宏基因组文库的大规模筛选

摘要

宏基因组文库可存档来自微生物的大片段连续基因组序列，且无需预先进行培养。因此，建立一种高效构建和筛选宏基因组文库的简化流程，有助于高通量地研究未培养微生物群落的遗传与代谢特性。本文以视频形式展示了关键实验步骤，我们认为这是准确描述依赖机器人仪器与（人工）手动操作交替进行的长流程的最有效方式。首先，我们采用机器人将文库克隆点样至高密度宏阵列膜上，每张膜可容纳来自24块384孔文库板的重复菌落。该步骤必须实现自动化，不仅是为了保证准确性和速度，也是因为需要将大量文库克隆以高度密集的空间排布，实验尺度必须微型化。文库制备完成后，我们进一步演示了如何利用标准探针标记、膜杂交和信号检测方法的改良版本，对宏阵列膜进行目标基因的筛选。除视频直观展示外，我们还提供了详细的书面说明，涵盖所有操作步骤和所需材料，相关内容均可在线获取，与视频一并提供。

方案

1. 杂交实验步骤

一个杂交管可容纳1至2张膜（尺寸为22 cm × 22 cm）。每个杂交管使用50 ml杂交液和0.5 mg DNA探针（终浓度为10 ng/ml）。为获得最佳结果，建议使用凝胶纯化的DNA作为探针。若需扩大探针制备规模，应增加试管数量，而非增加每管中的试剂用量。

探针制备（0.5 mg DNA）：

1. 将15 μl交联剂溶液用60 μl水稀释。
2. 用水将DNA稀释至10 ng/μl，总体积为50 μl，置于带螺帽的微量离心管中。
3. 将DNA在沸水中变性5分钟。
4. 迅速转移至冰上，冷却5分钟，短暂离心。
5. 加入50 μl反应缓冲液，轻轻混匀。
6. 加入10 μl标记试剂，轻轻混匀。
7. 加入第1步中稀释好的50 μl交联剂溶液，轻轻混匀；轻轻涡旋并短暂离心。
8. 在37°C孵育30分钟。
9. 置于冰上最多2小时，或加入等体积的100%甘油，于-20°C保存。
   
   注意：使用试剂盒中提供的水。除非另有说明，所有试剂均需置于冰上。

膜制备与杂交

1. 将50 ml杂交缓冲液和杂交管预热至60°C。
2. 将杂交缓冲液加入杂交管中。将膜卷起后加入杂交管中。（若每管加入两张膜，应先将一张膜完全卷起，再朝相同方向将第二张膜卷在第一张之上。）
3. 在60°C下孵育杂交管至少½小时。（确保膜充分浸透。）
4. 用长吸头从杂交管中转移约1 ml杂交缓冲液至含有标记探针的管中。轻轻涡旋混匀并短暂离心。将混合液重新转移回杂交管。
5. 在60°C下孵育过夜。
   
   注意：操作膜时应使用镊子和手套。轻柔混匀杂交管内容物，因为过度震荡会导致难以消除的泡沫产生。膜应保持湿润状态加入；必要时先用杂交缓冲液或水浸泡，再沥去多余液体后加入。

2. 检测步骤

洗涤膜

1. 将主洗涤缓冲液预热至 60°C。（可使用微波炉和/或加热板。）
2. 如果一个杂交管中有两张膜，请将其中一张膜转移至一个洁净、预热过的空杂交管中。
3. 用约 50 ml 主洗涤缓冲液短暂冲洗杂交管。
4. 向杂交管中加入约 100 ml 主洗涤缓冲液，在 60°C 下孵育 10 分钟。
5. 重复步骤 3 和 4。
6. 将膜转移至洗涤容器中，加入至少 250 ml 的次级洗涤缓冲液，在室温下孵育 5 分钟。
7. 重复步骤 6。
   
   注意：在信号生成前，膜可在室温下的次级洗涤缓冲液中保存最多 ½ 小时。

信号产生与检测（一张膜的操作步骤）

1. 将两片保鲜膜平整地粘在桌面上（一片用于步骤2，另一片用于步骤4）。
2. 通过将膜的角落轻轻接触容器壁，小心吸去膜上多余的缓冲液，并将膜转移至保鲜膜上（样品面朝上）。
3. 在膜上加入6–7 ml ECF试剂，然后将保鲜膜折叠覆盖于膜上。用Kimwipe纸轻轻在保鲜膜表面移动，使ECF试剂均匀分布。孵育5分钟。
4. 吸去膜上多余的ECF试剂，将膜转移至新的保鲜膜上，折叠保鲜膜覆盖膜，并用胶带密封边缘。用铝箔包裹膜。孵育1–2小时。
5. 在扫描仪玻璃板上加入1–2 ml ECF试剂并均匀分布。然后将膜转移至玻璃板上（样品面朝下），并在膜上再加入1–2 ml ECF试剂。覆盖一层保鲜膜，并小心地将所有气泡从膜表面赶出。（可在保鲜膜上放置一块硬板，以确保膜紧贴玻璃板。）
6. 使用富士FLA-5100荧光扫描仪（“单激光单图像”模式），设置如下：激发波长473 nm，检测滤光片LPB（510 nm），分辨率50 μm，信号位深16位，CH1电压400 V。（扫描一张22 cm × 22 cm大小的膜约需15–20分钟。）
   
   可选步骤：
   
   
7. 静置2–4小时（或更长时间）。
8. 重复步骤6的扫描操作。

3. 剥离与储存步骤（NUF 版本）

1. 将膜转移至100%乙醇中，室温下轻轻振荡孵育10分钟。
2. 更换新鲜的100%乙醇，室温孵育过夜。（膜可在乙醇中保存数天。）
3. 用蒸馏水替换乙醇，室温孵育10分钟。
4. 向杂交管中加入100 ml水和5 ml 10% SDS（终浓度为0.5% SDS），轻轻混匀，然后放入膜。
5. 在80°C孵育1小时。
6. 将膜转移至一个洁净的空容器中。
7. 在烧杯中加入500 ml水和5 ml 10% SDS（终浓度为0.1% SDS），放入微波炉加热至剧烈沸腾。
8. 将接近沸腾的0.1% SDS溶液倒在膜上，轻轻振荡数分钟，然后静置冷却至室温。
9. 用至少250 ml无菌的100 mM Tris（pH 8.0）冲洗至少10分钟。
10. 用保鲜膜包裹膜，并用胶带小心封好边缘，于4°C保存。（膜切勿干燥。）

讨论

剥离步骤尚未经过优化。然而，制造商说明书提供的剥离方法（每次10分钟，用100%乙醇洗涤2次，再在60°C下用0.5% SDS洗涤1次，持续1小时）并不充分。至少需要在100%乙醇中孵育过夜，才能溶解ECF反应产物；在100%乙醇中孵育数天似乎对膜的重新杂交能力没有不良影响。制造商推荐的SDS处理步骤也显得不足。NUF尝试在80°C下用0.5% SDS处理1小时，随后用接近沸腾的0.1% SDS处理一次，获得了成功。Tracy已证明，仅需用接近沸腾的0.1% SDS倾倒冲洗一次即已足够。

实用提示：
杂交缓冲液、杂交管和初次洗涤缓冲液在使用前必须预热至 60°C，并在整个实验过程中保持该温度。例如，可将缓冲液置于带有浸入式温度计的加热板上；在康宁（Corning）加热板上，将温度调至约 3 档可达到 60°C。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AlkPhos Direct 标记试剂	试剂盒	Amersham	RPN3680	包含标记试剂、交联剂溶液、反应缓冲液、水、对照 DNA、杂交缓冲液、封闭试剂。杂交缓冲液和封闭试剂储存于室温，其余试剂储存于 2-8°C。
ECF 底物	试剂盒	Amersham	RPN3685	包含 ECF 底物、ECF 底物稀释缓冲液。注意：包装内共含 60 ml 试剂；分装为每份 10 ml 置 Falcon 管中，储存于 20°C。每张膜（尺寸为 22 × 22 cm）使用约 10 ml。
20× 次级洗涤缓冲液	缓冲液			121 g Tris（终浓度 1 M），117 g NaCl（终浓度 2 M）。用 NaOH 调节 pH 至 10，加水定容至 1 L。储存于 2-8°C，可保存最多 4 个月。
0.5 M NaH2PO4 缓冲液 pH 7	缓冲液			69 g NaH2PO4·H2O。用 NaOH 调节 pH 至 7，加水定容至 1 L。储存于室温。
1 M MgCl2				50.8 g MgCl2·6H2O，加水定容至 250 ml。储存于室温。
10% (w/v) SDS				20 g SDS，加水定容至 200 ml。储存于室温
组合装 RPN3692 = RPN3680 + RPN3685