Summary
Følgende protokol præsenterer påvisning af enkeltstrengede DNA-foci i G1-fasen af cellecyklussen ved hjælp af cellecyklussynkronisering efterfulgt af RPA2-immunofluorescerende farvning.
Abstract
DNA har dedikerede cellulære reparationsveje, der er i stand til at klare læsioner, der kan opstå fra både endogene og / eller eksogene kilder. DNA-reparation kræver samarbejde mellem adskillige proteiner, der er ansvarlige for at dække en bred vifte af opgaver fra at genkende og signalere tilstedeværelsen af en DNA-læsion til fysisk reparation af den. Under denne proces oprettes ofte spor af enkeltstrenget DNA (ssDNA), som til sidst fyldes af DNA-polymeraser. Arten af disse ssDNA-spor (med hensyn til både længde og antal) sammen med polymerasen rekrutteret til at udfylde disse huller er reparationsvejsspecifikke. Visualiseringen af disse ssDNA-spor kan hjælpe os med at forstå den komplicerede dynamik i DNA-reparationsmekanismer.
Denne protokol giver en detaljeret metode til fremstilling af G1-synkroniserede celler til måling af ssDNA-focidannelse ved genotoksisk stress. Ved hjælp af en brugervenlig immunfluorescenstilgang visualiserer vi ssDNA ved farvning for RPA2, en komponent i det heterotrimeriske replikationsprotein A-kompleks (RPA). RPA2 binder sig til og stabiliserer ssDNA-mellemprodukter, der opstår ved genotoksisk stress eller replikation for at kontrollere DNA-reparation og aktivering af DNA-skadekontrolpunkt. 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) farvning bruges til at visualisere DNA-replikation for at udelukke eventuelle S-faseceller. Denne protokol giver en alternativ tilgang til de konventionelle, ikke-denaturerende 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU)-baserede assays og er bedre egnet til påvisning af ssDNA-foci uden for S-fasen.
Introduction
For at opretholde livet overvåger og reparerer celler konstant DNA for at opretholde deres genomiske integritet. Celler kan akkumulere forskellige typer DNA-skader på grund af både endogene (f.eks. oxidation, alkylering, deaminering, replikationsfejl) og eksogene (f.eks. UV, ioniserende bestråling) kilder til DNA-stressorer. Manglende reparation af disse læsioner resulterer i enten apoptose, cellecyklusstop eller ældning og kan føre til sygdomme1. DNA-læsioner kan behandles ved hjælp af en af følgende primære DNA-reparationsveje: DR (direkte reverseringsreparation), som hovedsageligt reparerer alkylerede baser2; BER (base excision repair), som er rettet mod ikke-voluminøse DNA-basefejl og enkeltstrengede DNA-brud (SSB'er)3; NER (nukleotidexcisionsreparation) korrigering af voluminøse, helixforvrængende DNA-læsioner4; MMR (reparation af mismatch), der hovedsagelig er rettet mod DNA-mismatch, insertion/deletion loops (IDL'er) og visse baseskader5 NHEJ (ikke-homolog endesammenføjning) og HRR (homolog rekombinationsreparation), der begge er aktive ved dobbeltstrengede DNA-brud (DSB'er)6; og TLS (translesionssyntese), som er en DNA-læsionsbypassmekanisme7. Selvom disse veje har forskellige substratspecificiteter, er der visse overlapninger mellem dem for at sikre redundans for effektiv reparation. Forståelse af virkningen af de forskellige DNA-reparationsveje i forskellige cellecyklusfaser er afgørende, da disse DNA-reparationsfaktorer kan tjene som væsentlige mål for terapeutiske tilgange til behandling af kræft, aldring og neurologiske lidelser 8,9.
Enkeltstrenget DNA (ssDNA) genereres gennem hele cellecyklussen på grund af reparation af DNA-læsioner genereret af både endogene og eksogene DNA-skadelige stoffer. Ved genotoksisk stress genereres ssDNA rigeligt i S- og G2-faserne, hvor HRR og MFR har deres højeste aktivitet, og når replikationsmaskineriet går i stå eller kollapser, når de støder på DNA-læsioner 6,10,11. Andre DNA-reparationsveje (f.eks. NHEJ/mikrohomologi-medieret endesammenføjning (MMEJ)/enkeltstrenget udglødning [SSA]) genererer også ssDNA under DSB-reparation12. Disse ssDNA-spor opstår normalt fra DNA-resektion, udført af eksonukleaser såsom EXO1, DNA2 og CtIP under HR og MMR, endonukleaser såsom XPF og XPG under NER eller gennem den kombinerede virkning af POLB og FEN1 under BER 4,13,14,15,16,17,18,19 . På grund af replikationsmaskineriets arbejde genereres der også ssDNA-spor, når DNA-helicasene afvikler DNA foran de PCNA-bundne replikative polymeraser20. I modsætning hertil reducerer manglen på HRR- og DNA-replikation og den begrænsede aktivitet af MFR i G1-fasen omfanget af genererede ssDNA-spor og er derfor mere udfordrende at detektere 10,11,21.
Cellulære ssDNA-spor er meget følsomme strukturer, der skal beskyttes for at undgå dannelse af DSB'er. Dette opnås ved at belægge ssDNA-sporene med RPA. RPA er et rigeligt heterotrimerisk proteinkompleks sammensat af flere underenheder (RPA1, RPA2 og RPA3, også kaldet henholdsvis RPA70, RPA32 og RPA14), som udtrykkes allestedsnærværende gennem hele cellecyklussen22. Hver RPA-underenhed indeholder et DNA-bindende domæne (DBD), der er i stand til at interagere med 4-6 nukleotider, og de kombinerede underenheder danner en stabil trimeriseringskerne. I alt binder RPA til ca. 20-30 nukleotider med sub-nanomolær affinitet 23,24.
Konventionelle metoder bruger immunofluorescens (IF) mikroskopi til at visualisere ssDNA-foci ved mærkning af 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) inkorporeret i genomisk DNA ved hjælp af BrdU-antistoffer25. Denne tilgang er afhængig af det faktum, at BrdU-antistoffer kun kan detektere BrdU i eksponeret ssDNA25. Selvom denne tilgang er ligetil, viser den også visse begrænsninger. For eksempel forbehandles celler for at inkorporere BrdU inden eksperimentets start, hvilket er tidskrævende og kan forstyrre nedstrøms effektorer. Derfor er BrdU-baseret ssDNA-detektion begrænset til replikerende celler og kan ikke bruges til hvilende celler. Dette udelukker anvendelsen af denne metode til at studere DNA-reparation i ikke-replikerende celler på trods af dens betydning i flere sygdomme såsom kræft og neurodegeneration 5,26. Derudover, fordi strukturerne i BrdU og EdU er meget ens, viser de fleste BrdU-antistoffer krydsreaktivitet over for EdU, hvilket skal overvejes, når man sigter mod dobbeltmærkningseksperimenter27. RPA-farvning er tidligere blevet brugt til at vise ssDNA-foci hovedsageligt i S-faseceller; nogle papirer har dog også med succes brugt det uden for S-fasen 28,29,30,31,32,33,34,35. Følgende protokol udnytter effektivt RPA's egenskaber, hvilket muliggør visualisering af ssDNA-foci efter DNA-skade i G1-fasen af cellecyklussen (selvom den kan bruges i alle cellecyklusfaser).
Protocol
1. Vedligeholdelse af hTERT-udødeliggjorte retinale pigmentepitelceller (RPE1)
- Oprethold RPE1-cellelinjer i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Hi-FBS) og 100 μg/ml penicillin-streptomycin (kaldet dyrkningsmedium fra nu af) i en befugtet inkubator med 5% CO2 ved 37 °C. Til rutinemæssig dyrkning dyrkes RPE1-celler i en 15 cm vævskulturbehandlet skål og opdeles, når de når 80-90% sammenløb (~ 16-18 × 106 celler pr. 15 cm skål).
- Ved opdeling fjernes mediet, og cellerne skylles med 10 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
- Tilsæt 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA for at dække hele skålens overflade. Hold cellerne ved 37 °C med trypsinet, indtil de løsner sig.
- Efter trypsinisering resuspenderes cellerne med dyrkningsmedium og spindes ned ved 150 × g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT, 22-25 °C). Supernatanten fjernes og opslæmmes forsigtigt igen i 10 ml dyrkningsmedium.
- Frø 1,6-1,8 × 106 celler i en ny 15 cm skål (~ 1 ml af cellesuspensionen).
BEMÆRK: Alt vævskulturarbejde skal udføres under BSL-2-sikkerhedsniveauer. Inkubationstiden for trypsinisering afhænger af cellesammenløb. Normalt tager processen 2-3 minutter at gennemføre for en 90% sammenflydende plade. Celler bør screenes for mycoplasmakontaminering regelmæssigt med kommercielt tilgængelige sæt (se eksempler i materialetabellen).
2. siRNA slår ned af genet af interesse (GOI)
- Frø 1,0 × 106 RPE1-celler i en 10 cm vævskulturbehandlet plade med 10 ml dyrkningsmedium dagen før transfektionen.
- På dagen for transfektionen komplekseres siRNA'et. Til en 10 cm plade anvendes en slutkoncentration på 20 nM siRPA2 og 12 μL lipidbaseret transfektionsreagens i 500 μL lavserumtransfektionsmedium. Bland forsigtigt alle komponenterne ved at knipse glasset og inkuber ved RT (22-25 °C) i 5 minutter.
- Tilsæt den kompleksbundne siRNA-blanding til cellerne dråbevis og inkuber cellerne med siRNA'et i 48 timer.
3. Synkronisering af RPE1-celler til G0-fase
- Trypsiniser RPE1-cellerne fra trin 2.3 som beskrevet i afsnit 1 (~ 2 × 106 celler).
- Cellesuspensionen overføres til 15 ml centrifugeglas og centrifugeres ved 150 × g, RT (22-25 °C) i 5 min.
- Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i 12 ml PBS. Cellerne centrifugeres ved 150 × g ved RT (22-25 °C) i 5 min. Udtagningen af supernatanten og centrifugeringen gentages to gange.
- Resuspender cellerne i 10 ml serumfrit DMEM suppleret med 100 μg/ml Penicillin-Streptomycin,1 mM natriumpyruvat, 15 mM HEPES, og læg dem på en 10 cm vævskulturskål.
BEMÆRK: Hvis cellerne har tendens til at klumpe sammen, skal du resuspendere dem i kun 1 ml serumfri DMEM og pipette dem op og ned 5x ved hjælp af en P1000-spids for at løsne klumperne, før suspensionen fortyndes op til et slutvolumen på 10 ml. - Efter 24 timers serumsult introduceres den anden runde hæmning efter samme procedure som beskrevet i afsnit 2 ved at tilsætte det kompleksbundne siRNA til de serumsultende celler.
- Opbevar RPE1-cellerne i serumfri DMEM i 72 timer, før du fortsætter til G1-frigivelse.
4. Coverslip belægning og frigivelse af celler i G1-fase
- Steriliser pincet med 70% ethanol og læg et enkelt glasdæksel (12 mm i diameter og # 1,5 tykkelse [0,17 mm]) i en brønd på en 24-brøndplade.
- Fortynd vitronectinbelægningsmatrixen med PBS for at opnå en slutkoncentration på 10 μg / ml. Tilsæt 500 μL vitronectinopløsning i hvert hul, der indeholder dæksedlerne, og inkuber i 1 time ved RT.
- Fjern belægningsopløsningen, og vask dækslerne med 1 ml PBS.
- De serumsultne RPE1-celler løsnes fra den 10 cm vævsbehandlede plade med 1 ml 0,05% trypsin efter PBS-vask i 1 minut ved 37 °C.
BEMÆRK: Celler løsner sig meget hurtigere efter serumsult. Vær forsigtig, når du vasker cellerne med PBS og brug korte trypsiniseringstider. - For at inaktivere trypsinet skal du resuspendere RPE1-cellerne i i alt 6 ml dyrkningsmedium. Det inaktiverede trypsin fjernes ved at dreje cellerne ned med 150 × g ved RT (22-25 °C) i 5 minutter.
- Resuspender cellerne i 1 ml dyrkningsmedium og mål celleantallet.
- Frø 4 × 104 RPE1-celler på det coatede dæksel slipper i alt 500 μL dyrkningsmedium.
BEMÆRK: Sørg for, at cellelevedygtigheden er over 90%, før du fortsætter til nedstrømstrin. Cellelevedygtighed kunne hurtigt vurderes ved trypanblå farvning under celletællingstrinnet. - Efter 6 timers plettering af cellerne i dyrkningsmediet vil G0-frigivne celler være i tidlig G1-fase. Udfør eksperimenter i G1 i dette 6-12 timers vindue, før cellerne begynder at gå ind i S-fasen.
- Før DNA-beskadigelse påbegyndes, pulseres cellerne med 10 μM 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) i 30 minutter ved 37 °C, fortyndet i dyrkningsmedium.
- Fjern mediet indeholdende EdU, og chase cellerne med 10 μM thymidin i 10 minutter ved 37 °C for at forhindre resterende EdU-inkorporering under induktion af DNA-skader.
- Fjern mediet med thymidin og behandl cellerne med 250 μMH2O2i 1 time, fortyndet i dyrkningsmedium.
5. Immunofluorescensfarvning af ssDNA
- Cellerne vaskes én gang med 1 ml RT (22-25 °C) PBS for at fjerne mediet og serumkomponenterne.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når du vasker cellerne for at undgå løsrivelse og tørring. Behandl ikke mange brønde på samme tid. - Forekstraktion: Inkuber de vaskede celler i 1 ml CSK-ekstraktionsbuffer (tabel 1) i 5 minutter ved RT (22-25 °C).
BEMÆRK: CSK-præekstraktion fjerner alle ikke-kromatinbundne proteiner, herunder opløselige RPA2.
FORSIGTIG: Triton X-100 er skadelig ved indtagelse og kan forårsage hudirritation og øjenskade. - Fjern CSK-bufferen fra cellerne og fikser dem direkte ved at tilsætte 0,5 ml 3,6% paraformaldehydopløsning (i PBS) indeholdende 0,05% Triton X-100 i 10 minutter ved RT (22-25 °C).
FORSIGTIG: Det er vigtigt at forberede 3,6% PFA fra 32% PFA-aktien frisk. Paraformaldehyd kan forårsage alvorlig øjenskade, hudirritation og åndedrætsirritation. - Cellerne vaskes én gang med 1 ml PBS indeholdende 0,05 % Triton X-100 for at fjerne PFA'en.
- Yderligere permeabilisere celler ved hjælp af 1 ml PBS indeholdende 0,5% Triton X-100 i 15 minutter ved RT (22-25 °C).
- EdU-klik-IT-reaktion for at visualisere replikerende celler (S-fase)
- Permeabiliseringsopløsningen fjernes, og cellerne vaskes 2x med 1 ml blokerende buffer (tabel 1).
FORSIGTIG: Bovin serumalbumin (BSA) kan forårsage irritation af luftvejene. - Der tilsættes 1 ml blokerende buffer (tabel 1), og den plade, der indeholder dæksel, vippes forsigtigt i 10 minutter ved RT (22-25 °C).
- Den blokerende buffer fjernes, og der tilsættes 500 μL klikreaktionscocktail indeholdende picolylazid 647 (tabel 1). Dæksedlerne inkuberes i 30 minutter ved RT (22-25 °C) ved hjælp af blid vuggen, og der foretages inkubationer nedstrøms i mørke.
BEMÆRK: Når du bruger BrdU-antistoffer, skal du bruge dobbelt så meget (1 ml) og tid (60 min) til klikreaktionen som anbefalet af producenten for at sikre, at reaktionen er mættet og den inkorporerede EdU er mærket. Dette begrænser BrdU-antistoffernes krydsreaktivitet27.
- Permeabiliseringsopløsningen fjernes, og cellerne vaskes 2x med 1 ml blokerende buffer (tabel 1).
- Fjern klikreaktionsblandingen, og vask cellerne 2x med PBS med 0,05% Triton X-100 i 10 minutter ved RT (22-25 °C) (figur 1 og figur 2).
- Der tilsættes 1 ml blokerende buffer og inkuberes ved RT (22-25 °C) i 30 minutter. Alternativt kan cellerne opbevares i blokerende buffer ved 4 °C natten over.
- Påfør primært antistof (anti-RPA2 rotte, 1:1.000 fortynding) i 2 timer ved RT (22-25 °C) i 250-500 μL blokerende buffer med let vuggen.
- Vask cellerne 2x med PBS indeholdende 0,05% Triton X-100 for hurtigt at fjerne det meste af antistofopløsningen.
- Vask cellerne videre i 3 x 10 minutter med blokerende buffer ved RT (22-25 °C).
- Påfør sekundært antistof (anti-rotte Alexa-488, 1:1.000 fortynding) i 250-500 μL blokerende buffer ved RT (22-25 °C) i 2 timer med let vuggen.
- Vask cellerne med blokerende buffer 2x for hurtigt at fjerne det meste af det sekundære antistof. Vask cellerne videre i 3 x 10 minutter med PBS indeholdende 0,05 % Triton X-100 ved RT (22-25 °C).
- For at modvirke plettering af kernerne vaskes cellerne en gang med PBS indeholdende 0,05% Triton X-100 og 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 10 minutter ved RT (22-25 °C). Cellerne vaskes én gang med PBS i 5 minutter ved RT (22-25 °C).
- Monter dækglasset på mikroskopglas ved hjælp af 10 μL monteringsmedium/dæksel. Dyp dækslerne i destilleret vand inden montering for at slippe af med saltkrystaller. Tag billeder af lysbillederne den følgende dag, og opbevar dem ved 4 °C i ugevis (figur 3).
6. Billedoptagelse og kvantificering
- For at tage billeder skal du bruge ethvert tilgængeligt epifluorescerende mikroskop udstyret med rutinemæssige filtersæt til at afbilde DAPI-, FITC- og Cy5-kanaler med mindst 60-63x forstørrelse, høj numerisk blænde og oliemål til at visualisere nukleare foci.
BEMÆRK: Optimal DAPI-excitation er ~ 359 nm; Alexa 488 excitation er ~ 488 nm; mens Alexa 647 excitation er ~ 647 nm. - Til billedanalyse skal du åbne billedfiler i Fiji / ImageJ.
- Lav nukleare masker ved hjælp af DAPI-farvning (figur 4A-F og supplerende video S1).
- Åbn DAPI-billedet.
- Vælg Proces | Forbedr kontrast, og indstil mættet pixel til 0,35.
- Klik på Behandl | Binær | Konverter til maske. Vælg Binær | Udfyld huller, og klik på Analysér | Analyser partikler. Indstil størrelsen til 10-Infinity.
- I ROI manager skal du klikke på Vis alle.
- Find RPA2-foci i kernen (figur 4G, H og supplerende video S1)
- Åbn RPA2-billedet.
- Vælg Proces | Find Maxima. Indstil udrykningen til en værdi, der fremhæver RPA2-fokuserne (mellem 500 og 750), og adskiller den fra baggrunden.
- Til sidst skal du klikke på knappen Mål i ROI Manager.
- Beregn det samlede antal nukleare ssDNA-foci ved at dividere værdien i RawinDen-kolonnen med 255 (den maksimale værdi af pixelintensitet i hver foci).
- Udfør statistisk analyse ved hjælp af det foretrukne statistiske softwareværktøj.
BEMÆRK: Ekskluder alle EdU-positive celler og forkert segmenterede DAPI-masker fra analysen.
- Lav nukleare masker ved hjælp af DAPI-farvning (figur 4A-F og supplerende video S1).
Representative Results
For at overvinde begrænsningerne ved at detektere ssDNA i G1 brugte vi RPA2, som forbedrer både specificiteten og intensiteten af ssDNA-foci-detektion35. For at opnå præcis cellesynkronisering brugte vi RPE1-celler, der effektivt kan serumsultes og synkroniseres til G0-fase. De kan derefter induceres til at genindtræde i cellecyklussen ved tilsætning af serum efter serummangel. For at bekræfte synkroniseringseffektiviteten mærkede vi cellerne med EdU og deres DNA-indhold med propidiumiodid. Vi indsamlede yderligere kvalitative og kvantitative resultater via flowcytometri (supplerende figur S1A). Prikplottene viser, at ~98% af cellerne efter 72 timers serumsult er i G0-fase. Efter tilsætning af serumholdige medier i 6 timer genindtræder celler i cellecyklussen (som det ses ved stigningen i p27-niveauer i figur 1A), idet de har ~ 97% af cellerne i G1, mens de kun har <1% celler i S-fase, <2% celler i G2-fase (supplerende figur S1A). Efter 20-28 timers tilsætning af serum til cellerne passerer de gradvist gennem S-fasen, som vist ved flowcytometriplottene (supplerende figur S1A). Denne cellesynkroniseringsprotokol giver en ~ 97% ren G1-population (6 timer efter serumtilsætning efter 72 timers serumsult). For yderligere at validere synkroniseringseffektiviteten sammenlignede vi ekspressionen af cellecyklusmarkører efter serumfrigivelse ved hjælp af western blotting (figur 1A og supplerende figur S1B) og udførte parallelt et EdU-inkorporeringsassay for at visualisere DNA-replikation. EdU-farvningen fremhæver også synkroniseringseffektivitet og manglen på DNA-replikation i G1-fase (figur 1B, C).
Konventionelle metoder til påvisning af ssDNA i pattedyrceller er afhængige af påvisning af BrdU i ssDNA. Figur 2A viser, at ved behandling medH2O2og neocarzinostatin (NCS) kunne BrdU-foci kun påvises i S-faseceller, mens ingen ssDNA-foci kunne påvises i ikke-S-faseceller. BrdU-antistoffarvningen viste også en mærkbar nukleolær baggrundsfarvning, der kunne detekteres i alle kernerne, uafhængigt af cellecyklustrinnet eller de anvendte behandlinger. Ved hjælp af EdU-klikprotokollen, der er beskrevet her, kunne vi ikke registrere samlokalisering af EdU- og BrdU-foci, hvilket er tydeligt i de ubehandlede prøver i figur 2A. For helt at udelukke ethvert BrdU-signal, der opstod fra krydsreaktivitet, undgik vi EdU-mærkning og brugte snarere cyclin A2 som en S-G2-markør. Imidlertid tillod cyclin A2-farvning ikke CSK-præekstraktion, og under denne betingelse så vi ingen BrdU-foci, selv efter genotoksisk stress (supplerende figur S2A). Dette fremhæver det faktum, at CSK-præekstraktion er nødvendig for anti-BrdU-baseret ssDNA-farvning. Som kontrol testede vi BrdU-antistoffarvning under denatureringsforhold. Dette åbner DNA'et for at afsløre den inkorporerede BrdU, som afslører, at BrdU blev ensartet inkorporeret (supplerende figur S2B).
I modsætning hertil viser RPA2-farvning NCS- ogH2O2-afhængigfocidannelse ikke kun i S-fasen, men også i andre cellecyklusfaser (figur 2B). Som kontrol behandlede vi også cellerne med HU, som kun forårsager ssDNA-akkumulering i celler, der gennemgår replikation. Som forventet opdagede vi kun en signalstigning ved HU-behandling med RPA2-antistoffet i EdU-positive celler, hvilket understreger specificiteten af denne tilgang. RPA2-antistoffet kan også detektere naturligt forekommende ssDNA-dannelse under replikation i fravær af eksogent genotoksisk stress (figur 2B). RPA2-antistoffets meget følsomme natur fik os til at forsøge at udnytte det i G1-fasen, hvor konventionel BrdU-farvning ikke kunne registrere noget signal ved genotoksisk stress (supplerende figur S2C). Figur 3A viser, at dannelsen af ssDNA-foci ved H2O2-behandling kunne påvises ved anvendelse af et anti-RPA2-antistof, selv i G1. Der var en signifikant stigning i antallet af RPA2-foci i disse kerner vedH2O2-behandling(figur 3B). Disse foci var specifikke for RPA2, da dæmpning af RPA2 afskaffede IF-signalet (figur 3A, B). Figur 3C og supplerende figur S1C viser effektiviteten af RPA2-hæmning i disse celler. Sammenlignet med konventionelle metoder er RPA2-baseret detektion af ssDNA meget følsom, og dens anvendelse kan derfor udvides til G1-faseceller.
Figur 1: Synkroniseringseffektivitet af RPE1-celler efter serumsult. (A) Immunoblots viser indikerede proteinniveauer i asynkrone, G1- og S-fasesynkroniserede RPE1-celler. (B) Repræsentative billeder viser asynkrone, G1- og S-fasesynkroniserede RPE1-celler, der blev udsat for 10 μM EdU i 30 minutter før fiksering og visualiseret ved Click-IT-reaktion. DAPI blev brugt til at modvirke nuklear DNA. Skalastænger = 50 μm. (C) Graf viser procentdelen af EdU-positive celler over den samlede cellepopulation vurderet af DAPI. Fejllinjen repræsenterer standardfejl i middelværdien, og de analyserede antal kerner var følgende: AS n = 219, G1 n = 630, S n = 437. Forkortelser: RPE1 = hTERT-udødeliggjorte retinale pigmentepitelceller; AS = asynkron; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: ssDNA-detektion med enten BrdU-antistof eller RPA2-antistof ved DNA-skade. (A) Repræsentative billeder illustrerer ssDNA-foci ved hjælp af αBrdU (grøn), S-faseceller fremhæves med EdU (lilla), og DAPI blev brugt til at modvirke plet nukleært DNA (blå). RPE1-celler blev opbevaret i 10 μM BrdU i 48 timer før yderligere behandling. Efter 48 timer blev cellerne pulseret med 10 μM EdU i 30 minutter efterfulgt af behandling afH2O2(250 μM) i 1 time eller Neocarzinostatin (0,5 μg/ml) i 4 timer. Celler blev fastgjort efter CSK-præekstraktion. En hvid stiplet linje angiver grænsen for hver kerne. Skalabjælke = 5 μm. Paneler til højre er forstørrede billeder af de angivne S-fase eller ikke-S-fasekerner. (B) Repræsentative billeder illustrerer ssDNA-foci ved hjælp af αRPA2-antistof (grøn). S-faseceller fremhæves af EdU (lilla), og DAPI blev brugt til at modvirke plet nukleært DNA (blå). RPE1-celler blev pulseret med 10 μM EdU i 30 minutter efterfulgt af enten 1 timeH2O2(250 μM), 4 timer hydroxyurea (2 mM) eller 4 timer NCS (0,5 μg/ml). Celler blev fastgjort efter CSK-præekstraktion. En hvid stiplet linje angiver grænsen for hver kerne. Skalabjælke = 10 μm. Paneler til højre er forstørrede billeder af de angivne S-fase eller ikke-S-fasekerner. Forkortelser: ssDNA = enkeltstrenget DNA; BrdU = 5-brom-2'-deoxyuridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; RPE1 = hTERT-udødeliggjorte retinale pigmentepitelceller; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; NCS = Neocarzinostatin; HU = hydroxyurea. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Påvisning af ssDNA-foci i G1-fase ved anvendelse af RPA2-antistof. (A) RPE1-celler blev transfekteret med enten siRNA'er rettet mod RPA2 eller en ikke-målrettet siRNA-kontrol og efterfølgende synkroniseret i G1 og pulsmærket med 10 μM EdU i 30 minutter, før de blev behandlet medH2O2(250 μM) i 1 time, hvor det var angivet. DAPI blev brugt til at modvirke nuklear DNA. Celler blev fastgjort efter CSK-præekstraktion. En hvid stiplet linje angiver grænsen for hver kerne. Skalabjælke = 5 μm. (B) Målingerne for antallet af RPA2-foci/kerne blev udført fra to uafhængige forsøg. Kun EdU-negative celler blev overvejet under analysen. Linjer repræsenterer middelværdien på plottene. Ikke-parametrisk ANOVA test (Kruskal-Wallis) blev udført til statistisk analyse. Stjernerne angiver P < 0,0001. Det analyserede antal kerner var følgende: siNT no H2O2 n = 513, siNT H2O2 n = 603, siRPA2 no H2O2 n = 266, siRPA2 H2O2 n = 536. (C) Effektiviteten af siRNA-knockdown er vist i immunoblotting. Forkortelser: siNT = ikke-målrettet siRNA-kontrol; BrdU = 5-brom-2'-deoxyuridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; RPE1 = hTERT-udødeliggjorte retinale pigmentepitelceller; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kvantificering af ssDNA-foci ved hjælp af Fiji. Detaljerede trin i Fiji, der viser, hvordan man vurderer RPA2-foci-tal i kernen. (A-E) Oprettelsen af en nuklear maske ved hjælp af DAPI-kanalen. (F-H) Tærskelværdi for at identificere individuelle nukleare ssDNA-foci fra baggrundssignalet. Forkortelser: ssDNA = enkeltstrenget DNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Cytoskeletal (CSK) buffer | |
| RØR pH 7,0 | 10 mM |
| NaCl | 100 mM |
| EDTA pH 8 | 1 mM |
| MgCl2 | 3 mM |
| D-saccharose | 300 mM |
| Triton X-100 | 0.20% |
| Fosfatasehæmmer cocktail | 1 tablet pr. 10 ml |
| Proteasehæmmer cocktail | 1 tablet pr. 10 ml |
| fortyndet iddH2O; | Nielsen |
| Vaskebuffer | |
| Triton X-100 | 0.05% |
| fortyndet i PBS | Nielsen |
| Permeabiliseringsbuffer | |
| Triton X-100 | 0.50% |
| fortyndet i PBS | Nielsen |
| Fastgørelsesløsning | |
| Paraformaldehyd | 3.60% |
| Triton X-100 | 0.05% |
| fortyndet i PBS | Nielsen |
| Blokering af buffer | |
| Bovin serumalbumin (BSA) | 5% |
| Triton X-100 | 0.10% |
| fortyndet i PBS | Nielsen |
| Click-iT Plus reaktion cocktail | |
| 1x Click-iT reaktionsbuffer | 435 ml |
| Alexa Fluor PCA-løsning | 5 ml |
| CuSO4-kobber beskyttelsesmiddel forblanding | 10 ml |
| 1x Click-iT buffer additiv | 50 ml |
| Samlet volumen | 500 ml |
Tabel 1: Sammensætningen af de buffere, der anvendes i denne protokol.
Supplerende figur S1. (A) RPE1-celler blev synkroniseret til G0-fase ved hjælp af serumsult i 72 timer og derefter frigivet i forskellige cellecyklusfaser ved at genindføre serum. Prikplotter viser celler i G0/G1-, S- eller G2/M-faser, hvor timer angiver tiden efter gentilsætning af serum efter serumsult. Grafen til højre viser procentdelen af G0/G1-, S- og G2/M-celler i hver tilstand. FACS-analyse blev udført ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt celleproliferationssæt under anvendelse af EdU og propidiumiodid i henhold til producentens anbefalinger. (B) Ikke-beskårne western blot-scanninger til figur 1. Tal viser molekylvægtsmarkører i kDa. PARP1 blev brugt som belastningskontrol og lagt på gelen, der også blev udviklet mod CCNA2, p27 (yderligere strippet for PCNA) og pH3 (S10) (yderligere strippet for H3) ved at skære membranen op. CCNB1 og RPA2 blev lagt på en separat gel under anvendelse af den samme mængde proteinlysat for at sikre sammenlignelighed. (C) Ikke-beskårne western blot-scanninger til figur 3. Tal viser molekylvægtsmarkører i kDa. Forkortelse: EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: (A) Repræsentative billeder illustrerer ssDNA-foci ved hjælp af BrdU-antistof (grønt); S-faseceller fremhæves med cyclin A2 (rød); og DAPI blev brugt til at modvirke plet nukleært DNA (blå). RPE1-celler blev opbevaret i 10 μM BrdU i 48 timer før yderligere behandling. Efter 48 timer blev cellerne behandlet medH2O2(250 μM) i 1 time eller Neocarzinostatin (0,5 μg/ml) i 4 timer før fiksering. En hvid stiplet linje angiver grænsen for hver kerne. Skalabjælke = 5 μm. (B) BrdU-farvning af RPE1-celler med og uden denatureringstilstand. Asynkrone RPE1-celler blev forbehandlet med 10 μM BrdU i 48 timer. Skalabjælke = 10 μm. (C) Målingerne for antallet af BrdU-foci/kerne blev udført fra to uafhængige eksperimenter i G1-synkroniserede RPE1-celler. Kun EdU-negative celler blev overvejet under analysen. Linjer repræsenterer middelværdien på plottene. Ikke-parametrisk ANOVA test (Kruskal-Wallis) blev udført til statistisk analyse. 'ns' angiver ikke-signifikant forskel. Det analyserede antal kerner var følgende: NT n = 52, NCS n = 105,H2O2n = 82. Forkortelser: siNT = ikke-målrettet siRNA-kontrol; BrdU = 5-brom-2'-deoxyuridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; RPE1 = hTERT-udødeliggjorte retinale pigmentepitelceller; NCS = Neocarzinostatin. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video S1: Skærmoptagelse af Fiji-baseret RPA2-foci-analyse. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Opretholdelse af en sund, mycoplasmafri cellekultur er afgørende for alle de ovenfor beskrevne eksperimenter. RPE1-celler har en stærk binding til vævskulturbehandlet plastvarer under normale dyrkningsmedier; Imidlertid mindskes deres bindingsegenskaber betydeligt, når de opbevares under serumfrie forhold. For at tage billeder i høj opløsning af ssDNA-foci under et mikroskop skal cellerne desuden belægges på et 0,17 mm tykt dækglas, som ikke er hydrofilt nok til at understøtte korrekt fastgørelse af RPE1-celler. Uden korrekt fladtrykte og jævnt fordelte celler er det meget udfordrende at visualisere individuelle ssDNA-foci. Derfor er det afgørende at vælge det rigtige belægningsmateriale (f.eks. vitronectin) og efterlade tilstrækkelig tid (6-12 timer) for cellerne at sprede sig og vedhæfte efter frigivelse af dem i G1-fase.
En udfordrende del af protokollen er at opnå homogene G1-synkroniserede RPE1-celler. Dette kræver to kritiske trin. For det første skal cellerne trypsiniseres, vaskes grundigt med PBS og direkte podes på nye vævskulturskåle ved hjælp af serumfrie medier for effektiv serumsult. Vask af cellerne direkte i vævskulturskåle for at fjerne serumet giver ikke effektiv G0-synkronisering. For det andet, når cellerne frigives i G1-fase, skal cellerne trypsiniseres igen og podes på friske vævskulturplader. På samme måde vil bare ændring af mediet og tilføjelse af serumholdigt dyrkningsmedium til cellerne ikke resultere i en synkron G1-post. For korrekt G1-indgang skal såtætheden af cellerne på de belagte dækglas desuden være på visse sammenløbsniveauer. Mens perfekt cellesynkronisering generelt er uopnåelig, giver denne synkroniseringsprotokol beskrevet her en ~ 97% ren G1-befolkning. Den anbefalede såtæthed for RPE1 på en dæksel med en diameter på 12 mm er ~4 × 104 for at opnå et homogent synsfelt til billeddannelse med ca. 70% sammenløb. Højere såtæthed får celler til at løsne sig og "skrælle af" efter CSK-ekstraktion og vil resultere i et højere baggrundssignal under billedoptagelse.
For at reducere ethvert baggrundssignal og opnå et gunstigt signal-støj-forhold er grundig vask efter primær og sekundær antistofinkubation afgørende. Da der skal anvendes mange vasketrin, er det også vigtigt at forhindre, at brønden tørrer ud under hvert vasketrin. Vi minimerer denne artefakt ved at anvende mindst 0,05% Triton X-100 i alle vaske- og inkubationstrin. Når brøndene tørrede ud, viste cellerne et ændret signal-støj-forhold; Dette fører til et mosaiklignende mønster under mikroskopet og kan forstyrre evalueringen. Z-stack-billedoptagelse kombineret med dekonvolution kan hjælpe med at fange foci i forskellige fokusplaner for at forbedre analysen.
Konventionelle metoder er afhængige af påvisning af inkorporeret BrdU under ikke-denaturerende forhold. Disse metoder afhænger imidlertid af forbehandling af cellerne med høje doser af BrdU i mindst 1-2 dage (eller tid svarende til en fuld cellecyklus i den anvendte cellelinje) for at sikre ensartet genomisk inkorporering. Uønsket kan omfattende BrdU-inkorporering forårsage cellecyklusinterferens36. For at løse disse begrænsninger bruger denne metode endogen RPA2 til at detektere ssDNA-foci. Denne tilgang kræver ikke replikationsdrevet BrdU-inkorporering, den kan også bruges i postmitotiske celler. Da omfattende BrdU-inkorporering ikke er nødvendig, sparer dette tid og reducerer eksperimentel kompleksitet. Ved at bruge RPA2-farvning til at visualisere ssDNA kan vi bruge 2′-deoxy-5-ethynyluridin (EdU) og klikkemi til at markere DNA-replikation og samtidig undgå mulig krydsreaktivitet af BrdU-antistofferne mod EdU 27,37,38. Der skal udvises særlig omhu for korrekt maskering af den inkorporerede EdU under klikreaktionen, så BrdU-antistofferne ikke krydsreagerer med EdU27,39.
Endelig er en vigtig fordel ved at bruge RPA2 i stedet for BrdU simpelthen at have et overlegent signal-støj-forhold sammenlignet med BrdU-farvning uden for S-fasen. Vi fandt ud af, at den ikke-denaturerende BrdU-farvning og dens evne til at visualisere ssDNA er begrænset til S-fase, selv i replikerende celler (figur 2). BrdU-antistof binder kun til det tilstrækkeligt eksponerede BrdU i ssDNA-strækninger. Bindingen af reparationsproteiner, herunder RPA2, til ssDNA-strækningerne kan undertrykke eller hæmme den tilstrækkelige eksponering af BrdU i ssDNA. Vi fandt også, at CSK-præekstraktion er nødvendig for ssDNA-visualisering ved hjælp af BrdU-antistof. Dette er muligt, fordi ssDNA-sporene ikke er tilgængelige for antistoffet uden at fjerne let bundne proteinkomponenter fra dem.
Ikke desto mindre er der nogle begrænsninger forbundet med denne protokol. En begrænsning ved at bruge RPA2 til ssDNA-detektion er behovet for at optimere CSK-præekstraktionstrinnet. Ubundet, overskydende RPA2 skal vaskes væk fra DNA'et, før cellerne fikseres. På den ene side fører underekstraktion til en høj baggrund på grund af RPA2-proteinfraktionen, der ikke er bundet til ssDNA. På den anden side vil overekstraktion føre til signaltab. For BrdU-detektion er dette ikke en variabel, da BrdU er stabilt inkorporeret i DNA'et og ikke kan vaskes væk ved præekstraktion. Derfor skal tidspunktet for CSK-præekstraktionen, mængden af Triton X-100 i bufferen, volumenet og temperaturen, ved hvilken forekstraktionen udføres, overvejes nøje. CSK præekstraktion begrænser også brugen af kernestørrelse til at skelne G0 / G1-celler fra S / G2-celler.
Derudover kan vi ikke udelukke muligheden for, at noget af det signal, der kommer fra RPA2, stammer fra, at det er bundet til andre kromatinbindende proteininteraktorer. Man skal også overveje artsspecificiteten af RPA2-antistoffet. Antistoffet, der anvendes i denne protokol, kan genkende RPA2 for mennesker, mus, rotter, hamster og aber. En anden begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at ikke alle cellelinjer kan serumsultes til G0-synkronisering. De fleste kræftcellelinjer kan omgå cellecykluskontrolpunkter og sprede sig selv i serumberøvede medier. Selvom serumsult er gavnligt, da det ikke forårsager DNA-skade, skal man nøje overvåge deres cellesynkroniseringseffektivitet for at sikre, at korrekt cellecyklusfaseberigelse opnås. For celler, der ikke reagerer på serummangel, skal andre cellesynkroniseringsmetoder overvejes (f.eks. Mitotisk rystelse, CDK1-hæmning for G2-anholdelse eller ikke-invasive teknikker såsom centrifugalelutriering). En anden mulig metode er at bruge billeddannelse med højt indhold til at måle EdU- og nukleært DNA-indhold til cellecyklusprofilering af asynkrone celler31. Man skal overveje konsekvenserne af at bruge alternative synkroniseringsmetoder for at forhindre interferens med downstream-analyse. For eksempel vil brugen af dobbelt thymidinblok eller aphidicolin, der ofte anvendes i litteraturen, resultere i replikationsstress og DNA-skade40.
Undersøgelsen af DNA-reparationsmekanismer er fortsat et centralt diskussionspunkt inden for kræft og cellebiologi. Protokollen, der præsenteres her, tilbyder en værdifuld tilgang til fremstilling af celler, hvilket muliggør visualisering og kvantitativ analyse af ssDNA ved eksponering for DNA-skadelige stoffer. Især fremhæver denne protokol brugen af ssDNA-bindingsproteinet, RPA2, hvilket demonstrerer dets høje specificitet til at visualisere små mængder ssDNA-foci, samtidig med at uønsket krydsreaktivitet undgås i alle cellecyklusfaserne. Brug af RPA2 giver adskillige fordele, især for forskere, der sigter mod at analysere celler i G1-fasen af cellecyklussen. Denne protokol tager højde for flere begrænsninger og adresserer bekymringer relateret til signalinterferens, uønsket baggrundsstøj og krydsreaktivitet, når du bruger RPA2- eller BrdU-farvning til at detektere ssDNA.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne takker Michele Pagano for hans støtte og nyttige indsigt, Ashley Chui og Sharon Kaisari for kritisk at læse manuskriptet og Jeffrey Estrada og Vilma Diaz for deres fortsatte støtte. Dette arbejde blev støttet af et mangfoldighedstillæg til National Institutes of Health-tilskuddet GM136250.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6074 | primary antibody (1:5,000) |
| Axio Observer Inverted Microscope | Zeiss | na | microscope |
| Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% | Invitrogen | NW04127BOX | Western Blot |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | blocking |
| BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | nucleotide analogue |
| BrdU antibody BU1/75 | Abcam | ab6326 | primary antibody (1:500) |
| CellAdhere Dilution Buffer | Stemcell Technologies | 07183 | coating reagent |
| Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits | Invitrogen | C10632 | flow cytomery |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10640 | click-reaction kit |
| cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 5892791001 | reagent |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX2000 | cell counter |
| Coverslip | neuVitro | GG12PRE | tissue culture |
| Cyclin A2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-271682 | primary antibody (1:1,000) for IF and WB |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | primary antibody (1:5,000) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | vehicle control |
| DMEM, high glucose, with HEPES | Gibco | 12430051 | cell culture medium for RPE cells |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | the PBS used throughout the protocol |
| D-Sucrose | Thermo Fisher Scientific | bp220-1 | reagent |
| Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope | Nikon | na | microscope |
| EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) | Thermo Fisher Scientific | C10637 | nucleotide analogue |
| Falcon 24-well plate | Corning | 351147 | tissue culture |
| Falcon Cell Culture Dishes 100 mm | Corning | 353003 | tissue culture |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 16140071 | media supplement |
| Fiji (ImageJ) | NIH | version 1.54f | software and algorithms |
| FxCycle PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | PI staining |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | secondary antibody (1:1,000) |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A48262 | secondary antibody (1:1,000) |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | primary antibody (1:10,000) |
| hTERT RPE1 | ATCC | CRL-3216 | cell line |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | reagent |
| Hydrogen peroxide 30% soultion | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | reagent |
| Hydroxyurea,98% powder | Sigma-Aldrich | H8627-5G | reagent |
| Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15-575-020 | reagent |
| Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | transfection reagent |
| Magnesium chloride solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | reagent |
| MycoFluor | Thermo Fisher | M7006 | Mycoplasma Detection Kit |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma-Aldrich | N9162-100UG | reagent |
| NuPage MES SDS Running Buffer (20x) | Invitrogen | NP0002 | Western Blot |
| onTARGETplus Human RPA2 siRNA | Dharmacon | L-017058-01-0005 | siRNA |
| p27 antibody | BD Biosciences | 610241 | primary antibody (1:1,000) |
| Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | 50-980-494 | fixative |
| PARP1 antibody | Cell Signaling Technology | 9542S | primary antibody (1:1,000) |
| PCNA antibody | Cell Signaling Technology | 13110S | primary antibody (1:2,000) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | media supplement |
| pH3 antibody | Cell Signaling Technology | 3377S | primary antibody (1:2,000) |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 4906837001 | reagent |
| PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 | Bioworld | 41620034-1 | reagent |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610395 | Western Blot |
| Prism | GraphPad | version 10 | statistical analysis and graph |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | mounting media |
| Reduced serum media (Opti-MEM) | Gibco | 31985070 | used for transfection |
| Rpa32/rpa2 antibody (mouse) | EMD Millipore | NA19L | primary antibody (1:1,000) for WB |
| Rpa32/rpa2 antibody (rat) | Cell Signaling Technology | 2208S | primary antibody (1:1,000) for IF |
| Sodium Chloride solution (5 M) | Sigma-Aldrich | S5150 | reagent |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | media supplement |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | B3535-500G | reagent |
| Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain | Thermo Scientific | 62248 | nucleic acid stain |
| Thymidine,powder | Sigma-Aldrich | T1985-1G | reagent |
| Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | detergent |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 1540054 | cell dissociation agent |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 07180 | coating reagent |
| ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad | na | flow cytomery |
References
- Hakem, R. DNA-damage repair; the good, the bad, and ugly. EMBO J. 27 (4), 589-605 (2008).
- Gutierrez, R., O'Connor, T. R. DNA direct reversal repair and alkylating agent drug resistance. Cancer Drug Resist. 4 (2), 414-423 (2021).
- Krokan, H. E., Bjoras, M.
- Marteijn, J. A., Lans, H., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J. H. Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 465-481 (2014).
- Li, G. M. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res. 18 (1), 85-98 (2008).
- Hustedt, N., Durocher, D. The control of DNA repair by the cell cycle. Nat Cell Biol. 19 (1), 1-9 (2016).
- Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
- Bhat, D. S., et al. Therapeutic disruption of RAD52-ssDNA complexation via novel drug-like inhibitors. NAR Cancer. 5 (2), zcad018 (2023).
- Gupta, P., Saha, B., Chattopadhyay, S., Patro, B. S. Pharmacological targeting of differential DNA repair, radio-sensitizes WRN-deficient cancer cells in vitro and in vivo. Biochem Pharmacol. 186, 114450 (2021).
- Pena-Diaz, J., et al. Noncanonical mismatch repair as a source of genomic instability in human cells. Mol Cell. 47 (5), 669-680 (2012).
- Schroering, A. G., Edelbrock, M. A., Richards, T. J., Williams, K. J. The cell cycle and DNA mismatch repair. Exp Cell Res. 313 (2), 292-304 (2007).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Genschel, J., Modrich, P. Mechanism of 5'-directed excision in human mismatch repair. Mol Cell. 12 (5), 1077-1086 (2003).
- Hu, J., et al. Nucleotide excision repair in human cells: fate of the excised oligonucleotide carrying DNA damage in vivo. J Biol Chem. 288 (29), 20918-20926 (2013).
- Huertas, P., Jackson, S. P. Human CtIP mediates cell cycle control of DNA end resection and double strand break repair. J Biol Chem. 284 (14), 9558-9565 (2009).
- Keijzers, G., et al. Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in DNA replication with putative roles in cancer. Int J Mol Sci. 20 (1), 74 (2018).
- Symington, L. S. End resection at double-strand breaks: mechanism and regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (8), a016436 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA polymerase beta and flap endonuclease 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair. J Biol Chem. 280 (5), 3665-3674 (2005).
- Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
- Wienholz, F., Vermeulen, W., Marteijn, J. A. Amplification of unscheduled DNA synthesis signal enables fluorescence-based single cell quantification of transcription-coupled nucleotide excision repair. Nucleic Acids Res. 45 (9), e68 (2017).
- Wold, M. S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: single-stranded DNA's first responder: dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. Bioessays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Kang, Y., et al. Alteration of replication protein A binding mode on single-stranded DNA by NSMF potentiates RPA phosphorylation by ATR kinase. Nucleic Acids Res. 51 (15), 7936-7950 (2023).
- Kilgas, S., Kiltie, A. E., Ramadan, K. Immunofluorescence microscopy-based detection of ssDNA foci by BrdU in mammalian cells. STAR Protoc. 2 (4), 100978 (2021).
- Madabhushi, R., Pan, L., Tsai, L. H. DNA damage and its links to neurodegeneration. Neuron. 83 (2), 266-282 (2014).
- Liboska, R., Ligasova, A., Strunin, D., Rosenberg, I., Koberna, K. Most anti-BrdU antibodies react with 2'-deoxy-5-ethynyluridine -- the method for the effective suppression of this cross-reactivity. PLoS One. 7 (12), e51679 (2012).
- Biehs, R., et al. DNA double-strand break resection occurs during non-homologous end joining in G1 but is distinct from resection during homologous recombination. Mol Cell. 65 (4), 671-684.e5 (2017).
- Cruz-Garcia, A., Lopez-Saavedra, A., Huertas, P. BRCA1 accelerates CtIP-mediated DNA-end resection. Cell Rep. 9 (2), 451-459 (2014).
- Ercilla, A., et al. Physiological tolerance to ssDNA enables strand uncoupling during DNA replication. Cell Rep. 30 (7), 2416-2429.e7 (2020).
- Lezaja, A., et al. RPA shields inherited DNA lesions for post-mitotic DNA synthesis. Nat Commun. 12 (1), 3827 (2021).
- Mukherjee, B., Tomimatsu, N., Burma, S. Immunofluorescence-based methods to monitor DNA end resection. Methods Mol Biol. 1292, 67-75 (2015).
- Ochs, F., et al. 53BP1 fosters fidelity of homology-directed DNA repair. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 714-721 (2016).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Forment, J. V., Walker, R. V., Jackson, S. P. A high-throughput, flow cytometry-based method to quantify DNA-end resection in mammalian cells. Cytometry A. 81 (10), 922-928 (2012).
- Mistrik, M., et al. Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique. Sci Rep. 6, 19567 (2016).
- Aten, J. A., Bakker, P. J., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. Histochem J. 24 (5), 251-259 (1992).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-phase labeling of dividing stem cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. Cell proliferation method: click chemistry based on BrdU coupling for multiplex antibody staining. Curr Protoc Cytom. Chapter 7, Unit7.34 (2008).
- Ligasova, A., Koberna, K. Strengths and weaknesses of cell synchronization protocols based on inhibition of DNA synthesis. Int J Mol Sci. 22 (19), 10759 (2021).
