Inbäddning av vuxna Drosophila-huvuden i paraffin: Förbereda vävnad för histologi

Overview

Den här videon beskriver hur man bäddar in Drosophila-huvuden i paraffin med hjälp av kragemetoden, en teknik som förbereder flughuvuden för seriell sektionering. Paraffinsektioner används för histologiska undersökningar av hjärnans anatomi och för bedömning av neurodegeneration. Det presenterade protokollet visar hur flera flugor kan bearbetas i en förberedelse, vilket ökar tidseffektiviteten och minimerar experimentella artefakter.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Sunderhaus och Kretzschmar, Mass Histology för att kvantifiera neurodegeneration i Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Fixering av huvudet på krage och inbäddning i paraffin

OBS: Alla steg i fixeringsprocessen bör göras i en rökhuv. Metylbensoat, även om det inte utgör en hälsorisk, har en mycket distinkt lukt, vilket kan vara överväldigande om det inte hanteras i en rökhuva.

1. Innan du bedövar flugorna, gör upp 50 ml Carnoy-lösning genom att tillsätta 15 ml kloroform och 5 ml glacial ättiksyra till 30 ml 99% etanol (blanda inte kloroform och ättiksyra). Häll den i en glasbehållare med en platt botten, till exempel en kristalliserande skål, för att säkerställa att kragen kan ligga platt och är helt täckt av lösningen.
2. Söv flugorna med CO_{2 eller} eter.
3. Gängflugor (upp till 20 med de flesta kragen) i nacken i kragen med tång. Kom ihåg att rikta alla huvuden i samma riktning, som i figur 1A, och var försiktig så att inga skador uppstår på huvudet eller ögonen.
4. Inkludera sinusockulisflugor (pilar, figur 1A) på slumpmässiga positioner så att flugornas ordning lätt kan identifieras i avsnitten. Dessutom, om de experimentella flugorna har en ljus eller vit ögonfärg, trä några rödögda flugor, såsom vild typ, mellan dem för att säkerställa att det finns tillräckligt med pigment för att färga bilden. Registrera flugornas ordning på ett protokollblad tillsammans med kragens nummer om du använder mer än en krage.
5. När en krage är klar, placera den i den beredda Carnoy-lösningen i 3,5 - 4 h.
6. Dumpa Carnoy-lösningen i lämplig avfallshanteringsbehållare och påbörja etanoltvättarna. Se till att hälla långsamt för att inte störa placeringen av kragen i behållaren.
7. Tvätta kragen i 30 min i 99% etanol två gånger.
8. Tvätta kragen i 100% etanol i 1 timme. Var noga med att byta tvätt i tid för att förhindra överbetorkning.
9. Sätt halsbanden i metylbensoat O/N på RT. Försegla behållaren med parafilm för att förhindra avdunstning av metylbensoaten.
10. Häll metyllbenozatet i rätt engångsbehållare i rökhuven. Tillsätt en tidigare beredd blandning av 1:1 låg smältpunkt (56 - 57 °C) paraffinvax och metylbensoat. Från och med nu måste kragen hållas i en inkubator vid 65 °C för att se till att paraffinet inte härdas.
11. Häll ut metyllbenozate och paraffinblandningen i rätt engångsbehållare och häll smält rent paraffinvax, som hålls vid 65 °C, på kragen.
12. Byt paraffin efter 30 min och upprepa detta minst 5 gånger. Minst 6 - 8 tvättar bör utföras.
13. När tvättarna är klara placerar du kragen i en gummiisbricka med slitsar som är ungefär lika stora som kragen. Häll smält paraffin över dem tills de är helt täckta och låt det härda O / N (försök att undvika luftbubblor).
14. Ta bort paraffinblocken som innehåller kragen från isbitsbrickan. Separera paraffinblocket från kragen med ett rakblad och bryt försiktigt av kragen. Huvudena kommer att vara i paraffinblocket medan kropparna kommer att stanna i kragen. Blocken kan förvaras i rumstemperatur.
15. För att rengöra kragen, blötlägg dem i ett avparafiniseringsmedel vid 65 °C för att ta bort paraffin, rengör med lätt skrubbning och tvätta i etanol innan du återanvänder.

Representative Results

Figur 1: Paraffin seriella avsnitt. A) Med hjälp av kragemetoden kan experimentella flugor och kontrollflugor bearbetas som ett prov genom att gänga dem på en krage. Ögonlösa sinusockulisflugor sätts in för orientering (pilar). B) Schematiskt som visar flughuvudens orientering i kragen. C) I den här bilden är sektioner från olika flughuvuden orienterade från vänster till höger på bilden. Från topp till botten på bilden kan seriella sektioner från samma flughuvud ses. I det här fallet sattes en sinus oculisfluga in vid position tre (pil). Sektionerna färgas av det fluorescerande ögonpigmentet som sköljer över sektionerna efter skärning. Skalstreck i A = 5 mm och i C = 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath