمكن معالجة ذلك عن طريق تكييف جهاز إضاءة لدمج الاهتزاز. هناك قيد آخر لنظام Lustro وهو أن لوحة العينة لا يتم تحضينها أثناء وجودها على جهاز الإضاءة ويتم الحفاظ عليها في درجة الحرارة المحيطة (22 درجة مئوية). على الرغم من أن الحجم الصغير لكل عينة يسمح بشاشات عالية الإنتاجية ، فقد يكون من الضروري تحسين خطوات الإضاءة بشكل إضافي عند التوسع إلى أحجام تفاعل أكبر للإنتاج الحيوي أو التطبيقات الأخرى28,29.
بشكل عام ، تسهل Lustro التطوير السريع واختبار أنظمة البصريات الوراثية من خلال الفحص عالي الإنتاجية والتحكم الدقيق في الضوء. يتيح هذا النهج الآلي التوصيف والمقارنة الفعالة لمختلف البنى البصرية الجينية في ظل ظروف تحريض مختلفة ، مما يؤدي إلى تكرار وصقل أسرع لهذه الأنظمة. بفضل قدرته على التكيف مع أنواع الخلايا المختلفة ، وأدوات علم البصريات الوراثية ، وإعدادات الأتمتة ، يمهد Lustro الطريق للتقدم في مجال علم البصريات الوراثي ، مما يسهل استكشاف التحكم الديناميكي في التعبير الجيني وتوسيع إمكانيات دراسة الشبكات البيولوجية وهندسة السلوك الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM128873 ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية 2045493 (منحت ل M.N.M.). ميغان نيكول ماكلين ، دكتوراه حاصلة على جائزة مهنية في الواجهة العلمية من صندوق بوروز ويلكوم. تم دعم ZPH من خلال منحة تدريب NHGRI لبرنامج التدريب على علوم الجينوم 5T32HG002760. نحن نقدر المناقشات المثمرة مع أعضاء مختبر ماكلين ، وعلى وجه الخصوص ، نحن ممتنون لكيران سويني لتقديم تعليقات على المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
- Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
