يحدد هذا البروتوكول خطوات استخدام المنصة الآلية Lustro لإجراء توصيف عالي الإنتاجية للأنظمة الوراثية البصرية في الخميرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تجارب علم البصريات الوراثية عالية الإنتاجية في الخميرة باستخدام المنصة الآلية Lustro
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوفر علم البصريات الوراثي تحكما دقيقا في السلوك الخلوي من خلال استخدام البروتينات الحساسة للضوء المشفرة وراثيا. ومع ذلك ، فإن تحسين هذه الأنظمة لتحقيق الوظيفة المطلوبة غالبا ما يتطلب دورات متعددة لاختبار التصميم والبناء ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة. ولمواجهة هذا التحدي، قمنا بتطوير منصة لوسترو، وهي منصة تجمع بين التحفيز الضوئي وأتمتة المختبرات، مما يتيح الفحص الفعال عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصريات الوراثية.
تستخدم Lustro محطة عمل أتمتة مزودة بجهاز إضاءة وجهاز اهتزاز وقارئ ألواح. من خلال استخدام ذراع روبوتية ، يقوم Lustro بأتمتة حركة لوحة microwell بين هذه الأجهزة ، مما يسمح بتحفيز سلالات البصريات الجينية وقياس استجابتها. يوفر هذا البروتوكول دليلا تفصيليا حول استخدام Lustro لتوصيف أنظمة البصريات الوراثية للتحكم في التعبير الجيني في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae. يغطي البروتوكول إعداد مكونات Lustro ، بما في ذلك دمج جهاز الإضاءة مع محطة عمل الأتمتة. كما يوفر تعليمات مفصلة لبرمجة جهاز الإضاءة وقارئ اللوحات والروبوت ، مما يضمن التشغيل السلس والحصول على البيانات طوال العملية التجريبية.
المقدمة
علم البصريات الوراثي هو تقنية قوية تستخدم البروتينات الحساسة للضوء للتحكم في سلوك الخلايا بدقةعالية 1،2،3. ومع ذلك ، فإن النماذج الأولية للتركيبات الوراثية البصرية وتحديد ظروف الإضاءة المثلى يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، مما يجعل من الصعب تحسين أنظمة البصرياتالوراثية 4,5. يمكن للطرق عالية الإنتاجية لفحص وتوصيف نشاط الأنظمة الوراثية البصرية بسرعة تسريع دورة اختبار التصميم والبناء لاختبار تركيبات النماذج الأولية واستكشاف وظيفتها.
تم تطوير منصة Lustro كتقنية أتمتة للمختبرات مصممة لفحص وتوصيف أنظ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم توثيق سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد. تظهر هذه السلالات نموا قويا في نطاق درجة الحرارة من 22 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية ويمكن زراعتها في مختلف وسائط الخميرة القياسية.
1. إعداد محطة عمل الأتمتة
- جهز محطة العمل الآلية بذراع قابض روبوتي (RGA ، انظر جدول المواد) قادر على تحريك ألواح microwell (الشكل 1).
- قم بتركيب شاكر سخان الألواح الدقيقة (انظر جدول المواد) في محطة العمل الآلية (الشكل 1 (1)) باستخدام آلية قفل اللوحة التلقائية التي توفر الوصول إلى RGA.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 4 أ قيم التألق بمرور الوقت لسلالة بصرية وراثية تعبر عن مراسل فلوري يتحكم فيه عامل نسخ انقسام مستحث للضوء. تنعكس ظروف الإضاءة المختلفة المستخدمة في التجربة من خلال الاختلافات في دورة العمل ، والتي تمثل النسبة المئوية للوقت الذي يكون فيه الضوء مضاء. لوحظ أن مستوى التألق الكلي يتناسب مع دورة عمل التحفيز الضوئي. يعرض الشكل 4B قيم OD700 المقابلة لنفس التجربة. يشير اتساق قراءات الكثافة الضوئية عبر ظروف الإضاءة المختلفة إلى أن التقنية التجريبية لا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعمل بروتوكول Lustro المعروض هنا على أتمتة عمليات الزراعة والإضاءة والقياس ، مما يتيح الفحص عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصرياتالوراثية 6. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج جهاز الإضاءة وقارئ الألواح الدقيقة وجهاز الاهتزاز في محطة عمل الأتمتة. يوضح هذا البروتوكول على وجه التحديد فائدة Lustro لفحص تركيبات البصريات الجينية المختلفة المدمجة في الخميرة S. cerevisiae ومقارنة برامج الحث الضوئي.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تم التأكيد عليها في هذا البروتوكول ضرورية لل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM128873 ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية 2045493 (منحت ل M.N.M.). ميغان نيكول ماكلين ، دكتوراه حاصلة على جائزة مهنية في الواجهة العلمية من صندوق بوروز ويلكوم. تم دعم ZPH من خلال منحة تدريب NHGRI لبرنامج التدريب على علوم الجينوم 5T32HG002760. نحن نقدر المناقشات المثمرة مع أعضاء مختبر ماكلين ، وعلى وجه الخصوص ، نحن ممتنون لكيران سويني لتقديم تعليقات على المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| لوحة سفلية زجاجية 96 جيدا مع # 1.5 غطاء زجاجي | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (شاكر سخان) محطة | عمل QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation | Tecan | ||
| LITOS (جهاز إضاءة بديل) | Hohener, et al. التقارير العلمية. 2022 | ||
| optoPlate-96 (جهاز إضاءة) | Bugaj، et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (قارئ لوحة) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (تطبيق تنبيه المستخدم) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Mat & alpha ؛ ura3 & Delta ؛ 0::5 'تماثل Ura3 ، pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1 ، pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1 ، pGAL1-mScarlet-I-tENO1 ، Ura3 ، Ura 3 'homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5 'تماثل Ura3 ، pRPL18B-Gal4DBD-CRY2 (535) -tENO1 ، pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1 ، pGAL1-mScarlet-I-tENO1 ، Ura3 ، Ura 3 'homology ؛ his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5 'تماثل Ura3 ، pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1 ، pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1 ، pGAL1-mScarlet-I-tENO1 ، Ura3 ، Ura 3 'تماثل ؛ his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80 :: KANMX gal4 :: spHIS5) | Harmer ، et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
المراجع
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Tre....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
