Summary
Detta protokoll visar mikroskopstyrd isolering och immunofluorescensfärgning av murina lungvener. Vi förbereder vävnadsprover som innehåller vänster förmak, lungvener och motsvarande lungor och färgar dem för hjärttroponin T och Connexin 43.
Abstract
Lungvener (PV) är den största källan till ektopiska slag vid förmaksarytmier och spelar en avgörande roll i utvecklingen och progressionen av förmaksflimmer (AF). PV innehåller myokardhylsor (MS) som består av kardiomyocyter. MS är inblandade i initiering och underhåll av AF, eftersom de bevarar likheter med hjärtarbetande myokardiet, inklusive förmågan att generera ektopiska elektriska impulser. Gnagare används i stor utsträckning och kan utgöra utmärkta djurmodeller för att studera lungvenens myokardium eftersom kardiomyocyter finns i stor utsträckning över hela kärlväggen. Exakt mikrodissektion och beredning av murina PV är dock utmanande på grund av den lilla organstorleken och den intrikata anatomin.
Vi demonstrerar ett mikroskopistyrt mikrodissektionsprotokoll för att isolera murint vänster förmak (LA) tillsammans med PV. Immunofluorescensfärgning med hjälp av hjärt-Troponin-T (cTNT) och connexin 43 (Cx43) antikroppar utförs för att visualisera LA och PV i full längd. Bildbehandling vid 10x och 40x förstoring ger en heltäckande bild av PV-strukturen samt detaljerade insikter i myokardarkitekturen, särskilt genom att belysa förekomsten av connexin 43 inom MS.
Introduction
Förmaksflimmer (AF) är den vanligaste ihållande arytmin1. Prevalensen av förmaksflimmer ökar ytterligare med ett förväntat antal på ~17,9 miljoner patienter i Europa år 20601. Förmaksflimmer är kliniskt mycket viktigt eftersom det är en viktig riskfaktor för utveckling av hjärtinfarkt, hjärtsvikt eller stroke, vilket resulterar i en enorm individuell, social och socioekonomisk börda1. Trots att förmaksflimmer har varit känt i årtionden är patofysiologin bakom förmaksflimmer fortfarande intehelt klarlagd.
Redan i slutet av 1990-talet visade studier den stora effekten av lungvener (PV) för att initiera och upprätthålla AF, eftersom de är den huvudsakliga källan till AF-utlösande ektopiska slag3. Det har visat sig att PV strukturellt skiljer sig från andra blodkärl. Medan typiska blodkärl innehåller glatta muskelceller, innehåller PV:s tunica media också kardiomyocyter4. Hos gnagare är denna hjärtmuskulatur allestädes närvarande i hela PV, inklusive intra- och extrapulmonella delar, såväl som öppningsområdet5. Hos människa innehåller PV också kardiomyocyter, som kan observeras i förlängningar av vänster förmak (LA) myokardium, så kallade myokardhylsor (MS)6,7.
MS har morfologiska likheter med förmaksmyokardiet8. Formen och storleken på förmaks- och PV-kardiomyocyter varierar inte signifikant mellan varandra och uppvisar jämförbara elektrofysiologiska egenskaper8. Elektrofysiologiska registreringar i PV har bevisat den elektriska aktiviteten hos MS, och angiografisk avbildning har avslöjat sammandragningar synkroniserade med hjärtslagen 9,10.
Gap junctions är porbildande proteinkomplex som består av sex connexin-subenheter, som tillåter passage av joner och små molekyler11. Gap-övergångar finns i cell-till-cell-appositionerna, kopplar samman närliggande kardiomyocyter och möjliggör en intercellulär elektrisk koppling mellan kardiomyocyter12,13. Flera konnexinisoformer uttrycks i hjärtat med connexin 43 (Cx43) som den vanligaste isoformen som uttrycks i alla regioner i hjärtat14. Tidigare studier ger belägg för uttrycket av Cx43 i kardiomyocyter av PV15,16.
Det är fortfarande utmanande att undersöka MS i intakta PV på grund av deras känsliga struktur, särskilt i smådjursmodeller. Här visar vi hur man kan identifiera och isolera PV tillsammans med LA och lunglober hos möss med hjälp av mikroskopistyrd mikrodissektion. Dessutom demonstrerar vi immunofluorescens (IF) färgning av PV för att visualisera kardiomyocyter och deras sammankopplingar inom PVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård och alla experimentella procedurer utfördes enligt riktlinjerna från Animal Care and Ethics Committee vid Ludwig-Maximilians-universitetet i München, och alla procedurer med möss godkändes av Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). C57BL6/N-möss erhölls kommersiellt.
1. Förberedelse
- Bered en 3 % agarosgel genom att blanda 3 mg agaros och 100 ml 1x Tris-buffrad koksaltlösning i en 500 ml Erlenmeyerkolv. Värm lösningen i mikrovågsugn på 600 W i 2-3 minuter tills gelen blir homogen.
- Förbered dissektionsskålen genom att försiktigt hälla gelen i en petriskål med en diameter på 100 mm. Fyll petriskålen till hälften med gel. Rensa bubblor från gelen för att säkerställa en homogen konsistens. Låt dissektionsskålen svalna tills gelen stelnar.
- Förbered alla buffertar och lösningar som behövs, inklusive fixeringslösning, permeabiliseringslösning, blockeringsbuffert och tvättbuffert enligt recepten i tabell 1.
2. Organskörd och vävnadsberedning
OBS: Ett omfattande protokoll som beskriver proceduren för musanestesi och skörd av hjärtat har tidigare publicerats17,18. Vi ger därför endast en kort beskrivning av den delen. Experiment utfördes på 12 till 16 veckor gamla C57BL6-möss (sex hanar, fyra honor). Hanens kroppsvikt ökade från 26 g till 28 g och honans kroppsvikt från 19 g till 22 g. Följande steg utfördes utan föregående systemisk heparininjektion.
- Bedöva musen med isofluran (5%, 95% syre, Flöde: 1 L/min) och se till att det finns tillräckligt med anestesidjup.
- Överför musen till operationsbordet och placera den i ryggläge. Upprätthåll narkosen med isofluraninhalation (2%, 98% syrgas, Flöde: 1 L/min) genom en narkosmask och fixera musen med tejp i dess extremiteter. Injicera fentanyl mot analgesi (0,1 mg/25 g kroppsvikt i.p.).
- Lyft pälsen vid den xiphoidala processen och ställ in ett tvärgående snitt på 2 mm. Koppla bort pälsen från den subkutana fascian med trubbig dissektion (baksidan av saxen) och förläng snittet kraniellt och lateralt för att exponera bröstkorgen.
- Öppna försiktigt bukens svans till kustbågen. Lyft den xiphoidala processen något för att skära diafragman från svansen och få lungorna att kollapsa. Skär sedan diafragman från vänster till höger utan att skada några organ och öppna bröstkorgen bilateralt för att exponera hjärtat.
- Skär av den nedre hålvenen (IVC) medan hjärtat fortfarande slår för att utrota musen och fortsätt att perfundera hjärtat genom att penetrera vänster kammare med en 27 G nål och injicera 10 ml iskall 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Efter att ha rensat blodet från mushjärtat, lokalisera aortabågen, övre hålvenen (SVC) och luftstrupen. Skär dem ~3 mm ovanför hjärtbasen och skörda hjärtat tillsammans med de anslutna lungorna.
- Sänk ner de skördade organen i ett 10 ml koniskt rör som innehåller 2 ml steriliserad 30 % sackaroslösning. Låt proverna torka i 24 timmar vid 4 °C.
3. Mikroskopistyrd beredning av LA och PV
- Placera det uttorkade hjärtat och lungorna i en dissektionsskål som innehåller 40-50 ml 1x PBS. Lägg den under ett ljusfältsmikroskop med 10x förstoring och ställ in belysningen. Placera hjärtat med dess ryggyta på dissektionsskålen. Identifiera övergången mellan ventrikeln och förmaksväggen och separera försiktigt kamrarna från förmaken med hjälp av en kirurgisk sax.
OBS: Skär cirka 1 mm nedanför förmaken för att behålla viss kammarvävnad. Detta kommer att behövas senare för att fästa förmaken vid dissektionskålen utan att skada strukturerna vid hjärtbasen. Vi föreslår att du behåller kamrarna eftersom de kan användas som ett positivt kontrollprov. För att bädda in ventrikelvävnaden, följ samma procedur som beskrivs för inbäddning av PV, som beskrivs i avsnitt 4. - Placera de separerade förmaken med den ventrikulära skärytan (steg 3.1) på dissektionsskålen så att hjärtbasen är vänd uppåt. Orientera förmaken så att lungloberna är posterior, LA och vänster förmaksbihang (LAA) är till höger och höger förmak (RA) och höger förmaksbihang (RAA) är till vänster. Fixera preparatet genom att fästa den återstående vänstra kammarvävnaden på dissektionsskålen. Sprid försiktigt ut lungloberna utan att använda överdriven kraft och fäst dem på dissektionsskålen (Figur 1A).
- Få en översikt över de anatomiska landmärkena vid hjärtbasen.
- Hitta aortan med aortabågen i mitten av hjärtbasen.
- Detektera lungstammen (PT) direkt till höger om aortan och följ dess kurs mot den bakre för att urskilja lungartärerna (PA). Kontrollera deras läge genom att följa deras kurs upp till vänster lob och höger över/mellersta lob för att hitta motsvarande lunghilum (LH).
- Bestäm positionen för luftstrupen och/eller vänster och höger huvudbronker (L Br, R Br), som är belägna bakom aortan, och kontrollera deras läge genom att följa deras kurs mot LH (Figur 1A).
- Hitta SVC till vänster om aortan och verifiera genom att följa dess kurs in i RA bredvid RAA.
- Ta bort bindväv och fettvävnad runt hjärtbasen samtidigt som du bevarar alla identifierade landmärken som nämns ovan. Ta dessutom bort aortabågen och luftstrupen för att få fri sikt över hjärtbasen (Figur 1B).
- Separera försiktigt PA från den övre ytan av förmaket genom trubbig dissektion med en fin pincett. Skär sedan av dem vid LH och vänd dem åt sidan för att exponera den vänstra förmaksfria väggen (LAFW) och PV:erna i sin fulla dimension. Skär av huvudbronkerna från LH och ta bort bronkialvävnaden (Figur 1C).
OBS: LH fungerar både som den gemensamma ingångspunkten för PA och luftvägar in i lungorna, såväl som utgångspunkten för PV. Det är viktigt att utföra varje procedur på LH noggrant för att undvika skador på PV:erna. - För att separera LA/RA och vänster och höger kammare (LV, RV), utför ett snitt från den främre delen av den återstående RV uppåt genom trikuspidalklaffen (TV) till den främre sidan av SVC för att öppna RA från den främre sidan. Skär den bakre RA-fria väggen (RAFW) bredvid interatriell septum för att separera RA och LA. Skär av den bakre högra kammarväggen bredvid den interventrikulära skiljeväggen för att helt skära av LV och RV.
OBS: Ett omfattande protokoll som beskriver proceduren för förberedelse och isolering av höger förmak i detalj har publiceratstidigare 19. Separationen av RA är användbar för att avlägsna oönskad vävnad från LA-PV-vävnadskomplexet och för att samla in vävnad för ytterligare experiment. - Minska storleken på lungloberna genom att skära bort en del av den basala lungvävnaden så att ca 3-4 mm lungvävnad blir över.
OBS: Bevara lunglobernas spetsar eftersom de fungerar som flottörer under de efterföljande inbäddningsstegen och tillåter inbäddning av PV:erna horisontellt i OCT-föreningen.
4. Inbäddning av vävnad
- Överför preparatet, inklusive LA och PV, till en kryomold, se till att hjärtbasen och lungspetsen är vända uppåt. Ordna dem i en fysiologisk konfiguration - se till att PV:erna inte vrids eller vänds.
- Fyll kryomolden med OCT-förening och komprimera försiktigt PV:erna med en fin pincett för att ta bort eventuell kvarvarande luft. Bibehåll deras fysiologiska konfiguration oförändrad under hela processen.
- Lägg kryomolden med den inbäddade vävnaden på torris för att frysa OCT-föreningen. Förvara proverna vid -80 °C för framtida bruk.
OBS: Det är viktigt att hålla PV:erna i horisontellt läge för att säkerställa att man får sektioner som innehåller PV:er i full längd för efterföljande procedurer.
5. Tillskärning och uppsamling av frysta vävnadssnitt
OBS: För att skära vävnadsblocken justerades maskininställningarna till en provtemperatur på -18 °C och bladtemperatur på -25 °C.
- Installera ett vävnadsblock på provhållaren genom att applicera ett lager av OCT-förening mellan vävnadsblocket och provhållaren. Frys in dem i 3-4 min.
- Blockera provhuvudet och ladda provhållaren med vävnadsblocket på provhuvudet genom att stänga provchuckens frigöringsspak. Finjustera vävnadsblockets position med hjälp av finjusteringsrattarna.
- Ta bort kryomolden från provet. Avblockera provhuvudet och kryostatens elektriska broms.
- Ställ in kryostaten på trimläge med en trimstorlek mellan 30 μm och 50 μm. Trimma vävnadsprovet tills PV:erna blir synliga.
- Växla till finsnittsläget och ställ in tjockleken på 10 μm. Börja samla in sektioner, inklusive PV och ansluten lung- och förmaksvävnad. Samla sektioner med hjälp av en krängningsplatta eller genom att fästa den fria änden av varje sektion på bladhållaren med en fin kall borste och sprid ut dem.
- Placera en bild (förvaras i rumstemperatur) intill sektionen. Lossa försiktigt sektionen från borsten, så att sektionen naturligt kan fästa vid objektglaset, eftersom den frusna sektionen och OCT-föreningen smälter vid beröring av den varmare glidytan.
OBS: Upprätthåll ett stabilt och skonsamt tillstånd under sektioneringsprocessen för att förhindra brott eller veck i sektionerna. Byt ut bladet mot ett nytt blad vid behov. - Samla upp till tre sektioner på varje bild. Märk objektglasen och förvara dem vid -20 °C.
OBS: Vi rekommenderar att du samlar in minst fem sektioner (motsvarande två bilder) för varje PV.
6. Immunofluorescensfärgning av kryosektioner från PV
- Ordna de frusna objektglasen på ett färgningssystem och låt sektionerna tina i cirka 20 minuter i rumstemperatur.
OBS: Fyll färgningssystemet med vatten för att hålla proverna fuktade. Torkning av vävnaden kan skada antigener, vilket orsakar ospecifik antikroppsbindning och överfärgningsartefakter under färgningsprocedurerna. - Efter 20 minuters upptining, täck sektionerna med några droppar fixeringslösning (4 % paraformaldehyd [PFA], tabell 1) för att fixera vävnaden på objektglasen i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Efter fixering, överför objektglasen till det vertikala objektglasstället och sänk ner dem i en behållare fylld med 1x PBS. Placera behållaren på en shaker på låg hastighet och tvätta objektglasen i 5 minuter. Upprepa denna tvättcykel två gånger till, med färsk 1x PBS varje gång.
- Efter tvätt, ringa in varje enskild sektion på varje objektglas med en xylolhaltig vätskeblockerare. Ordna om objektglasen på färgningssystemet och applicera 1 eller 2 droppar permeabiliseringslösning (0.1 % Triton X-100, tabell 1) på varje prov med en Pasteur-pipett. Låt sektionerna inkuberas i rumstemperatur i 10 minuter för att permeabilisera cellen och cellorganellmembranen.
- Efter permeabilisering, ta bort 0,1 % Triton X-100-lösningen genom att tvätta objektglasen i 3 x 5 minuter i 1x PBS, enligt samma procedur som beskrivs i steg 6.3.
- Efter tvätt, ordna om objektglasen på färgningssystemet och applicera 1 eller 2 droppar av blockeringsbufferten (tabell 1) på varje sektion, se till att de är helt täckta med blockeringsbufferten. Låt objektglasen inkubera i 1 timme i rumstemperatur.
- Bered 1 ml av den primära antikroppsblandningen genom att pipettera 5 μl av en anti-cTNT-antikropp från möss (utspädd 1:200) och 1 μl av en anti-Cx43-antikropp från kanin (utspädd 1:1 000) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör fyllt med 994 μl blockeringsbuffert. Pipettera blandningen upp och ner för att säkerställa noggrann blandning.
OBS: Justera mängden antikroppsblandning som appliceras efter sektionens storlek. Se till att sektionerna är helt täckta av antikroppsblandningen. Antikropparnas koncentration, inkubationstid och optimala inkubationstemperatur kan variera beroende på faktorer som antikroppstyp, antikroppskloner och vävnadsegenskaper. Vi rekommenderar att du testar och optimerar färgningsförhållandena individuellt för varje antikropp. - Efter blockeringssteget (steg 6.6) avlägsnas den återstående blockeringsbufferten och 2 eller 3 droppar av den primära antikroppsblandningen appliceras direkt på varje sektion. Låt objektglasen inkubera över natten vid 4 °C.
- Efter den primära antikroppsinkubationen, tvätta objektglasen i 3 x 5 minuter med tvättbuffert under lätt skakning (tabell 1).
- Bered 1 ml av den sekundära antikroppsblandningen genom att pipettera 1 μl av en AF488-konjugerad sekundär antikropp mot getmöss (utspädd 1:1 000) och 1 μl av en AF568-konjugerad sekundär antikaninantikropp (utspädd 1:1 000) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör fyllt med 998 μl tvättbuffert. Pipettera blandningen upp och ner för att blanda väl.
- Efter tvättsteget (steg 6.9) arrangerar du om objektglasen i färgningssystemet och applicerar 2 eller 3 droppar av den sekundära antikroppsblandningen på varje sektion med en pipett. Låt antikropparna inkubera i 45 minuter i rumstemperatur samtidigt som proverna skyddas från ljus för att förhindra fluoroforkylning. Efter den sekundära antikroppsinkubationen, tvätta objektglasen i 3 x 5 minuter med tvättbuffert under lätt skakning (tabell 1).
- Ordna om objektglasen på färgningssystemet. Motfärga sektionerna med Hoechst-33342 (i en spädning på 1:1 000 i 1x PBS) genom att applicera 2 till 3 droppar av Hoechst-33342-lösningen på varje sektion. Låt objektglasen inkubera i 10 minuter i rumstemperatur.
- Efter inkubationen, tvätta objektglasen 3 x 5 min med tvättbuffert under lätt skakning (tabell 1). Montera objektglasen genom att applicera 1 eller 2 droppar fluorescerande monteringsmedium på varje objektglas. Täck objektglasen med täckglas.
OBS: Se till att täckglaset är plant när du placerar det. Om det finns några luftbubblor, tryck försiktigt på sidan av bubblan för att ta bort dem. - Förvara de monterade objektglasen i en objektglassparare vid 4 °C.
OBS: Vi rekommenderar att du avbildar bilderna så tidigt som möjligt. Detta protokoll gäller inte enbart för de nämnda antikropparna. Målantigener och antikroppar kan ersättas eller modifieras i enlighet med de individuella experimentkraven eller alternativa antigendetektionsstrategier.
7. Avbildning av immunfluorescensfärgningsskivorna
- Ställ in mikroskopet.
- Starta mikroskopet med laserljuskällan, den anslutna datorn och den medföljande programvaran enligt tillverkarens manual.
- Gå in i konfigurationsmenyn . Klicka för att välja lämplig kameratyp för fluorescensavbildning (t.ex. DFC365FX monokrom kamera).
- Gå in i menyn Skaffa och skapa tre kanaler.
- Välj kanal FCr1 för detektering av Hoechst-33342, märk den och välj DAP-filterkuben i urvalssektionen. Ställ in exponeringstiden på 200 ms, den elektroniska förstärkningen på 2 och ljusintensiteten på 17 %.
- Välj kanal FCr2 för detektion av cTNT (färgad med AF488-konjugerad antikropp), märk den och välj L5-filterkuben i urvalssektionen. Ställ in exponeringstiden på 200-300 ms, den elektroniska förstärkningen på 1.8 och ljusintensiteten på 100 %.
- Välj kanal FCr3 för detektion av Cx43 (färgad med AF568-konjugerad antikropp), märk den och välj TXR-filterkuben i urvalssektionen. Ställ in exponeringstiden på 150 ms, den elektroniska förstärkningen på 2 och ljusintensiteten på 100 %.
OBS: Filterkubernas spektrala egenskaper listas i tabell 2.
- Ladda objektglaset på mikroskopet stage.
- Utför en översiktsbild med 10x förstoring:
- Välj 10x-objektivet och öppna laserslutaren genom att klicka på Live. När FCr1-kanalen är markerad använder du navigatorfunktionen för att navigera genom bilden tills en signal upptäcks. Fokusera provet grovt tills cellkärnorna kan urskiljas.
- Starta spiralskanningsläget för att ta en fullständig förhandsgranskning av provet. Avaktivera live genom att klicka på knappen igen för att skydda provet. Identifiera LA, PV och lungvävnad.
- Definiera intresseområdet för den efterföljande panelgenomsökningen. Välj flera fokuspunkter inom intresseområdet. Klicka på Live i FCr1-kanalen och justera fokus för varje fokuspunkt. Spara motsvarande Z-positioner, som representerar den exakta fokuspositionen för varje fokuspunkt. Starta panelskanningen med 10x förstoring för att ta en fullständig översiktsbild av exemplet.
- När genomsökningen är klar öppnar du panelgenomsökningen och sammanfogar de enskilda bilderna. Om du vill förbättra ljusstyrkan och kontrasten för enskilda kanaler markerar du dem i objektfältet och justerar deras signalområde med skjutreglagen efter önskemål.
- Få inzoomade bilder med 40x förstoring:
- Välj 40x-målet. Justera exponeringstiden och förstärkningsinställningarna för varje kanal enligt följande: FCr1: DAP-filterkub: exponeringstid: 50 ms, förstärkning: 1.5; FCr2: L5-filterkub: exponeringstid: 80 ms, förstärkning: 1,8; FCr3: TXR-filterkub: exponeringstid: 20 ms, förstärkning: 2.
- Använd översiktsbilden i steg 7.3 för att hitta PV-öppningen (PVO) samt extrapulmonella och intrapulmonella PV-regioner (PVex, PVin). Definiera det här området som ska skannas.
- Öppna undermenyn Bild och klicka på z för att aktivera Z-Stack.
- Välj FCr1-kanal och öppna laserslutaren för att få en live preview.
- Gå till undermenyn Z-Stack och bestäm Z-Stacks start- och slutpunkter genom att vridafinjusteringsratten medurs och moturs tills den övergripande signalen börjar tappa fokus.
- När du har ställt in fokusområdet väljer du det systemoptimerade Z-Stack-läget och aktiverar alternativet beräkna bilder med utökat skärpedjup (EDF). Beroende på hur platt vävnaden är kan du räkna med cirka 20 lager med ett stegintervall på cirka 0,5 μm.
- Starta panelgenomsökningen. Efter skanningen öppnar du panelskanningen och sammanfogar endast EDF-bilden. För att förbättra ljusstyrkan och kontrasten för enskilda kanaler, markera dem i objektfältet och justera deras signalområde med skjutreglagen efter önskemål (se steg 7.3.4).
- När du har genererat bilderna sparar du projektet och exporterar både den sammanslagna versionen och de råa kanalerna för varje bild som en TIFF-fil.
OBS: Om du sparar filerna som ImageJ-läsbar TIFF kan ImageJ importera den ursprungliga panelstorleken i μm istället för pixlar. Stäng alltid laserslutaren när en lasersignal inte behövs för att förhindra fotoblekning av de sekundära antikropparna.
8. Bildredigering med ImageJ
- Ladda motsvarande råkanalsfiler i ImageJ. Klicka på Bild | Färg | Sammanfoga och välj önskad färg för varje kanal.
- Skapa en skalstapel genom att välja Analysera | Verktyg | Skala Bar och klistra in den i det nedre högra hörnet. Fortsätt med vidare bearbetning och analys enligt bildkraven. Spara de sammanfogade bilderna när du är klar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utförde mikrodissektion, färgning och avbildning av PV:erna i 10 12-16 veckor gamla möss. I enlighet med protokollet mikrodissekerade vi framgångsrikt PV tillsammans med LA i alla försöksmöss och erhöll sektioner med en heltäckande bild av PV i åtta möss. Översiktsbilder togs vid 10x förstoring för att identifiera PV-öppningsområdet (PVO) vid LA-PV-övergången, extrapulmonella PV (PV ex) (PVmellan lunghilum och LA-PV-övergången) och intrapulmonella PV (PV in) (PVomgivna av lungvävnad) (Figur 2). Inzoomade bilder av de nämnda områdena erhölls med 40x förstoring (figur 3).
Vi hittade specifika cTNT-signaler med en typisk muskelstrimmor i PVO, PVex och PVi (Figur 3). Cx43 hittades i alla tre PV-regionerna och projicerades mestadels mellan närliggande kardiomyocyter (Figur 3 och Figur 4A). Cx43-relaterade signaler observerades både på den polära sidan (Figur 3, gula pilar) och på den laterala sidan av kardiomyocyterna i MS (Figur 3, röda pilar).
Figur 1: Identifiering av murina lungvener under mikroskopet. Ljusfältsmikroskopi (10x förstoring). Hjärtat är fäst vid dissektionskålen med fyra stift vid förmaket, vänster lunglob, höger mellersta lunglob och höger nedre lunglob. (A) Översikt över hjärtbasen efter att ha separerat ventrikelvävnaden från förmaket med aortabågen i mitten. Förmaket ligger längst ner; Lungloberna är utspridda i den övre halvan av bilden. PV döljs av AA, huvudbronkerna och PA. (B) Toppbild av hjärtbasen efter avlägsnande av luftstrupen, delar av huvudbronkerna, aortabågen samt bindväv och fettvävnad. De personliga assistenterna i mitten av bilden visar hela sitt förlopp från PT till LH och täcker PV:erna. (C) Toppbild av PV efter att ha skurit av PA från lungloberna och tagit bort extrapulmonell bronkialvävnad. Skalstreck = 5 mm. Förkortningar: AA = aortabåge; AscA = stigande aorta; IVC = inferior vena cava; L Br = vänster huvudbronk; L PV = vänster lungven; LA-PV J = vänster förmak-lungvensförbindelse; LAA = vänster förmaksbihang; LAFW = vänster förmaksfri vägg; LH = lungans hilum; L. LL = vänster lunglob; PA = lungartärer; PT = lungstammen; R Br = höger huvudbronk; R PV = höger lungven; R-A PV = höger stigande lungven; RAA = höger förmaksbihang; R. acc. LL = höger tillbehör lunglob; R. inf. LL = höger nedre lunglob; R. mid. LL = höger mellersta lunglob; R. sup. LL = höger övre lunglob; SVC = superior vena cava. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Översikt över lungvenerna och vänster förmak hos vuxna möss i en tvärsnittsbild med immunofluorescensmikroskopi. Cellkärnorna färgades med Hoechst-33342 (blå); kardiomyocyter märktes med anti-cTNT-antikropp (vit); och gapövergångar detekterades med hjälp av anti-Cx43-antikropp (grön). De vita rektanglarna markerar följande regioner: a, PV-öppning (PVO); b, extrapulmonell PV (PVex); och c, intrapulmonell PV (PVin). Skalstapel = 500 μm. Förkortningar: L PV = vänster lungven; LAA = vänster förmaksbihang; LAFW = vänster förmaksfri vägg; LV-EP = vänster kammare - utstötningsväg; R PV = höger lungven; R-A PV = höger stigande lungven; RV = Höger kammare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Inzoomad bild av höger PV-myokardium med immunofluorescensmikroskopi. Cellkärnorna färgades med Hoechst-33342 (blå); kardiomyocyter märktes med anti-cTNT-antikropp (vit); och Cx43+ gap junctions detekterades av anti-Cx43-antikropp (grön). (A) EDF-plattor som visar ett längsgående snitt genom den högra extrapulmonella PV. LA- och PV-öppningen visas inte på bilden och skulle vara placerad till vänster, medan intrapulmonell PV och motsvarande lungparenkym (som inte heller visas) skulle vara placerade till höger. (B,C) EDF enkelpanneskanning av rätt extrapulmonell PV. Pilar markerar Cx43+ gapkorsningar vid kardiomyocyternas cellulära gränser. De gula pilarna indikerar gap junctions på de polära sidorna av kardiomyocyter, samlokaliserade med interkalerade diskar, medan de röda pilarna indikerar gap junctions på laterala sidan av kardiomyocyter. Skalstreck = 50 μm (A), 20 μm (B,C). Förkortningar: PV = lungven; EDF = utökat skärpedjup, LA = vänster förmak. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Immunofluorescensfärgning av kontrollvävnad. (A) Positiv kontrollfärgning av murina LV. Cellkärnor färgades med Hoechst 33342 (blå); kardiomyocyter märktes med anti-cTNT-antikropp (vit); och Cx43+ gap junctions detekterades med anti-Cx43-antikropp (grön). (B) Negativ kontrollfärgning av höger extrapulmonell PV genom användning av endast sekundära antikroppar. Cellkärnorna är färgade med Hoechst 33342 (blå). Skalstreck = 20 μm (A), 50 μm (B). Förkortningar: LV = vänster kammare; PV = lungven. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Filter-kub | Excitation Filter | Emissionsfilter |
| DAP | 350 / 50 | 460 / 50 |
| L5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| TXR (TXR) | 560 / 40 | 630 / 75 |
Tabell 1: Excitations- och emissionsfilteregenskaper hos Leica DM6 B-filterkuber.
| Förening | Slutlig koncentration | g eller ml/100 ml krävs |
| Fixering lösning | ||
| Paraformaldehyd (PFA) 16% | 4% | 25 ml |
| Fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) 1x koncentrerad | 75 ml | |
| Lösning för permeabilisering | ||
| Triton X-100 | 0.1% | 0,1 ml |
| Fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) 1x koncentrerad | 99,9 ml | |
| Blockerande buffert | ||
| Normal goes serum (NGS) | 10% | 10 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0.5% | 0,5 mg filmdragerade tabletter |
| Interpolering 20 | 0.1% | 0,1 ml |
| Fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) 1x koncentrerad | 89,9 ml | |
| Tvätt buffert | ||
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0.5% | 0,5 mg filmdragerade tabletter |
| Interpolering 20 | 0,1 ml | |
| Fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) 1x koncentrerad | 99,9 ml | |
Tabell 2: Buffertrecept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med detta protokoll delar vi en metod för att särskilja och isolera PV i mushjärtat och utföra immunofluorescensfärgning på dem. Efter organskörden dehydrerades hjärtat och lungorna i steriliserad sackaroslösning, följt av att kamrarna separerades från förmaken och lungloberna under mikroskopisk ledning. Efteråt förbereddes hjärtbasen för att visualisera PV:erna följt av att skära av dem från lungorna vid hilum. Den efterföljande immunofluorescensfärgningen utfördes med hjälp av en kryoteknik genom att bädda in vävnaden i OCT-föreningen, skära den med en kryotom, och utföra immunofluorescensfärgning för cTNT och Cx43.
Att isolera PV kan vara användbart för att studera deras roll i arytmogenesen av AF. PV-isolering hos möss är dock utmanande. Förutom sin ringa storlek är PV gömda bakom huvudbronkerna och de framträdande kärlen vid hjärtbasen, vilket gör att deras upptäckt blir mycket komplicerad. Detta protokoll ger ett enkelt och transparent sätt att undersöka murina PV och möjliggör ett ekonomiskt tillvägagångssätt för att studera deras morfologiska egenskaper i detalj. Den föreslagna skörde- och beredningsmetoden bevarar de anatomiska relationerna mellan PV, motsvarande lunglober och LA, vilket underlättar undersökningar av hela LA-PV-vävnadskomplexet.
MS har en heterogen ordning. Betydande variabilitet i kontinuitet och fiberorientering har beskrivits hos flera arter, inklusive råttor och människor, och finns mestadels runt PV-öppningarna 4,20. Dessa skillnader resulterar i anisotrop elektrisk ledning och kan inducera initiering av återinträdesexcitationer och autonom aktivitet i PV21. Dessutom kan den elektriska sammankopplingen mellan MS och förmaksmyokardiet vid LA-PV-övergången leda till övergång av desynkroniserade elektriska impulser från PV till vänster förmak, vilket resulterar i AF2. Att bevara de morfologiska proportionerna vid LA-PV-övergången är därför avgörande för att studera interaktionen mellan förmaksmyokardium och PV. För att uppnå detta är det viktigt att noggrant identifiera de viktigaste bronkerna och PA. Vi identifierade landmärkena utifrån deras anatomiska positioner och relationer med hjälp av ett mikroskop med 10x förstoring och genom att systematiskt följa deras förlopp från hjärtbasen till LH.
Vi utförde IF-färgning av murina PV:er. Färgningsmetoder baserade på immunreaktiva färgämnen är allmänt etablerade hos olika arter och möjliggör direkt detektion av målantigener, vilket ger högkvalitativ visuell kontrast i mikroskopi. Detta tillvägagångssätt möjliggör både kvalitativ och kvantitativ karakterisering av intakta vävnadsskivor på proteinnivå. Vi använder hjärtisotypen TNT för att skilja mellan myokardium och icke-kardiell muskulatur. Förekomsten av kardiomyocyter i PV, liksom SVC och IVC har beskrivits tidigare7. Andra rörformiga strukturer i lungorna, inklusive PA, bronker och privata lungkärl, innehåller dock inte hjärtmuskelceller, vilket gör dem lätta att skilja åt genom IF-färgning7. Genom att märka strukturproteiner som cTNT visar kardiomyocyter sin karakteristiska tvärstrimmor beroende på deras orientering mot strålvägen. Riktningen på strimningen kan mappas i ImageJ med plugins som OrientationJ eller Directionality Plugin. Detta hjälper till att kvantifiera och karakterisera riktningen hos kardiomyocyter och kan vara användbart för att identifiera regioner med anisotrop elektrisk ledning. Dessutom stöder denna studie tidigare fynd om den rikliga förekomsten av Cx43 i det murina PV-myokardiet, som är organiserat på ett liknande sätt som i LV (Figur 4A)15,16. Anmärkningsvärt nog observerade vi gap junctions vid det laterala membranet av kardiomyocyter i murina PV. Detta tillstånd, känt som lateralisering, har visats som en patofysiologisk mekanism vid förmaksflimmer, särskilt hos hanmöss22. Således belyser detta protokoll potentialen för liknande studier i mus-MS-kardiomyocyter.
PV-isolering är en viktig teknik för arytmiforskning eftersom den möjliggör ett antal undersökningar, inklusive IF-färgning, flödescytometri, fluorescensaktiverad cellsortering, optisk kartläggning och patch clamp. Men eftersom det nuvarande protokollet etablerades för IF-avbildning av fixerad och inbäddad vävnad, saknas för närvarande direkta bevis för att kardiomyocyter kan isoleras från PV-preparat i tillräcklig kvalitet för att tillåta experiment som patch clamp. Framgången för mikrodissektionen beror på forskarens erfarenhet på grund av den lilla storleken och bräckligheten hos den murina hjärtvävnaden. Kvaliteten på IF-avbildningen är också till stor del beroende av inbäddningssteget. Horisontella arrangemang är svåra att uppnå, vävnadsintegriteten hos sektionerna kan bli lidande och PV kan brista om de inte fylls med OCT-förening. Dessutom är protokollets giltighet begränsad till 2D-avbildning, eftersom metoden inte tillåter 3D-rekonstruktion av solcellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det tyska centret för kardiovaskulär forskning (DZHK; 81X3600221 till H.V., 81X2600255 till S.C.), China Scholarship Council (CSC201808130158 till R.X.), den tyska forskningsstiftelsen (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 till P. T.), och Corona Foundation (S199/10079/2019 till S. C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B.
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al.
- Thibault, S., Ton, A. -T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
