Summary
Bu protokol, mayadaki optogenetik sistemlerin yüksek verimli karakterizasyonunu gerçekleştirmek için otomatik platform Lustró'yu kullanma adımlarını özetlemektedir.
Abstract
Optogenetik, genetik olarak kodlanmış ışığa duyarlı proteinleri kullanarak hücresel davranış üzerinde hassas kontrol sağlar. Bununla birlikte, istenen işlevselliği elde etmek için bu sistemleri optimize etmek, genellikle zaman alıcı ve emek yoğun olabilen birden fazla tasarım-yapı-test döngüsü gerektirir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, ışık stimülasyonunu laboratuvar otomasyonu ile birleştiren, optogenetik sistemlerin verimli yüksek verimli taramasını ve karakterizasyonunu sağlayan bir platform olan Lustro'yu geliştirdik.
Lustró, bir aydınlatma cihazı, bir sallama cihazı ve bir plaka okuyucu ile donatılmış bir otomasyon iş istasyonu kullanır. Lustró, robotik bir kol kullanarak, bu cihazlar arasında bir mikrokuyu plakasının hareketini otomatikleştirerek optogenetik suşların uyarılmasına ve tepkilerinin ölçülmesine olanak tanır. Bu protokol, tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae'de gen ekspresyon kontrolü için optogenetik sistemleri karakterize etmek için Lustro kullanımı hakkında adım adım bir kılavuz sağlar. Protokol, aydınlatma cihazının otomasyon iş istasyonuyla entegrasyonu da dahil olmak üzere Lustro bileşenlerinin kurulumunu kapsar. Ayrıca aydınlatma cihazını, plaka okuyucuyu ve robotu programlamak için ayrıntılı talimatlar sağlayarak deney süreci boyunca sorunsuz çalışma ve veri toplama sağlar.
Introduction
Optogenetik, hücrelerin davranışını yüksek hassasiyetlekontrol etmek için ışığa duyarlı proteinleri kullanan güçlü bir tekniktir 1,2,3. Bununla birlikte, optogenetik yapıların prototiplenmesi ve optimum aydınlatma koşullarının belirlenmesi zaman alıcı olabilirve bu da optogenetik sistemleri optimize etmeyi zorlaştırır 4,5. Optogenetik sistemlerin aktivitesini hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için yüksek verimli yöntemler, yapıların prototiplenmesi ve işlevlerinin keşfedilmesi için tasarım-yapı-test döngüsünü hızlandırabilir.
Lustro platformu, optogenetik sistemlerin yüksek verimli taraması ve karakterizasyonu için tasarlanmış bir laboratuvar otomasyon tekniği olarak geliştirilmiştir. Bir mikroplaka okuyucu, aydınlatma cihazı ve çalkalama cihazını bir otomasyon iş istasyonu6 ile entegre eder. Lutro, mikrokuyu plakalarında (Şekil 1 ve Ek Şekil 1) hücrelerin otomatik kültürlenmesini ve ışık stimülasyonunu birleştirerek, farklı optogenetik sistemlerin hızlı bir şekilde taranmasını ve karşılaştırılmasını sağlar. Lustro platformu son derece uyarlanabilir ve farklı dalga boylarındaki ışığa yanıt verenler de dahil olmak üzere diğer laboratuvar otomasyon robotları, aydınlatma cihazları, plaka okuyucular, hücre tipleri ve optogenetik sistemlerle çalışmak üzere genelleştirilebilir.
Bu protokol, bir optogenetik sistemi karakterize etmek için Lustró'nun kurulumunu ve kullanımını gösterir. Mayadaki bölünmüş transkripsiyon faktörlerinin optogenetik kontrolü, ışık girdileri ile bir floresan raportör genin ekspresyonu olan mScarlet-I7 arasındaki ilişkiyi araştırarak platformun işlevini ve faydasını göstermek için örnek bir sistem olarak kullanılır. Araştırmacılar bu protokolü izleyerek optogenetik sistemlerin optimizasyonunu kolaylaştırabilir ve biyolojik sistemlerin dinamik kontrolü için yeni stratejilerin keşfini hızlandırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan maya suşları Malzeme Tablosunda belgelenmiştir. Bu suşlar, 22 °C ila 30 °C sıcaklık aralığında sağlam bir büyüme sergiler ve çeşitli standart maya ortamlarında yetiştirilebilir.
1. Otomasyon iş istasyonunun kurulması
- Otomatik iş istasyonunu, mikro kuyu plakalarını hareket ettirebilen bir Robotik Tutucu Kol (RGA, Malzeme Tablosuna bakın) ile donatın (Şekil 1).
- RGA erişimi sağlayan otomatik bir plaka kilitleme mekanizmasına sahip otomatik iş istasyonuna (Şekil 1(1)) bir mikroplaka ısıtıcı çalkalayıcı (Malzeme Tablosuna bakın) takın.
- RGA erişilebilirliğini sağlamak için otomatik iş istasyonunun yanına bir mikroplaka okuyucu yerleştirin (Şekil 1(2)).
- Uygun RGA erişimi sağlayan bir mikroplaka aydınlatma cihazı (Şekil 1(3)) ekleyin. Örnekler arasında optoPlate8 (bu çalışmada kullanıldığı gibi) veya LITOS9 (bkz.
2. Aydınlatma cihazının hazırlanması
- Yerleşik yöntemleri izleyerek optoPlate'i (veya alternatif aydınlatma cihazını)oluşturun ve kalibre edin 8,10,11.
- RGA erişimini etkinleştirmek için aydınlatma cihazında bir adaptör kullanın.
- optoPlate'i bir elektronik tablo girişi10 veya bir grafik arayüz12 kullanarak programlayın. Işık stimülasyon programlarını yürütmek için 3. adımı izleyin.
3. Bir ışık stimülasyon programı tasarlama
- Deney için istenen ışık koşullarını belirleyin.
- Işık yoğunluğu, ışık başlangıç zamanı, darbe uzunluğu, darbe sayısı ve darbeler arası süre dahil olmak üzere istenen ışık koşullarını bir elektronik tabloya girin.
NOT: GitHub deposunda sağlanan talimatları kullanarak bu bilgileri optoPlate'e aktarın: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Unutmayın.ampmikroplaka okuyucuda veya ısıtıcı çalkalayıcıdayken plaka aydınlatılmayacaktır. Bu olayların süresi ve sıklığı, belirli deneysel gereksinimlere göre optimizasyon gerektirebilir. - Uygun arka plan ölçümlerini sağlamak için her suş için karanlık koşulları dahil edin.
- Dönüştürücü işlevselliğini değerlendirmek için ilk karakterizasyon deneyleri için yüksek bir ışık yoğunluğu kullanın.
NOT: Aşırı ışık maya13 için fototoksik olabileceğinden, ışık yoğunluğu daha hassas deneyler için optimize edilmelidir.
4. Mikroplaka okuyucunun hazırlanması
- Mikroplaka okuyucuyu, deney yapmadan önce istenen ilgi miktarını ölçecek şekilde yapılandırın.
NOT: Bu örnekte, mikroplaka okuyucu, ilgilenilen suş tarafından ifade edilen bir raportörden gelen floresansı ölçmek üzere yapılandırılmıştır. Lüminesans veya optik yoğunluk gibi diğer çıkışlar, deneysel gereksinimlere bağlı olarak kullanılabilir. - İlgilenilen suşu (floresan olmayan bir kontrolle birlikte) sentetik tam (SC) ortamda( veya başka bir düşük floresan ortamda) (bkz. Malzeme Tablosu) ölçülecek en yüksek hücre yoğunluğuna kadar geliştirin. Kültürleri cam tabanlı siyah duvarlı bir mikrokuyu plakasına aktarın (Malzeme Tablosuna bakın) ve en uygun mikroplaka okuyucu ayarlarını belirlemek için bunları ölçün.
NOT: Plaka boyutlarını doğru girerek ve plakayı aşağıdan ölçerek doğru okumalar sağlayın. - Hedef floresan protein15 için yaklaşık absorpsiyon ve emisyon spektrumları elde etmek için bir floresan protein veritabanına (örneğin, fpbase.org) bakın.
- Floresan ve floresan olmayan suşları içeren kuyucuklarda bir z-taraması gerçekleştirerek z-değerini (plaka ile okuyucu arasındaki mesafe) belirleyin. En yüksek sinyal-gürültü oranını veren z değerini seçin.
- Optimum sinyal-gürültü oranını belirlemek için floresan ve floresan olmayan suşlar üzerinde absorpsiyon ve emisyon taramaları yaparak absorpsiyon ve emisyon spektrumlarını optimize edin.
- Floresan gerilimini, kazanç optimum seviyeye ayarlanmışken ölçün ve taşma ölçüm hatasına neden olmadan kullanılabilecek en yüksek optik kazancı belirleyin.
NOT: Bu optik kazanç, sonuçların tutarlılığını sağlamak için aynı suşu içeren deneylerde tutarlı bir şekilde manuel olarak ayarlanmalıdır. - Mikroplaka okuyucu yazılımında bir ölçüm komut dosyası hazırlayın (bkz. Şekil 2). Bu komut dosyası, cihazı kültürlerin optik yoğunluğunu ve ölçülecek herhangi bir floresan proteinin floresan spektrumlarını ölçecek şekilde yapılandırır.
NOT: Kırmızı floresan proteinleri ifade etmedikçe, suşların optik yoğunluğunu 600 nm'de ölçün. Kırmızı floresan proteinleri eksprese eden suşlar için, önyargı16'yı önlemek için optik yoğunluğu 700 nm'de ölçün. - Ölçümler sırasında 30 °C'lik bir iç inkübasyon sıcaklığını korumak için ölçüm komut dosyasını ayarlayın.
- Tercihe göre verileri bir elektronik tabloya veya ASCII dosyalarına dışa aktarmak için ölçüm kodunu yapılandırın.
5. Robotun programlanması
- Otomatik iş istasyonu yazılımındaki çalışma masası tanımını, taşıyıcıların (örneğin, ısıtıcı çalkalayıcılar, yuva platformları, aydınlatma cihazları) ve laboratuvar gereçlerinin (örneğin, 96 kuyulu plaka) fiziksel düzenine göre yapılandırın (bkz. Aşağıdaki adımları izleyerek ışık indüksiyonu ve ölçümleri yürütmek için otomasyon iş istasyonu yazılımında bir komut dosyası oluşturun (Şekil 3).
- Optogenetik sistemlerin arka planda aktivasyonunu önlemek için dahili aydınlatma kaynaklarını devre dışı bırakın.
- Isıtıcı çalkalayıcıyı 30 °C'lik bir sıcaklığı koruyacak şekilde ayarlayın. Plaka, ısıtıcı çalkalayıcı üzerinde olmadığında, ortam sıcaklığında (22 °C) olacaktır.
- Hücreleri düzenli aralıklarla indükleme ve ölçme adımlarını tekrarlamak için döngüler, bir zamanlayıcı ve bir döngü sayma değişkeni kullanın.
- Ölçümleri kaydetmeden önce, tüm hücrelerin uygun şekilde askıya alınmasını sağlamak için numune plakasını sallayın. 2 mm'lik bir orbital ile 1.000 rpm'de 60 s'lik bir sarsıntı, S288C S. cerevisiae hücrelerini yeniden süspanse etmek ve ölçüm yanlılığını önlemek için genellikle yeterlidir.
- Optik yoğunluk ölçümünde sapmayı önlemek için robot kolunu kullanarak numune plakasını mikroplaka okuyucuya taşıyın ve kapağı (varsa) çıkarın. Mikroplaka okuyucu taşıyıcı tanımı kapaklara izin vermeyecek şekilde ayarlanmışsa, kontrol yazılımı kapağı otomatik olarak çıkaracak ve belirlenen konuma getirecektir.
- Mikroplaka okuyucu ölçüm komut dosyasını 4. adımda açıklandığı gibi yürütün.
- Numune plakasındaki kapağı değiştirin ve robot kolunu kullanarak plakayı aydınlatma cihazına taşıyın.
- Komut dosyasını, zamanlayıcı belirtilen zaman aralığına ulaşana kadar bekleyecek şekilde ayarlayın (örneğin, 30 dakika döngü sayma değişkeniyle çarpılır) ve ardından istenen sayıda yineleme için tüm döngüyü tekrarlayın (örneğin, 24 saatlik bir deneme için 48 kez).
- Olası hataları giderin ve taşıyıcı ve laboratuvar yazılımı tanımlarının düzgün çalışmasını sağlayın ve ayrıca RGA'nın boş bir plakayı komut dosyası döngüsünden birden çok kez geçirerek plakayı doğru bir şekilde alıp yerleştirme yeteneğini sağlayın.
- Protokolün yürütülmesi sırasında meydana gelebilecek herhangi bir cihaz durumu değişikliğini veya hatasını kullanıcıya bildirmek için kullanıcı uyarılarını yapılandırın.
6. Numune plakasının ayarlanması
- Maya suşlarını YPD agar17 gibi zengin ortam plakalarında büyütün (bkz. Floresan olmayan (negatif) bir kontrol ekleyin.
- Plakalardan kolonileri seçin ve bunları cam kültür tüplerinde 3 mL SC ortamı14'e (veya LFM18 gibi başka bir düşük floresan ortamına) aşılayın. Kültürleri gece boyunca 30 °C'de bir silindir tambur üzerinde inkübe ederken, karanlıkta veya yanıt vermeyen ışık koşullarında (örneğin, mavi ışığa duyarlı sistemler için kırmızı ışık) tutun.
- Her kültürün 200 μL'sini 1 mL SC ortamına seyrelterek ve bir spektrofotometre veya mikroplaka okuyucu kullanarak optik yoğunluğu 600 nm'de (OD600) kaydederek gece kültürlerinin optik yoğunluğunu ölçün.
- Her gece kültürünü, cam kültür tüplerinde 0.1'lik bir OD600'e seyreltin. Daha yüksek verimli gerinim testi için, mikro kuyu plakalarında otomatik seyreltmeler gerçekleştirin.
- Seyreltilmiş kültürleri 96 oyuklu plakaya pipetleyin. Teknik varyasyonu hesaba katmak için her koşul için üçlü kuyucukları (yani, aynı gerinim ve ışık koşuluna sahip üç özdeş kuyu) dahil edin. Arka plan floresansını ve optik yoğunluğu ölçmek için negatif kontroller olarak boş ortam ve floresan olmayan hücreler içeren kuyuları dahil edin.
- Işık indüksiyonu deneyine başlamadan önce plakayı 30 °C'de 5 saat çalkalayarak inkübe edin. Belirli suşlar ve deneysel koşullar için optimize etmek için seyreltme miktarlarını ve inkübasyon sürelerini gerektiği gibi ayarlayın.
7. Deneyin gerçekleştirilmesi
- S'yi yerleştirinampısıtıcı çalkalayıcıya plaka ve 5. adımda belirtildiği gibi otomasyon komut dosyasını başlatın.
- Plaka okuyucudaki ilk ölçüm kaydedildikten sonra 3. adımda açıklandığı gibi ışık stimülasyon programını başlatın.
- Otomasyon iş istasyonu karanlık bir odada değilse, arka plan aydınlatmasını önlemek için bir karartma perdesi ile örtün.
8. Veri analizi
- Deney için 96 kuyulu plakanın 8 x 12 düzenini yansıtan bir elektronik tablo haritası oluşturun. Haritanın, bir ızgarada ölçülen gerinimlerin adlarını ve başka bir ızgarada kullanılan ışık koşullarının açıklamalarını içerdiğinden emin olun.
- Dışa aktarılan verileri analiz etmek için bir Python betiği veya tercih edilen başka bir programlama dili kullanın. Harita elektronik tablosunu, gerinim adlarını ve koşul adlarını plakanın her bir kuyucuğuyla ilişkilendirerek bir diziye aktarın.
NOT: Analiz için örnek kod şu adreste bulunabilir: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternatif olarak, çeşitli plaka okuyuculardan gelen verileri ayrıştırmak için bir uygulama kullanılabilir19. - Dışa aktarılan deneme elektronik tablosundaki verileri başka bir diziye okuyun.
- Şekil 4'te gösterildiği gibi, zaman içinde her bir gerinim ve koşul için optik yoğunluk değerlerinin ve floresan değerlerinin grafiklerini oluşturun.
- Kültürlerde üstel büyüme veya doygunluk aşamalarını belirlemek için optik yoğunluk grafiklerini inceleyin. Bu bilgi, Şekil 5'te gösterildiği gibi, suşlar veya koşullar arasındaki floresan ölçümlerini karşılaştırmak için uygun zaman noktalarının seçilmesine yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 4A , ışıkla indüklenebilir bir bölünmüş transkripsiyon faktörü tarafından kontrol edilen bir floresan raportörü eksprese eden bir optogenetik suş için zaman içindeki floresan değerlerini göstermektedir. Deneyde kullanılan farklı ışık koşulları, ışığın açık olduğu sürenin yüzdesini temsil eden görev döngüsündeki değişikliklerle yansıtılır. Genel floresan seviyesinin, ışık stimülasyonunun görev döngüsü ile orantılı olduğu gözlemlenir. Şekil 4B , aynı deney için karşılık gelen OD700 değerlerini gösterir. Optik yoğunluk okumalarının farklı ışık koşullarındaki tutarlılığı, deneysel tekniğin değişen ışık koşulları altında suşların büyüme hızını önemli ölçüde etkilemediğini göstermektedir.
Zaman içinde floresan ve optik yoğunluğu ölçerek, optogenetik sistemlerin farklı ışık stimülasyon programlarına nasıl tepki verdiğine dair daha derin bir anlayış, yalnızca tek bir zaman noktasında çıktı yakalayan tekniklere kıyasla elde edilebilir. Bu zaman seyri verileri, farklı suşları ve koşulları karşılaştırmak için belirli zaman noktalarını seçmek için değerlidir. Şekil 5 , farklı ışık stimülasyon programları tarafından indüklenen iki farklı optogenetik suş için tek bir zaman noktasını (ışık indüksiyonunda 10 saatte ölçülen) göstermektedir. Her iki suş da bir floresan raportörün ekspresyonunu yönlendirmek için ışıkla indüklenebilir bir bölünmüş transkripsiyon faktörü kullanır. Işık darbesi yoğunluğu, periyodu ve görev döngüsündeki değişiklikler, bu suşlarda farklı tepkiler ortaya çıkarır.
Şekil 1: Çalışma masası düzeni ve deneysel iş akışı. Numune plakasının Lustro'daki hareketini gösteren örnek bir çalışma masası düzeninin ekran görüntüsü. Plaka, robotik kol tarafından bir ısıtıcı çalkalayıcıdan (1) mikroplaka okuyucuya (2) ve ardından aydınlatma cihazına (3) hareket ettirilir. Fotoğraflar Ek Şekil 1'de verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Plaka okuyucu ölçüm komut dosyası. Mikroplaka okuyucuyu 30 °C'de inkübe edecek ve floresan ve optik yoğunluk ölçümlerini kaydedecek şekilde ayarlayan bir plaka okuyucu komut dosyasının örnek ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Otomatik iş istasyonu komut dosyası. Lustro için otomatik bir iş istasyonu komut dosyasının örnek ekran görüntüsü. Komut dosyası bir zamanlayıcı başlatır, iç ışığın kapatılmasını sağlar, bir döngü sayma değişkenini başlangıç değeri olan 0'a ayarlar ve ısıtıcı çalkalayıcıyı 30 °C'de inkübe edecek şekilde ayarlar. Her döngüde plaka kilitlenir, 1 dakika çalkalanır, plaka okuyucuya taşınır, ölçülür, ardından aydınlatma cihazına taşınır ve robot 30 dakikalık döngü aralığının geri kalanını bekleyecek şekilde ayarlanır. Bu sürenin sonunda döngü sayaç değişkeni bir artırılır ve döngü tekrarlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İndüksiyon süresi seyri. Bir pGAL4-mScarlet-I raportörü (yMM41) ile bir Gal1BD-eMagA/eMagB-Gal6AD bölünmüş transkripsiyon faktörü suşundan örnek ışık indüksiyon süresi seyri verileri. mScarlet-I7'nin floresansı, 563 nm uyarma ve 606 nm emisyonda 130 optik kazançla ölçülür. Işık yoğunluğu 125 μW/cm2'dir ve hata çubukları üçlü numunelerin standart hatasını temsil eder. Dikey kırmızı noktalı çizgi, kültürlerin doygunluğa ne zaman ulaştığını gösterir. (A) Zaman içinde gerinimden kaynaklanan floresan değerleri. Işık desenleri (belirtildiği gibi) gösterilen deneyin tüm süresi boyunca tekrarlandı. Ek, ışık darbe sürelerinin, araştırma boyunca tekrarlanan karanlık darbe süreleri ile serpiştirildiğini göstermektedir. (B) (A)'da gösterilen deney için optik yoğunluk (700 nm'de ölçülmüştür) değerleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Farklı optogenetik sistemlerin karşılaştırılması. CRY2(535)/CIB1 ve eMagA/eMagBM bölünmüş transkripsiyon faktörü suşları arasındaki farklı ışık indüksiyon programlarının pGAL1-mScarlet-I raportörleri (sırasıyla yMM1763 ve yMM17656) ile karşılaştırılması. mScarlet-I7'nin floresansı, 563 nm uyarma ve 606 nm emisyonda 130 optik kazançla ölçülür. Kullanılan ışık yoğunluğu, aksi belirtilmedikçe 125 μW/cm2'dir. Hata çubukları, üçlü örneklerin standart hatasını temsil eder (nokta olarak gösterilir). Gösterilen floresan değerleri indüksiyondan 10 saat sonra kaydedildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Lustro'da kullanılan cihazların temsili görüntüleri. Lustro kurulumunun resmi ve kullanılan cihazların yakınlaştırılmış görüntüleri. Robotik kol, numune plakasını ısıtıcı çalkalayıcıdan plaka okuyucuya ve ardından deney boyunca bir döngü içinde aydınlatma cihazına hareket ettirir. Bileşenler, yan tarafta bir gösterge ile numaralandırılmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan Lustro protokolü, kültürleme, aydınlatma ve ölçüm süreçlerini otomatikleştirerek optogenetik sistemlerin yüksek verimli taranmasını ve karakterizasyonunu sağlar6. Bu, bir aydınlatma cihazı, mikroplaka okuyucu ve çalkalama cihazının bir otomasyon iş istasyonuna entegre edilmesiyle elde edilir. Bu protokol, özellikle Lustro'nun maya S. cerevisiae'ye entegre edilmiş farklı optogenetik yapıları taramak ve ışık indüksiyon programlarını karşılaştırmak için kullanışlılığını göstermektedir.
Bu protokolde vurgulanan birkaç önemli adım, Lustro'nun etkin kullanımı için gereklidir. İncelenen optogenetik yapının kinetiği ile uyumlu özelleştirilmiş ışık programlarının dikkatli bir şekilde tasarlanması gereklidir. Ek olarak, güvenilir ölçümler elde etmek için plaka okuyucunun hassas kalibrasyonu çok önemlidir. Işık programlarıyla uygun senkronizasyonu sağlamak için gerekli ayarlamalar da dahil olmak üzere robot üzerindeki deneylerin kapsamlı bir şekilde kuru çalıştırılması, komut dosyasının sorunsuz çalışmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir.
Burada verilen örnek protokol, çeşitli ışık stimülasyon koşulları altında bir floresan raportörün ekspresyonunu floresan olmayan bir kontrole yönlendiren ışıkla indüklenebilir bir bölünmüş transkripsiyon faktörünün karşılaştırılmasını açıklar. Floresan ölçümleri, plakadaki her bir oyuktan 30 dakikalık aralıklarla alınır ve ölçümden önce ısıtıcı çalkalayıcıda 1 dakika çalkalanır. Bu protokolde gösterildiği gibi, Lustró, bakteriler ve diğer mayalar dahil olmak üzere yapışık olmayan hücre tiplerine entegre edilmiş mavi ışığa duyarlı optogenetik sistemlerle kullanım için uygundur. Bununla birlikte, küçük değişikliklerle, protokol farklı hücre tiplerine, optogenetik sistemlere ve deneysel tasarımlara kolayca genişletilebilir. Plaka okuyucu ayarlarında yapılan ayarlamalar, biyolüminesans gibi floresan dışındaki çıkışların ölçülmesine izin verecektir. Daha ince zamansal çözünürlük gerektiren uygulamalar için ölçümler daha sık yapılabilir. Isıtıcı çalkalayıcı üzerindeki inkübasyon, çalkalama ve sıcaklık kontrolü gerektiren belirli hücre tipleri için kritik olduğunda daha sık tekrarlanabilir. Kuluçkadaki bir otel gibi gaz ve çevre kontrolünün dahil edilmesi, memeli hücre hatlarının dahil edilmesini sağlayacaktır. Burada açıklanan Lustro yinelemesi özel enstrümantasyon kullanırken, Lustro platformu diğer laboratuvar otomasyon robotları veya mikroplaka okuyucuları ile çalışmak üzere kolayca uyarlanabilir. LPA20 veya LITOS9 gibi aydınlatma cihazları, farklı optogenetik sistemleri uyarmak için optoPlate'in yerini alabilir. Lustro platformunun gelecekteki bir modifikasyonu, sürekli kültür uygulamaları için otomatik seyreltmeleri kolaylaştırmak için sıvı işlemenin dahil edilmesini içerebilir. Bu aynı zamanda LustrO'nun, gerçek zamanlı ölçümlerin istenen bir yanıtı elde etmek veya sürdürmek için ışık veya kültür koşullarındaki değişiklikleri bildirdiği sibergenetik geri bildirim kontrolüne uyarlanmasını sağlayacaktır 5,21,22.
Yüksek verimli teknikler, optogenetik sistemlerin dinamik doğasını optimize etmek ve kullanmak için çok önemlidir. Lustró, mevcut protokollerin birçok sınırlamasının üstesinden gelir. Örneğin, biyoreaktör tabanlı optogenetik teknikler sürekli okuma ve kültürleme koşullarını mümkün kılarken, düşük verimden muzdariptir23,24,25,26. optoPlateReader27 cihazı, mikrokuyu plakalarında gerçek zamanlı optogenetik deneyler için umut vaat ediyor, ancak şu anda güvenilir sonuçlar elde etmek için çok sayıda kopyaya ihtiyaç duyulması nedeniyle düşük verime sahip ve sürekli kültüre erişim sağlamıyor. Öte yandan Lustro, dinamik aktivitelerini karakterize etmek için optogenetik sistemlerin yüksek verimli taranmasını sağlar. Bununla birlikte, Lustro protokolünde bazı sınırlamalar vardır. Lutro'daki aralıklı çalkalama, maya hücreleri6 için küçük bir büyüme gecikmesine neden olur, ancak bu, çalkalamayı içerecek şekilde bir aydınlatma cihazının uyarlanmasıyla ele alınabilir. Lustro sisteminin bir diğer sınırlaması, numune plakasının aydınlatma cihazı üzerindeyken inkübe edilmemesi ve ortam sıcaklığında (22 °C) tutulmasıdır. Her numunenin küçük hacmi yüksek verimli ekranlara izin verse de, biyoüretim veya diğer uygulamalar için daha büyük reaksiyon hacimlerine ölçeklendirilirken aydınlatma adımlarının ek optimizasyonu gerekli olabilir28,29.
Genel olarak, Lustró, yüksek verimli tarama ve hassas ışık kontrolü yoluyla optogenetik sistemlerin hızlı bir şekilde geliştirilmesini ve test edilmesini kolaylaştırır. Bu otomatik yaklaşım, çeşitli indüksiyon koşulları altında farklı optogenetik yapıların verimli bir şekilde karakterizasyonunu ve karşılaştırılmasını sağlayarak, bu sistemlerin daha hızlı yinelenmesine ve iyileştirilmesine yol açar. Farklı hücre tiplerine, optogenetik araçlara ve otomasyon kurulumlarına uyarlanabilirliği ile Lustró, optogenetik alanındaki ilerlemelerin önünü açarak, dinamik gen ekspresyon kontrolünün keşfedilmesini kolaylaştırır ve biyolojik ağları incelemek ve hücresel davranış mühendisliği yapmak için olanakları genişletir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe R35GM128873 ve Ulusal Bilim Vakfı hibe 2045493 (M.N.M.'ye verildi) tarafından desteklenmiştir. Megan Nicole McClean, Ph.D. Burroughs Wellcome Fund'dan Scientific Interface'de Kariyer Ödülü'ne sahiptir. Z.P.H., Genomik Bilimler Eğitim Programı 5T32HG002760'a NHGRI eğitim bursu ile desteklenmiştir. McClean laboratuvar üyeleriyle yapılan verimli tartışmaları kabul ediyoruz ve özellikle makale hakkında yorum yaptığı için Kieran Sweeney'e minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
- Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
