A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas
Abstract
Metagenómica bibliotecas fragmentos contiguos gran archivo de secuencias genómicas de los microorganismos sin necesidad de cultivo previo. Generación de un procedimiento simplificado para la creación y la selección de bibliotecas de metagenómica tanto, es útil para una eficiente investigación de alto rendimiento en las propiedades genéticas y metabólicas de los ensambles microbianos inculto. En este caso, los protocolos claves se presentan en el vídeo, que nos proponemos es el formato más útil para describir con precisión un largo proceso que, alternativamente, depende de la instrumentación robótica y (humanos) de intervenciones manuales. En primer lugar, la robótica empleada para detectar clones de la biblioteca en las membranas de macrochips de alta densidad, cada uno de los cuales puede contener colonias de duplicados de veinticuatro planchas biblioteca de 384 pocillos. La automatización es esencial para este procedimiento no sólo por la precisión y velocidad, pero también debido a la miniaturización de la escala necesaria para adaptarse a la gran cantidad de clones de la biblioteca en la organización espacial de alta densidad. Una vez generado, el próximo demostró cómo las membranas macrochips pueden ser examinados por los genes de interés usando versiones modificadas de los protocolos estándar para el etiquetado de la sonda, la hibridación de membrana, y la detección de la señal. Hemos complementado la demostración visual de estos procedimientos, con descripciones detalladas por escrito de los pasos a seguir y los materiales requeridos, todos los cuales están disponibles en línea junto con el vídeo.
Protocol
Discussion
El procedimiento de extracción no ha sido optimizado. Sin embargo, el procedimiento de agotamiento dado en las instrucciones del fabricante (2 lavados cada 10 min en etanol al 100%, un lavado de 1 hora a 60 ° C en el 0,5% SDS) es insuficiente. Por lo menos una noche de incubación en el 100% de etanol es necesario para disolver el producto de reacción ECF; de incubación de varios días en el 100% de etanol no parece tener efectos adversos sobre la capacidad de sondear la membrana. Tratamiento del fabricante SDS también parece ser insuf…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
