Summary
Följande protokoll presenterar detektion av enkelsträngade DNA-härdar i G1-fasen av cellcykeln med hjälp av cellcykelsynkronisering följt av RPA2 immunofluorescerande färgning.
Abstract
DNA har dedikerade cellulära reparationsvägar som kan hantera lesioner som kan uppstå från både endogena och/eller exogena källor. DNA-reparation kräver samarbete mellan många proteiner, som ansvarar för att täcka ett brett spektrum av uppgifter från att känna igen och signalera närvaron av en DNA-skada till att fysiskt reparera den. Under denna process skapas ofta spår av enkelsträngat DNA (ssDNA), som så småningom fylls av DNA-polymeraser. Karaktären hos dessa ssDNA-spår (både vad gäller längd och antal), tillsammans med polymeras som rekryteras för att fylla dessa luckor, är specifika för reparationsvägar. Visualiseringen av dessa ssDNA-spår kan hjälpa oss att förstå den komplicerade dynamiken i DNA-reparationsmekanismer.
Detta protokoll tillhandahåller en detaljerad metod för framställning av G1-synkroniserade celler för att mäta ssDNA-foci bildning vid genotoxisk stress. Med hjälp av en lättanvänd immunofluorescensmetod visualiserar vi ssDNA genom färgning för RPA2, en komponent i det heterotrimera replikationsproteinet A-komplexet (RPA). RPA2 binder till och stabiliserar ssDNA-intermediärer som uppstår vid genotoxisk stress eller replikation för att kontrollera DNA-reparation och aktivering av DNA-skador vid kontrollpunkt. 5-Ethynyl-2'-deoxiuridin (EdU) färgning används för att visualisera DNA-replikation för att utesluta alla S-fasceller. Detta protokoll ger ett alternativt tillvägagångssätt till de konventionella, icke-denaturerande 5-brom-2'-deoxiuridinbaserade (BrdU)-baserade analyserna och är bättre lämpade för detektion av ssDNA-härdar utanför S-fasen.
Introduction
För att upprätthålla liv kartlägger och reparerar celler ständigt DNA för att upprätthålla sin genomiska integritet. Celler kan ackumulera olika typer av DNA-skador på grund av både endogena (t.ex. oxidation, alkylering, deaminering, replikationsfel) och exogena (t.ex. UV, joniserande bestrålning) källor till DNA-stressfaktorer. Underlåtenhet att reparera dessa lesioner resulterar i antingen apoptos, cellcykelstopp eller åldrande och kan leda till sjukdomar1. DNA-lesioner kan behandlas med någon av följande huvudsakliga DNA-reparationsvägar: DR (direkt reverseringsreparation), som huvudsakligen reparerar alkylerade baser2; BER (base excision repair), som riktar sig mot icke-skrymmande DNA-basfel och enkelsträngade DNA-brott (SSB)3; NER (nukleotidexcisionsreparation) korrigerar skrymmande, helix-förvrängande DNA-lesioner4; MMR (mismatch repair) som främst riktar sig mot DNA-missmatchningar, insättnings-/deletionsslingor (IDL) och vissa basskador5; NHEJ (icke-homolog ändsammanfogning) och HRR (homolog rekombinationsreparation) som båda är aktiva vid dubbelsträngade DNA-brott (DSB)6; och TLS (translesionssyntes), som är en mekanism för förbikoppling av DNA-lesioner7. Även om dessa vägar har distinkta substratspecifika egenskaper, finns det vissa överlappningar mellan dem för att säkerställa redundans för effektiv reparation. Att förstå verkan av de olika DNA-reparationsvägarna i olika cellcykelfaser är avgörande eftersom dessa DNA-reparationsfaktorer kan fungera som viktiga mål för terapeutiska metoder för att behandla cancer, åldrande och neurologiska störningar 8,9.
Enkelsträngat DNA (ssDNA) genereras under hela cellcykeln på grund av reparation av DNA-lesioner som genereras av både endogena och exogena DNA-skadande ämnen. Vid genotoxisk stress genereras ssDNA rikligt i S- och G2-faserna där HRR och MMR har sin högsta aktivitet och när replikationsmaskineriet stannar eller kollapsar vid påträffande av DNA-lesioner 6,10,11. Andra DNA-reparationsvägar (t.ex. NHEJ/mikrohomologimedierad ändsammanfogning (MMEJ)/enkelsträngsglödgning [SSA]) genererar också ssDNA under DSB-reparation12. Dessa ssDNA-spår uppstår vanligtvis från DNA-resektion, utförd av exonukleaser som EXO1, DNA2 och CtIP under HR och MMR, endonukleaser som XPF och XPG under NER, eller genom den kombinerade verkan av POLB och FEN1 under BER 4,13,14,15,16,17,18,19 . På grund av replikationsmaskineriets arbete genereras också ssDNA-spår när DNA-helikaserna lindar upp DNA framför de PCNA-bundna replikativa polymeraserna20. I G1-fasen minskar däremot bristen på HRR och DNA-replikation och den begränsade aktiviteten hos MMR omfattningen av de ssDNA-spår som genereras och är därför mer utmanande att upptäcka 10,11,21.
Cellulära ssDNA-spår är mycket känsliga strukturer som måste skyddas för att undvika att DSB bildas. Detta uppnås genom att belägga ssDNA-spåren med RPA. RPA är ett rikligt förekommande heterotrimert proteinkomplex som består av flera subenheter (RPA1, RPA2 och RPA3, även kallad RPA70, RPA32 respektive RPA14), som uttrycks överallt under hela cellcykeln22. Varje RPA-subenhet innehåller en DNA-bindande domän (DBD), som kan interagera med 4-6 nukleotider, och de kombinerade subenheterna bildar en stabil trimeriseringskärna. Sammantaget binder RPA till cirka 20-30 nukleotider med sub-nanomolär affinitet23,24.
Konventionella metoder använder immunofluorescensmikroskopi (IF) för att visualisera ssDNA-härdar genom att märka 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU) inkorporerat i genomiskt DNA med hjälp av BrdU-antikroppar25. Detta tillvägagångssätt bygger på det faktum att BrdU-antikroppar endast kan detektera BrdU i exponerat ssDNA25. Även om den här metoden är enkel har den också vissa begränsningar. Till exempel förbehandlas celler för att införliva BrdU innan experimentet startar, vilket är tidskrävande och kan störa nedströms effektorer. Därför är BrdU-baserad ssDNA-detektion begränsad till replikerande celler och kan inte användas för vilande celler. Detta utesluter tillämpningen av denna metod för att studera DNA-reparation i icke-replikerande celler trots dess betydelse för flera sjukdomar som cancer och neurodegeneration 5,26. Dessutom, eftersom strukturerna för BrdU och EdU är mycket lika, uppvisar de flesta BrdU-antikroppar korsreaktivitet mot EdU, vilket måste beaktas när man siktar på experiment med dubbel märkning27. RPA-färgning har tidigare använts för att visa ssDNA-fokus, främst i S-fasceller; men vissa artiklar har också framgångsrikt använt det utanför S-fasen 28,29,30,31,32,33,34,35. Följande protokoll utnyttjar effektivt egenskaperna hos RPA, vilket möjliggör visualisering av ssDNA-foci efter DNA-skador i G1-fasen av cellcykeln (även om det kan användas i alla cellcykelfaser).
Protocol
1. Underhåll av hTERT-immortaliserade retinala pigmentepitelceller (RPE1)
- Bibehåll RPE1-cellinjer i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum (Hi-FBS) och 100 μg/ml penicillin-streptomycin (hädanefter kallat odlingsmedium) i en befuktad inkubator med 5 % CO2 vid 37 °C. För rutinmässig odling, odla RPE1-celler i en 15 cm vävnadskulturbehandlad skål och dela när du når 80-90 % sammanflöde (~16-18 × 106 celler per 15 cm skål).
- Vid klyvning, ta bort mediet och skölj cellerna med 10 ml 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Tillsätt 3 ml 0,05 % trypsin-EDTA för att täcka hela skålens yta. Håll cellerna vid 37 °C med trypsinet tills de lossnar.
- Efter trypsinisering återsuspenderas cellerna med odlingsmedium och centrifugeras med 150 × g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT, 22-25 °C). Ta bort supernatanten och återsuspendera försiktigt cellerna i 10 ml odlingsmedium.
- Frö 1,6-1,8 × 106 celler i en ny 15 cm skål (~1 ml av cellsuspensionen).
OBS: Allt vävnadsodlingsarbete bör utföras under BSL-2 säkerhetsnivåer. Inkubationstiden för trypsinisering beror på cellsammanflödet. Vanligtvis tar processen 2-3 minuter att slutföra för en 90% sammanflytande platta. Cellerna bör regelbundet screenas för mykoplasmakontaminering med kommersiellt tillgängliga kit (se exempel i materialförteckningen).
2. Nedbrytning av den berörda genen med siRNA
- Frö 1,0 × 106 RPE1-celler till en 10 cm vävnadskulturbehandlad platta med 10 ml odlingsmedium dagen före transfektionen.
- På dagen för transfektionen, komplex siRNA. För en 10 cm platta, använd en slutlig koncentration på 20 nM siRPA2 och 12 μl lipidbaserat transfektionsreagens i 500 μl transfektionsmedium med låg serumhalt. Blanda försiktigt alla komponenter genom att snärta till röret och inkubera vid RT (22-25 °C) i 5 min.
- Tillsätt den komplexbildade siRNA-blandningen till cellerna droppvis och inkubera cellerna med siRNA i 48 timmar.
3. Synkronisering av RPE1-celler till G0-fas
- Trypsinisera RPE1-cellerna från steg 2.3 enligt beskrivningen i avsnitt 1 (~2 × 106 celler).
- Överför cellsuspensionen till 15 ml centrifugrör och centrifugera den vid 150 × g, RT (22-25 °C) i 5 min.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 12 ml PBS. Centrifugera cellerna vid 150 × g vid RT (22-25 °C) i 5 min. Upprepa avlägsnandet av supernatanten och centrifugeringen två gånger.
- Återsuspendera cellerna i 10 ml serumfritt DMEM kompletterat med 100 μg/ml penicillin-streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 15 mM HEPES och lägg dem på en 10 cm vävnadsodlingsform.
OBS: Om cellerna tenderar att klumpa ihop sig, återsuspendera dem i bara 1 ml serumfri DMEM och pipettera dem upp och ner 5 gånger med en P1000-spets för att få bort klumparna innan suspensionen späds upp till en slutlig volym på 10 ml. - Efter 24 timmars serumsvält införs den andra omgången av nedtystning med samma procedur som beskrivs i avsnitt 2 genom att tillsätta komplexbildande siRNA till de serumsvältande cellerna.
- Förvara RPE1-cellerna i serumfri DMEM i 72 timmar innan du fortsätter till G1-frisättning.
4. Täckglasbeläggning och frigöring av celler i G1-fas
- Sterilisera pincetten med 70 % etanol och placera ett enda glastäcke (12 mm i diameter och #1.5 tjocklek [0.17 mm]) i en brunn med 24 brunnar.
- Späd vitronektinbeläggningsmatrisen med PBS för att erhålla en slutlig koncentration på 10 μg/ml. Tillsätt 500 μl vitronektinlösning i varje brunn med täckglasen och inkubera i 1 timme vid RT.
- Ta bort beläggningslösningen och tvätta täckglasen med 1 ml PBS.
- Lossa de serumsvultna RPE1-cellerna från den 10 cm vävnadsodlade behandlade plattan med 1 ml 0,05 % trypsin efter en PBS-tvätt i 1 minut vid 37 °C.
OBS: Cellerna lossnar mycket snabbare efter serumsvält. Var försiktig när du tvättar cellerna med PBS och använd korta trypsiniseringstider. - För att inaktivera trypsinet, återsuspendera RPE1-cellerna i totalt 6 ml odlingsmedium. Ta bort det inaktiverade trypsinet genom att snurra ner cellerna med 150 × g vid RT (22-25 °C) i 5 minuter.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml odlingsmedium och mät cellantalet.
- Kärna ur 4 ×10 4 RPE1-celler på den belagda täckglaset i totalt 500 μL odlingsmedium.
OBS: Se till att cellviabiliteten är över 90 % innan du fortsätter till nedströmssteg. Cellviabiliteten kunde snabbt bedömas genom trypanblå färgning under cellräkningssteget. - Efter 6 timmars plätering av cellerna i odlingsmediet kommer G0-frisatta celler att befinna sig i tidig G1-fas. Utför experiment i G1 i detta 6-12 timmars fönster innan cellerna börjar gå in i S-fas.
- Innan DNA-skador tillförs, pulsera cellerna med 10 μM 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU) i 30 minuter vid 37 °C, utspätt i odlingsmedium.
- Ta bort mediet som innehåller EdU och jaga cellerna med 10 μM tymidin i 10 minuter vid 37 °C för att förhindra kvarvarande EdU-inkorporering under DNA-skadeinduktion.
- Ta bort mediet med tymidin och behandla cellerna med 250 μM H2O2 i 1 timme, utspätt i odlingsmedium.
5. Immunofluorescensfärgning av ssDNA
- Tvätta cellerna en gång med 1 ml RT (22-25 °C) PBS för att avlägsna mediet och serumkomponenterna.
OBS: Var försiktig när du tvättar cellerna för att undvika att de lossnar och torkar. Bearbeta inte många brunnar samtidigt. - Förextraktion: Inkubera de tvättade cellerna i 1 ml CSK-extraktionsbuffert (tabell 1) i 5 minuter vid RT (22–25 °C).
OBS: CSK pre-extraction tar bort alla icke-kromatinbundna proteiner, inklusive löslig RPA2.
VARNING: Triton X-100 är skadligt vid förtäring och kan orsaka hudirritation och ögonskador. - Ta bort CSK-bufferten från cellerna och fixera dem direkt genom att tillsätta 0,5 ml 3,6 % paraformaldehydlösning (i PBS) innehållande 0,05 % Triton X-100 i 10 min vid RT (22-25 °C).
VARNING: Det är viktigt att förbereda 3,6 % PFA från 32 % PFA-buljong färskt. Paraformaldehyd kan orsaka allvarliga ögonskador, hudirritation och irritation i luftvägarna. - Tvätta cellerna en gång med 1 ml PBS innehållande 0,05 % Triton X-100 för att ta bort PFA.
- Permeabilisera cellerna ytterligare med 1 ml PBS innehållande 0,5 % Triton X-100 i 15 minuter vid RT (22-25 °C).
- EdU click-IT-reaktion för att visualisera replikerande celler (S-fas)
- Ta bort permeabiliseringslösningen och tvätta cellerna 2 gånger med 1 ml blockerande buffert (tabell 1).
VARNING: Bovint serumalbumin (BSA) kan orsaka irritation i luftvägarna. - Tillsätt 1 ml blockeringsbuffert (tabell 1) och gunga försiktigt plattan med täckglas i 10 minuter vid RT (22-25 °C).
- Ta bort blockeringsbufferten och tillsätt 500 μl klickreaktionscocktail innehållande pikolylazid 647 (tabell 1). Inkubera täckglasen i 30 minuter vid RT (22-25 °C) med försiktig gungning och utför nedströms inkubationer i mörker.
OBS: När du använder BrdU-antikroppar, använd dubbelt så mycket (1 ml) och tid (60 min) för klickreaktionen som rekommenderas av tillverkaren för att säkerställa att reaktionen är mättad och den inkorporerade EdU är märkt. Detta begränsar korsreaktiviteten hos BrdU-antikropparna27.
- Ta bort permeabiliseringslösningen och tvätta cellerna 2 gånger med 1 ml blockerande buffert (tabell 1).
- Ta bort klickreaktionsblandningen och tvätta cellerna 2x med PBS med 0,05 % Triton X-100 i 10 minuter vid RT (22-25 °C) (figur 1 och figur 2).
- Tillsätt 1 ml blockerande buffert och inkubera vid RT (22–25 °C) i 30 minuter. Alternativt kan cellerna förvaras i en blockerande buffert vid 4 °C över natten.
- Applicera primär antikropp (anti-RPA2 råtta, 1:1 000 spädning) i 2 timmar vid RT (22–25 °C) i 250–500 μl blockerande buffert med försiktig gungning.
- Tvätta cellerna 2 gånger med PBS innehållande 0,05 % Triton X-100 för att snabbt avlägsna det mesta av antikroppslösningen.
- Fortsätt tvätta cellerna i 3 x 10 minuter med blockerande buffert vid RT (22-25 °C).
- Applicera sekundär antikropp (anti-rat Alexa-488, 1:1 000 utspädning) i 250-500 μL blockerande buffert vid RT (22-25 °C) i 2 timmar med försiktig gungning.
- Tvätta cellerna med blockerande buffert 2x för att snabbt avlägsna det mesta av den sekundära antikroppen. Fortsätt tvätta cellerna i 3 x 10 minuter med PBS innehållande 0,05 % Triton X-100 vid RT (22-25 °C).
- För att motfärga kärnorna, tvätta cellerna en gång med PBS innehållande 0,05 % Triton X-100 och 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 10 minuter vid RT (22-25 °C). Tvätta cellerna en gång med PBS i 5 minuter vid RT (22-25 °C).
- Montera täckglaset på objektglasen med 10 μL monteringsmedium/täckglas. Doppa täckglasen i destillerat vatten innan montering för att bli av med eventuella saltkristaller. Ta en bild av objektglasen följande dag och förvara dem vid 4 °C i flera veckor (figur 3).
6. Bildinsamling och kvantifiering
- För att ta bilder, använd alla tillgängliga epifluorescerande mikroskop utrustade med rutinfilteruppsättningar för att avbilda DAPI-, FITC- och Cy5-kanaler med minst 60-63x förstoring, hög numerisk bländare och oljemål för att visualisera nukleära fokus.
OBS: Optimal DAPI-excitation är ~359 nm; Alexa 488 excitation är ~488 nm; medan Alexa 647-excitation är ~647 nm. - För bildanalys, öppna bildfiler i Fiji/ImageJ.
- Gör nukleära masker med hjälp av DAPI-färgningen (Figur 4A-F och kompletterande video S1).
- Öppna DAPI-avbildningen.
- Välj Process | Förbättra kontrast och ställ in mättad pixel på 0,35.
- Klicka på Process | Binär | Konvertera till mask. Välj binär | Fyll hålen och klicka på Analysera | Analysera partiklar. Ställ in storleken på 10-Infinity.
- I ROI-hanteraren klickar du på Visa alla.
- Hitta RPA2-härdar i kärnan (Figur 4G,H och kompletterande video S1)
- Öppna RPA2-avbildningen.
- Välj Process | Hitta Maxima. Ställ in prominensen på ett värde som markerar RPA2-fokuset (mellan 500 och 750) och separerar det från bakgrunden.
- Klicka slutligen på knappen Mät i ROI Manager.
- Beräkna det totala antalet kärn-ssDNA-fokusområden genom att dividera värdet i RawinDen-kolumnen med 255 (det maximala värdet för pixelintensitet i varje fokus).
- Utför statistisk analys med hjälp av det föredragna statistiska programvaruverktyget.
OBS: Uteslut alla EdU-positiva celler och felaktigt segmenterade DAPI-masker från analysen.
- Gör nukleära masker med hjälp av DAPI-färgningen (Figur 4A-F och kompletterande video S1).
Representative Results
För att övervinna begränsningarna med att detektera ssDNA i G1 använde vi RPA2, vilket förbättrar både specificiteten och intensiteten av ssDNA-foci detektion35. För att uppnå exakt cellsynkronisering använde vi RPE1-celler som effektivt kan serumsvälta och synkroniseras in i G0-fasen. De kan sedan förmås att återinträda i cellcykeln genom tillsats av serum efter serumdeprivation. För att bekräfta synkroniseringseffektiviteten märkte vi cellerna med EdU och deras DNA-innehåll med propidiumjodid. Vi samlade vidare in kvalitativa och kvantitativa resultat via flödescytometri (tilläggsfigur S1A). Punktdiagrammen visar att efter 72 timmars serumsvält är ~98% av cellerna i G0-fas. Efter tillsats av seruminnehållande media i 6 timmar återgår cellerna till cellcykeln (vilket framgår av ökningen av p27-nivåerna i figur 1A), med ~97 % av cellerna i G1, medan de bara har <1 % celler i S-fasen, <2 % celler i G2-fasen (tilläggsfigur S1A). Efter 20-28 timmars tillsats av serum till cellerna passerar de gradvis genom S-fasen, vilket visas av flödescytometridiagrammen (tilläggsfigur S1A). Detta cellsynkroniseringsprotokoll ger en ~97 % ren G1-population (6 timmar efter serumtillsats efter 72 timmars serumsvält). För att ytterligare validera synkroniseringseffektiviteten jämförde vi uttrycket av cellcykelmarkörer efter serumfrisättning med hjälp av western blotting (Figur 1A och Supplementary Figur S1B) och utförde parallellt en EdU-inkorporeringsanalys för att visualisera DNA-replikation. EdU-färgningen belyser också synkroniseringseffektiviteten och bristen på DNA-replikation i G1-fasen (Figur 1B,C).
Konventionella metoder för att detektera ssDNA i däggdjursceller bygger på detektion av BrdU i ssDNA. Figur 2A visar att vid behandling medH2O2och neokarzinostatin (NCS) kunde BrdU-härdarna endast detekteras i S-fasceller, medan inga ssDNA-foci kunde detekteras i celler i icke-S-fas. BrdU-antikroppsfärgningen visade också en märkbar nukleolär bakgrundsfärgning som kunde detekteras i alla kärnor, oberoende av cellcykelstadiet eller de behandlingar som tillämpades. Med hjälp av EdU-klickprotokollet som beskrivs här kunde vi inte upptäcka samlokalisering av EdU- och BrdU-fokus, vilket är tydligt i de obehandlade proverna i figur 2A. För att helt utesluta alla BrdU-signaler som uppstod från korsreaktivitet undvek vi EdU-märkning och använde istället cyklin A2 som en S-G2-markör. Cyklin A2-färgning tillät dock inte CSK-förextraktion, och under detta tillstånd såg vi inga BrdU-fokus, inte ens efter genotoxisk stress (tilläggsfigur S2A). Detta belyser det faktum att förextraktion av CSK är nödvändig för anti-BrdU-baserad ssDNA-färgning. Som en kontroll testade vi BrdU-antikroppsfärgning under denatureringsförhållanden. Detta öppnar DNA:t för att exponera den inkorporerade BrdU, vilket avslöjar att BrdU var likformigt inkorporerad (Tilläggsfigur S2B).
Däremot visar RPA2-färgning NCS- och H2O-2-beroende foci bildning inte bara i S-fasen utan även i andra cellcykelfaser (Figur 2B). Som en kontroll behandlade vi också cellerna med HU, vilket endast orsakar ssDNA-ackumulering i celler som genomgår replikation. Som förväntat upptäckte vi endast en signalökning vid HU-behandling med RPA2-antikroppen i EdU-positiva celler, vilket belyser specificiteten i detta tillvägagångssätt. RPA2-antikroppen kan också detektera naturligt förekommande ssDNA-bildning under replikation i frånvaro av exogen genotoxisk stress (Figur 2B). Den mycket känsliga karaktären hos RPA2-antikroppen fick oss att försöka använda den i G1-fasen där konventionell BrdU-färgning misslyckades med att detektera någon signal vid genotoxisk stress (tilläggsfigur S2C). Figur 3A visar att bildandet av ssDNA-härdar vidH2O2-behandlingkunde detekteras vid användning av en anti-RPA2-antikropp, även i G1. Det var en signifikant ökning av antalet RPA2-härdar i dessa kärnor vid H2O2-behandling (Figur 3B). Dessa fokusområden var specifika för RPA2 eftersom nedtystning av RPA2 avskaffade IF-signalen (figur 3A,B). Figur 3C och kompletterande figur S1C visar effektiviteten av RPA2-ljuddämpning i dessa celler. Jämfört med konventionella metoder är RPA2-baserad detektion av ssDNA mycket känslig, och dess tillämpning kan därför utvidgas till G1-fasceller.
Figur 1: Synkroniseringseffektivitet hos RPE1-celler efter serumsvält. (A) Immunoblots visar indikerade proteinnivåer i asynkrona, G1- och S-fassynkroniserade RPE1-celler. (B) Representativa bilder visar asynkrona, G1- och S-fassynkroniserade RPE1-celler som exponerades för 10 μM EdU i 30 minuter före fixering och visualiserades genom Click-IT-reaktion. DAPI användes för att motfärga kärn-DNA. Skalstaplar = 50 μm. (C) Diagrammet visar procentandelen EdU-positiva celler av den totala cellpopulationen bedömd med DAPI. Felstapeln representerar standardfelet för medelvärdet, och det analyserade antalet kärnor var följande: AS n = 219, G1 n = 630, S n = 437. Förkortningar: RPE1 = hTERT-immortaliserade retinala pigmentepitelceller; AS = asynkron; EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin, DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: ssDNA-detektion med antingen BrdU-antikropp eller RPA2-antikropp vid DNA-skada. (A) Representativa bilder illustrerar ssDNA-foci med αBrdU (grön), S-fasceller markeras med EdU (lila) och DAPI användes för att motfärga kärn-DNA (blått). RPE1-celler förvarades i 10 μM BrdU i 48 timmar före eventuell ytterligare behandling. Efter 48 timmar pulserades cellerna med 10 μM EdU i 30 minuter följt av behandling med H2O2 (250 μM) i 1 timme eller Neocarzinostatin (0,5 μg/ml) i 4 timmar. Cellerna fixerades efter förextraktionen av CSK. En vit streckad linje anger gränsen för varje kärna. Skalstapel = 5 μm. Panelerna till höger är förstorade bilder av de angivna kärnorna i S-fasen eller icke-S-fasen. (B) Representativa bilder illustrerar ssDNA-foci med αRPA2-antikropp (grön). S-fasceller markeras av EdU (lila), och DAPI användes för att motfärga kärn-DNA (blått). RPE1-celler pulserades med 10 μM EdU i 30 minuter följt av antingen 1 h H2O2 (250 μM), 4 timmar Hydroxyurea (2 mM) eller 4 timmar NCS (0,5 μg/ml). Cellerna fixerades efter förextraktionen av CSK. En vit streckad linje anger gränsen för varje kärna. Skalstapel = 10 μm. Panelerna till höger är förstorade bilder av de angivna kärnorna i S-fasen eller icke-S-fasen. Förkortningar: ssDNA = enkelsträngat DNA; BrdU = 5-brom-2'-deoxiuridin, DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; RPE1 = hTERT-immortaliserade retinala pigmentepitelceller; EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin, NCS = Neokarzinostatin; HU = hydroxiurea. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Detektion av ssDNA-härdar i G1-fas med RPA2-antikropp. (A) RPE1-celler transfekterades med antingen siRNA som riktar sig mot RPA2 eller en icke-målsökande siRNA-kontroll, och synkroniserades därefter i G1 och pulsmärktes med 10 μM EdU i 30 minuter innan de behandlades med H2O2 (250 μM) i 1 timme där så är indicerat. DAPI användes för att motfärga kärn-DNA. Cellerna fixerades efter förextraktionen av CSK. En vit streckad linje anger gränsen för varje kärna. Skalstapel = 5 μm. (B) Mätningarna av antalet RPA2-fokus/kärna utfördes från två oberoende experiment. Endast EdU-negativa celler beaktades under analysen. Linjer representerar medelvärdet på diagrammen. Icke-parametriskt ANOVA-test (Kruskal-Wallis) utfördes för statistisk analys. Stjärnorna indikerar P < 0,0001. Det analyserade antalet kärnor var följande: siNT nr H2O2 n = 513, siNT H2O2 n = 603, siRPA2 no H2O2 n = 266, siRPA2 H2O2 n = 536. (C) Effektiviteten av siRNA-knockdown visas i immunoblot. Förkortningar: siNT = icke-målsökande siRNA-kontroll; BrdU = 5-brom-2'-deoxiuridin, DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; RPE1 = hTERT-immortaliserade retinala pigmentepitelceller; EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kvantifiering av ssDNA-härdar med hjälp av Fiji. Detaljerade steg i Fiji som visar hur man bedömer RPA2-foci i kärnan. (A-E) Skapandet av en nukleär mask med hjälp av DAPI-kanalen. (F-H) Tröskelvärde för att identifiera enskilda kärn-ssDNA-fokusområden från bakgrundssignalen. Förkortningar: ssDNA = enkelsträngat DNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Cytoskelettbuffert (CSK) | |
| RÖR pH 7,0 | 10 mM |
| NaCl | 100 mM |
| EDTA pH 8 | 1 mM |
| MgCl2 | 3 m² |
| D-sackaros | 300 mM |
| Triton X-100 | 0.20% |
| Cocktail av fosfatashämmare | 1 tablett per 10 ml |
| Cocktail med proteashämmare | 1 tablett per 10 ml |
| utspädd i ddH2O | n/a |
| Tvätt buffert | |
| Triton X-100 | 0.05% |
| utspädd i PBS | n/a |
| Buffert för permeabilisering | |
| Triton X-100 | 0.50% |
| utspädd i PBS | n/a |
| Fixering lösning | |
| Paraformaldehyd | 3.60% |
| Triton X-100 | 0.05% |
| utspädd i PBS | n/a |
| Blockera buffert | |
| Serumalbumin från nötkreatur (BSA) | 5% |
| Triton X-100 | 0.10% |
| utspädd i PBS | n/a |
| Click-iT Plus reaktionscocktail | |
| 1x Click-iT-reaktionsbuffert | 435 ml |
| Alexa Fluor PCA-lösning | 5 ml |
| CuSO 4-kopparskyddsmedel förblandning | 10 ml |
| 1x Click-iT bufferttillsats | 50 ml |
| Total volym | 500 ml |
Tabell 1: Sammansättningen av de buffertar som används i detta protokoll.
Kompletterande figur S1. (A) RPE1-celler synkroniserades till G0-fas med hjälp av serumsvält i 72 timmar och frisattes därefter i olika cellcykelfaser genom återinförande av serum. Punktdiagram visar celler i G0/G1-, S- eller G2/M-faser, där timmarna anger tiden efter återinsättning av serum efter serumsvält. Diagrammet till höger visar procentandelen G0/G1-, S- och G2/M-celler i varje villkor. FACS-analysen utfördes med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt cellproliferationskit med EdU och propidiumjodid enligt tillverkarens rekommendationer. (B) Obeskurna western blot-skanningar för figur 1. Siffrorna visar molekylviktsmarkörer i kDa. PARP1 användes som belastningskontroll och belastades på gelen som också utvecklades mot CCNA2, p27 (ytterligare avskalad för PCNA) och pH3 (S10) (ytterligare avskalad för H3) genom att skära upp membranet. CCNB1 och RPA2 laddades på en separat gel med samma mängd proteinlysat för att säkerställa jämförbarhet. (C) Obeskurna western blot-skanningar för figur 3. Siffrorna visar molekylviktsmarkörer i kDa. Förkortning: EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfigur S2: (A) Representativa bilder illustrerar ssDNA-härdar med hjälp av BrdU-antikroppar (gröna); S-fasceller markeras av cyklin A2 (röd); och DAPI användes för att motfärga kärn-DNA (blått). RPE1-celler hölls i 10 μM BrdU i 48 timmar före vidare behandling. Efter 48 timmar behandlades cellerna medH2O2(250 μM) i 1 timme eller Neokarzinostatin (0,5 μg/ml) i 4 timmar före fixering. En vit streckad linje anger gränsen för varje kärna. Skalstapel = 5 μm. (B) BrdU-färgning av RPE1-celler med och utan denatureringsbeting. Asynkrona RPE1-celler förbehandlades med 10 μM BrdU i 48 timmar. Skalstapel = 10 μm. (C) Mätningarna av antalet BrdU-härdar/kärnor utfördes från två oberoende experiment i G1-synkroniserade RPE1-celler. Endast EdU-negativa celler beaktades under analysen. Linjer representerar medelvärdet på diagrammen. Icke-parametriskt ANOVA-test (Kruskal-Wallis) utfördes för statistisk analys. "ns" indikerar icke-signifikant skillnad. Det analyserade antalet kärnor var följande: NT n = 52, NCS n = 105, H2O2 n = 82. Förkortningar: siNT = icke-målsökande siRNA-kontroll; BrdU = 5-brom-2'-deoxiuridin, DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; RPE1 = hTERT-immortaliserade retinala pigmentepitelceller; NCS = Neokarzinostatin. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video S1: Skärminspelning av Fiji-baserad RPA2-fokusanalys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Att upprätthålla en frisk, mykoplasmafri cellkultur är avgörande för alla experiment som beskrivs ovan. RPE1-celler har en stark bindning till vävnadskulturbehandlade plastvaror under normala odlingsmedier; Deras bindningsegenskaper minskar dock avsevärt när de förvaras i serumfria förhållanden. Dessutom, för att ta högupplösta bilder av ssDNA-foci under ett mikroskop, måste cellerna pläteras på ett 0,17 mm tjockt täckglas, vilket inte är tillräckligt hydrofilt för att stödja korrekt bindning av RPE1-celler. Utan ordentligt tillplattade och jämnt fördelade celler är det mycket utmanande att visualisera enskilda ssDNA-fokus. Därför är det viktigt att välja rätt beläggningsmaterial (t.ex. vitronektin) och att lämna tillräckligt med tid (6-12 timmar) för cellerna att sprida sig och fästa efter att ha släppt dem i G1-fasen.
En utmanande del av protokollet är att få homogena G1-synkroniserade RPE1-celler. Detta kräver två kritiska steg. För att serumsvälten ska bli effektiv måste cellerna trypsiniseras, tvättas noggrant med PBS och sås direkt på nya vävnadsodlingsskålar med hjälp av serumfria medier. Att tvätta cellerna direkt i vävnadsodlingsskålar för att avlägsna serumet ger inte effektiv G0-synkronisering. För det andra, när celler släpps in i G1-fas, måste cellerna trypsiniseras igen och sås på färska vävnadsodlingsplattor. På samma sätt kommer det inte att resultera i en synkron G1-post att bara byta medium och tillsätta seruminnehållande odlingsmedium till cellerna. Dessutom, för korrekt G1-inträde, måste sådddensiteten för cellerna på de belagda täckglasen vara på vissa sammanflödesnivåer. Även om perfekt cellsynkronisering i allmänhet är ouppnåelig, ger detta synkroniseringsprotokoll som beskrivs här en ~97 % ren G1-population. Den rekommenderade sådddensiteten för RPE1 på ett täckglas med en diameter på 12 mm är ~4 × 104 för att få ett homogent synfält för avbildning, med cirka 70 % sammanflöde. Högre sådddensitet gör att cellerna lossnar och "skalas av" efter CSK-extraktion och kommer att resultera i en högre bakgrundssignal under bildinsamlingen.
För att minska eventuella bakgrundssignaler och uppnå ett gynnsamt signal-brusförhållande är noggrann tvättning efter primär och sekundär antikroppsinkubation avgörande. Eftersom många tvättsteg ska tillämpas är det också viktigt att förhindra att brunnen torkar ut under varje tvättsteg. Vi minimerar denna artefakt genom att applicera minst 0,05 % Triton X-100 i alla tvätt- och inkubationssteg. När brunnarna torkade ut uppvisade cellerna ett förändrat signal-brusförhållande; Detta leder till ett mosaikliknande mönster under mikroskopet och kan störa utvärderingen. Z-stackbildtagning i kombination med dekonvolution kan hjälpa till att fånga fokuspunkter i olika fokalplan för att förbättra analysen.
Konventionella metoder bygger på detektion av inkorporerat BrdU under icke-denaturerande förhållanden. Dessa metoder är dock beroende av förbehandling av cellerna med höga doser av BrdU under minst 1-2 dagar (eller en tid som motsvarar en hel cellcykel i den cellinje som används) för att säkerställa en enhetlig genomisk inkorporering. Oönskat kan omfattande BrdU-inkorporering orsaka cellcykelstörningar36. För att ta itu med dessa begränsningar använder denna metod endogen RPA2 för att upptäcka ssDNA-fokus. Detta tillvägagångssätt kräver inte replikationsdriven BrdU-inkorporering, det kan också användas i postmitotiska celler. Eftersom omfattande BrdU-inkorporering inte behövs sparar detta tid och minskar den experimentella komplexiteten. Genom att använda RPA2-färgning för att visualisera ssDNA kan vi använda 2′-deoxy-5-etynyluridin (EdU) och klickkemi för att markera DNA-replikation samtidigt som vi undviker eventuell korsreaktivitet av BrdU-antikropparna mot EdU 27,37,38. Särskild försiktighet måste iakttas för att maskera den inkorporerade EdU ordentligt under klickreaktionen så att BrdU-antikropparna inte korsreagerar med EdU27,39.
Slutligen är en viktig fördel med att använda RPA2 istället för BrdU att helt enkelt ha ett överlägset signal-brusförhållande jämfört med BrdU-färgning utanför S-fasen. Vi fann att den icke-denaturerande BrdU-färgningen och dess förmåga att visualisera ssDNA är begränsad till S-fasen även i replikerande celler (Figur 2). BrdU-antikroppar binder endast till den tillräckligt exponerade BrdU i ssDNA-sträckningar. Bindningen av reparationsproteiner, inklusive RPA2, till ssDNA-sträckningarna kan undertrycka eller hämma tillräcklig exponering av BrdU i ssDNA. Vi fann också att CSK-pre-extraktion är nödvändig för ssDNA-visualisering med BrdU-antikroppar. Detta är möjligt eftersom ssDNA-spåren inte är tillgängliga för antikroppen utan att ta bort lätt bundna proteinkomponenter från dem.
Det finns dock vissa begränsningar som är förknippade med detta protokoll. En begränsning med att använda RPA2 för ssDNA-detektion är behovet av att optimera CSK-förextraktionssteget. Obunden, överskott av RPA2 måste tvättas bort från DNA:t innan cellerna fixeras. Å ena sidan leder underextraktion till en hög bakgrund på grund av RPA2-proteinfraktionen som inte är bunden till ssDNA. Å andra sidan kommer överextraktion att leda till signalförlust. För BrdU-detektion är detta inte en variabel eftersom BrdU är stabilt inkorporerat i DNA och inte kan tvättas bort genom förextraktion. Därför måste tidpunkten för förextraktionen av förextraktionen, mängden Triton X-100 i bufferten, volymen och temperaturen vid vilken förextraktionen utförs noggrant övervägas. CSK-förextraktion begränsar också användningen av kärnstorlek för att skilja G0/G1-celler från S/G2-celler.
Dessutom kan vi inte utesluta möjligheten att en del av signalen som kommer från RPA2 kommer från att den är bunden till andra kromatinbindande proteininteraktorer. Man måste också ta hänsyn till artspecificiteten hos RPA2-antikroppen. Antikroppen som används i detta protokoll kan känna igen RPA2 från människor, möss, råttor, hamstrar och apor. En annan begränsning med detta tillvägagångssätt är att inte alla cellinjer kan vara serumsvältfödda för G0-synkronisering. De flesta cancercellinjer kan kringgå cellcykelns kontrollpunkter och föröka sig även i serumberövade medier. Även om serumsvält är fördelaktigt, eftersom det inte orsakar DNA-skador, måste man noggrant övervaka deras cellsynkroniseringseffektivitet för att se till att korrekt cellcykelfasanrikning uppnås. För celler som inte svarar på serumdeprivation måste andra cellsynkroniseringsmetoder övervägas (t.ex. mitotisk avskakning, CDK1-hämning för G2-arrestering eller icke-invasiva tekniker såsom centrifugaleluering). En annan möjlig metod är att använda high-content imaging för att mäta EdU- och kärn-DNA-innehåll för cellcykelprofilering av asynkrona celler31. Man måste överväga konsekvenserna av att använda alternativa synkroniseringsmetoder för att förhindra störningar i nedströmsanalys. Till exempel kommer användningen av dubbelt tymidinblock eller aficiolin, som ofta används i litteraturen, att resultera i replikationsstress och DNA-skador40.
Undersökningen av DNA-reparationsmekanismer fortsätter att vara i fokus för diskussionen inom områdena cancer och cellbiologi. Protokollet som presenteras här erbjuder ett värdefullt tillvägagångssätt för beredning av celler, vilket möjliggör visualisering och kvantitativ analys av ssDNA vid exponering för DNA-skadande ämnen. Detta protokoll belyser särskilt användningen av det ssDNA-bindande proteinet, RPA2, vilket visar dess höga specificitet för att visualisera små mängder ssDNA-foci samtidigt som oönskad korsreaktivitet i alla cellcykelns faser undviks. Att använda RPA2 ger många fördelar, särskilt för forskare som vill analysera celler i G1-fasen av cellcykeln. Detta protokoll tar hänsyn till flera begränsningar och tar itu med problem relaterade till signalstörningar, oönskat bakgrundsbrus och korsreaktivitet vid användning av RPA2- eller BrdU-färgning för att detektera ssDNA.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att deklarera.
Acknowledgments
Författarna tackar Michele Pagano för hans stöd och hjälpsamma insikter, Ashley Chui och Sharon Kaisari för att de kritiskt läst manuskriptet och Jeffrey Estrada och Vilma Diaz för deras kontinuerliga stöd. Detta arbete stöddes av ett mångfaldstillägg till National Institutes of Healths anslag GM136250.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6074 | primary antibody (1:5,000) |
| Axio Observer Inverted Microscope | Zeiss | na | microscope |
| Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% | Invitrogen | NW04127BOX | Western Blot |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | blocking |
| BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | nucleotide analogue |
| BrdU antibody BU1/75 | Abcam | ab6326 | primary antibody (1:500) |
| CellAdhere Dilution Buffer | Stemcell Technologies | 07183 | coating reagent |
| Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits | Invitrogen | C10632 | flow cytomery |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10640 | click-reaction kit |
| cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 5892791001 | reagent |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX2000 | cell counter |
| Coverslip | neuVitro | GG12PRE | tissue culture |
| Cyclin A2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-271682 | primary antibody (1:1,000) for IF and WB |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | primary antibody (1:5,000) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | vehicle control |
| DMEM, high glucose, with HEPES | Gibco | 12430051 | cell culture medium for RPE cells |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | the PBS used throughout the protocol |
| D-Sucrose | Thermo Fisher Scientific | bp220-1 | reagent |
| Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope | Nikon | na | microscope |
| EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) | Thermo Fisher Scientific | C10637 | nucleotide analogue |
| Falcon 24-well plate | Corning | 351147 | tissue culture |
| Falcon Cell Culture Dishes 100 mm | Corning | 353003 | tissue culture |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 16140071 | media supplement |
| Fiji (ImageJ) | NIH | version 1.54f | software and algorithms |
| FxCycle PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | PI staining |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | secondary antibody (1:1,000) |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A48262 | secondary antibody (1:1,000) |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | primary antibody (1:10,000) |
| hTERT RPE1 | ATCC | CRL-3216 | cell line |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | reagent |
| Hydrogen peroxide 30% soultion | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | reagent |
| Hydroxyurea,98% powder | Sigma-Aldrich | H8627-5G | reagent |
| Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15-575-020 | reagent |
| Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | transfection reagent |
| Magnesium chloride solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | reagent |
| MycoFluor | Thermo Fisher | M7006 | Mycoplasma Detection Kit |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma-Aldrich | N9162-100UG | reagent |
| NuPage MES SDS Running Buffer (20x) | Invitrogen | NP0002 | Western Blot |
| onTARGETplus Human RPA2 siRNA | Dharmacon | L-017058-01-0005 | siRNA |
| p27 antibody | BD Biosciences | 610241 | primary antibody (1:1,000) |
| Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | 50-980-494 | fixative |
| PARP1 antibody | Cell Signaling Technology | 9542S | primary antibody (1:1,000) |
| PCNA antibody | Cell Signaling Technology | 13110S | primary antibody (1:2,000) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | media supplement |
| pH3 antibody | Cell Signaling Technology | 3377S | primary antibody (1:2,000) |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 4906837001 | reagent |
| PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 | Bioworld | 41620034-1 | reagent |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610395 | Western Blot |
| Prism | GraphPad | version 10 | statistical analysis and graph |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | mounting media |
| Reduced serum media (Opti-MEM) | Gibco | 31985070 | used for transfection |
| Rpa32/rpa2 antibody (mouse) | EMD Millipore | NA19L | primary antibody (1:1,000) for WB |
| Rpa32/rpa2 antibody (rat) | Cell Signaling Technology | 2208S | primary antibody (1:1,000) for IF |
| Sodium Chloride solution (5 M) | Sigma-Aldrich | S5150 | reagent |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | media supplement |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | B3535-500G | reagent |
| Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain | Thermo Scientific | 62248 | nucleic acid stain |
| Thymidine,powder | Sigma-Aldrich | T1985-1G | reagent |
| Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | detergent |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 1540054 | cell dissociation agent |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 07180 | coating reagent |
| ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad | na | flow cytomery |
References
- Hakem, R. DNA-damage repair; the good, the bad, and ugly. EMBO J. 27 (4), 589-605 (2008).
- Gutierrez, R., O'Connor, T. R. DNA direct reversal repair and alkylating agent drug resistance. Cancer Drug Resist. 4 (2), 414-423 (2021).
- Krokan, H. E., Bjoras, M.
- Marteijn, J. A., Lans, H., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J. H. Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 465-481 (2014).
- Li, G. M. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res. 18 (1), 85-98 (2008).
- Hustedt, N., Durocher, D. The control of DNA repair by the cell cycle. Nat Cell Biol. 19 (1), 1-9 (2016).
- Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
- Bhat, D. S., et al. Therapeutic disruption of RAD52-ssDNA complexation via novel drug-like inhibitors. NAR Cancer. 5 (2), zcad018 (2023).
- Gupta, P., Saha, B., Chattopadhyay, S., Patro, B. S. Pharmacological targeting of differential DNA repair, radio-sensitizes WRN-deficient cancer cells in vitro and in vivo. Biochem Pharmacol. 186, 114450 (2021).
- Pena-Diaz, J., et al. Noncanonical mismatch repair as a source of genomic instability in human cells. Mol Cell. 47 (5), 669-680 (2012).
- Schroering, A. G., Edelbrock, M. A., Richards, T. J., Williams, K. J. The cell cycle and DNA mismatch repair. Exp Cell Res. 313 (2), 292-304 (2007).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Genschel, J., Modrich, P. Mechanism of 5'-directed excision in human mismatch repair. Mol Cell. 12 (5), 1077-1086 (2003).
- Hu, J., et al. Nucleotide excision repair in human cells: fate of the excised oligonucleotide carrying DNA damage in vivo. J Biol Chem. 288 (29), 20918-20926 (2013).
- Huertas, P., Jackson, S. P. Human CtIP mediates cell cycle control of DNA end resection and double strand break repair. J Biol Chem. 284 (14), 9558-9565 (2009).
- Keijzers, G., et al. Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in DNA replication with putative roles in cancer. Int J Mol Sci. 20 (1), 74 (2018).
- Symington, L. S. End resection at double-strand breaks: mechanism and regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (8), a016436 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA polymerase beta and flap endonuclease 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair. J Biol Chem. 280 (5), 3665-3674 (2005).
- Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
- Wienholz, F., Vermeulen, W., Marteijn, J. A. Amplification of unscheduled DNA synthesis signal enables fluorescence-based single cell quantification of transcription-coupled nucleotide excision repair. Nucleic Acids Res. 45 (9), e68 (2017).
- Wold, M. S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: single-stranded DNA's first responder: dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. Bioessays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Kang, Y., et al. Alteration of replication protein A binding mode on single-stranded DNA by NSMF potentiates RPA phosphorylation by ATR kinase. Nucleic Acids Res. 51 (15), 7936-7950 (2023).
- Kilgas, S., Kiltie, A. E., Ramadan, K. Immunofluorescence microscopy-based detection of ssDNA foci by BrdU in mammalian cells. STAR Protoc. 2 (4), 100978 (2021).
- Madabhushi, R., Pan, L., Tsai, L. H. DNA damage and its links to neurodegeneration. Neuron. 83 (2), 266-282 (2014).
- Liboska, R., Ligasova, A., Strunin, D., Rosenberg, I., Koberna, K. Most anti-BrdU antibodies react with 2'-deoxy-5-ethynyluridine -- the method for the effective suppression of this cross-reactivity. PLoS One. 7 (12), e51679 (2012).
- Biehs, R., et al. DNA double-strand break resection occurs during non-homologous end joining in G1 but is distinct from resection during homologous recombination. Mol Cell. 65 (4), 671-684.e5 (2017).
- Cruz-Garcia, A., Lopez-Saavedra, A., Huertas, P. BRCA1 accelerates CtIP-mediated DNA-end resection. Cell Rep. 9 (2), 451-459 (2014).
- Ercilla, A., et al. Physiological tolerance to ssDNA enables strand uncoupling during DNA replication. Cell Rep. 30 (7), 2416-2429.e7 (2020).
- Lezaja, A., et al. RPA shields inherited DNA lesions for post-mitotic DNA synthesis. Nat Commun. 12 (1), 3827 (2021).
- Mukherjee, B., Tomimatsu, N., Burma, S. Immunofluorescence-based methods to monitor DNA end resection. Methods Mol Biol. 1292, 67-75 (2015).
- Ochs, F., et al. 53BP1 fosters fidelity of homology-directed DNA repair. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 714-721 (2016).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Forment, J. V., Walker, R. V., Jackson, S. P. A high-throughput, flow cytometry-based method to quantify DNA-end resection in mammalian cells. Cytometry A. 81 (10), 922-928 (2012).
- Mistrik, M., et al. Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique. Sci Rep. 6, 19567 (2016).
- Aten, J. A., Bakker, P. J., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. Histochem J. 24 (5), 251-259 (1992).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-phase labeling of dividing stem cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. Cell proliferation method: click chemistry based on BrdU coupling for multiplex antibody staining. Curr Protoc Cytom. Chapter 7, Unit7.34 (2008).
- Ligasova, A., Koberna, K. Strengths and weaknesses of cell synchronization protocols based on inhibition of DNA synthesis. Int J Mol Sci. 22 (19), 10759 (2021).
